探讨微囊微环境对HepG2细胞氧化应激基因表达影响及外源性抗氧化物质干预效果。采用静电液滴法制备微囊化细胞,real-time PCR法检测不同培养方式下血红素加氧酶-1(HO-1)和谷胱甘肽转硫酶-A1(GST-A1)表达;通过MTT法检测细胞活性、ELISA法检测白蛋白含量,比较还原型谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预后指标变化。结果显示,培养第6 d和第16 d时,微囊细胞中HO-1基因表达水平分别为同天数下平面细胞的4.9倍和3.1倍,GST-A1表达分别为平面细胞的11.2倍和33倍(P＜0.05);添加5~10 mmol/L NAC后,微囊化细胞活性较对照组增加40%~70%,白蛋白水平增加20%~30%(P＜0.05),而GSH在10 mmol/L时可使囊内细胞活性增加20%~55%,白蛋白水平增加15%(P＜0.05)。结果提示微囊内存在氧化应激因素诱导基因表达改变,NAC和GSH能缓解其对细胞的抑制作用。
引用本文： 肖静, 张英, 于玮婷, 王为, 马小军. 微囊化对HepG2细胞氧化应激基因表达影响及调控研究. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(2): 373-378. doi: 10.7507/1001-5515.20140070 复制
引言
细胞微囊化是将细胞包埋在具半透膜性质的微囊膜内并保持其活性的过程，囊内细胞呈三维立体多细胞聚集生长，更接近在体组织特性，在异体移植[1]、大规模培养[2]、药物控释筛选[3]等领域广泛应用。但微囊化细胞依然存在囊内细胞坏死、增殖速率降低、生长延迟期增加等问题。这些问题的解决依赖于对微囊环境及囊内细胞行为的充分认识。
近年来，虽然研究者们从物质传递方面对微囊环境进行了探索，对微囊化细胞代谢规律有了初步认识，但因微囊微环境的复杂性而使结果相对局限。现在研究发现，除了物质传递因素外，微囊化过程中还存在多种“胁迫”应激因素，如热“胁迫”、氧化“胁迫”、渗透压“胁迫”等，这些应激因素可通过诱导基因表达和相关信号传递，调控囊内细胞生长和功能[4-7]。但目前相关研究多建立于微生物模型如微囊化酵母细胞，在动物细胞微囊化中的研究少见报道。而事实上微生物生长代谢规律有异于哺乳动物细胞，且动物细胞对外界环境变化更为敏感。如我实验室发现，微囊化HepG2细胞渗透压相关应激基因表达增高，并出现代谢通量改变[6]。鉴于微囊中影响因素众多，是否还有其他应激基因表达改变并对细胞生长发挥调控作用尚不可知，因此有必要以微囊化动物细胞为模型，对微囊微环境以及相关应激反应进行考察，以便为微囊化技术改进和应用提供更多数据。
鉴于以上情况，本文选择以HepG2为模型,以平面细胞为参照,考察微囊化对氧化应激相关的血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)和谷胱甘肽转硫酶-A1 (glutathione S-transferases-A1,GST-A1)基因表达的影响，同时添加抗氧化物质即还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)进行外源性干预，以了解囊内细胞生存状态，为优化微囊化细胞培养提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验用人肝癌细胞株HepG2购自ATCC，海藻酸钠、聚赖氨酸、胰蛋白酶、Hoechst 33258、还原型谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸购自Sigma公司，白蛋白检测试剂盒购自Bethyl公司，Trizol裂解液、RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司，MEM培养液购自Hyclone公司，胎牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所，其他试剂均为国产分析纯。实验仪器包括YD-4型微胶囊静电液滴发生器(中国科学院大连化学物理研究所)、CX31数码图像采集系统(日本Olympus公司)、PCR 仪(德国Eppendorf公司)、微量紫外定量分析仪(日本NanoDrop公司)、全自动酶标仪(芬兰Labsystems公司)和LS55荧光分光光度计(英国PerkinElmer公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
平面细胞：HepG2细胞用MEM培养液(15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、1 mmol/L丙酮酸钠)5% CO2细胞培养箱中常规培养。微囊化细胞：细胞生长至对数期，用0.25%胰酶消化离心收集，悬浮于1.5% (w/v)海藻酸钠溶液，细胞密度2×109 /L。利用微囊静电液滴发生器喷入0.1 mol/L CaCl2溶液形成海藻酸钙胶珠，电压400 V，频率0.05 Hz，脉宽2 ms，然后用0.05% (w/v)多聚赖氨酸包裹，再与0.15% (w/v)海藻酸钠溶液反应，最后用55 mmol/L柠檬酸钠溶液液化，微囊直径为(300±50) μm。获得微囊化HepG2细胞37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
1.2.2 细胞形态学观察
用相差显微镜观察微囊化细胞生长状态。
1.2.3 MTT法测定细胞活性
平面细胞：待测孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL，PBS 溶液配制，4 ℃避光保存)，37 ℃培养4 h，镜下观察有不溶性甲臜颗粒生成，弃上清加入200 μL DMSO溶解结晶。微囊化细胞：待测孔加入100 μL MTT 溶液，37 ℃ 孵育24 h 后筛网过滤收集微囊，溶于1 mL DMSO 溶液。检测时吸取平面细胞或微囊化细胞紫色DMSO溶解上清液100 μL，置酶标仪测定每孔OD 值，测定波长570 nm，参考波长620 nm。
1.2.4 DNA分析法测定细胞数量
平面细胞胰酶消化后用含proteinase K裂解液50 ℃孵育12 h，释放DNA；微囊化细胞用PBS清洗破囊，加入含proteinase K裂解液释放DNA。加入荧光染料Hoechst 33258，测定荧光光度值变化(Ex=355 nm，Em=460 nm)，根据细胞数和DNA荧光光度标准曲线确定细胞数。
1.2.5 ELISA检测白蛋白分泌水平
白蛋白检测依试剂说明书，每检测孔加100 μL样品或标准品，用酶标仪测定450 nm的吸光度值。
1.2.6 NAC和GSH对细胞生长和蛋白合成影响
分别配置含有不同浓度NAC (1、2、5、10 mmol/L) 和GSH (1、2、5、10 mmol/L) 的培养液，培养微囊化细胞或平面细胞。于培养不同时间留取上清，检测白蛋白含量，MTT法测定细胞活性，DNA分析法测定细胞数量。
1.2.7 real time-PCR检测基因表达
提取细胞总RNA，两步法反转录和实时PCR，反转录条件37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s；实时PCR条件：预变性95 ℃ 30 s，PCR反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，扩增40个循环，引物设计如表 1所示。
表1
基因引物设计
Table1.
Prime sequences of different gene detected by PCR
1.3 统计学分析
实验所涉及数据用
2 结果
2.1 微囊化细胞生长情况
如图 1中所示，微囊化细胞在制备初期生长相对缓慢,且以数个分散细胞团的方式进行聚团，逐渐汇集。随着培养时间延长，逐渐形成大小不同的细胞聚集体，并向微囊中心迁移，到培养第13 d细胞团大小达到100 μm左右，并在培养第23 d时聚集成较大细胞团，占据大部分囊内空间。
图1
微囊化HepG2细胞生长方式
Figure1.
The growth profile of microencapsulated HepG2 cells
2.2 微囊化培养对氧化应激基因表达影响
培养第6 d和第16 d时，微囊化细胞HO-1表达水平分别为平面细胞的4.9倍和3.1倍，而GST-A1表达水平则为同天数下平面细胞的11.2和33倍，由结果可知，两种氧化应激基因的表达均在微囊内出现了显著增高(P＜0.05)。
2.3 NAC和GSH对不同培养方式下HepG2活性及白蛋白分泌的影响
针对以上实验结果，向培养液中分别添加NAC和GSH，以考察不同抗氧化物质对HepG2细胞生长及功能产物白蛋白分泌的影响。
NAC是一种含巯基小分子氨基酸衍生物，作为谷胱甘肽合成前体进入细胞，经脱乙酰基促进GSH合成。GSH是胞内主要抗氧化物质，主要通过其巯基结构稳定生物大分子功能以降低活性氧攻击造成的损伤，具有抗氧化以及干扰和清除自由基生成等作用，是调节胞内氧化还原状态的关键。添加NAC后，平面细胞结果如表 2所示。NAC在1 ~10 mmol/L浓度范围内对平面细胞活性并无显著提升，虽然在培养后期10 mmol/L NAC能使HepG2细胞活性出现小幅度上升，但差异并无统计学意义。同时也未发现平面细胞NAC各浓度组白蛋白水平显著变化，说明NAC的添加对平面培养下HepG2细胞的活性和功能产物分泌均无显著效果。但如表 3所示，对于微囊化细胞，NAC浓度在5~10 mmol/L时使细胞活性出现增高，从第3 d开始，细胞活性上升了40%~70%(P＜0.05)。与此结果类似，从第5 d开始5~10 mmol/L NAC使微囊化细胞白蛋白水平增加约20%~30%(P＜0.05)，且随培养时间延长，趋势更为明显。
表2
NAC对平面HepG2细胞增殖和白蛋白水平的影响
Table2.
Effect of NAC on proliferation and albumin level of monolayer HepG2 cells
表3
NAC对微囊HepG2细胞增殖和白蛋白水平的影响
Table3.
Effect of NAC on proliferation and albumin level of microencapsualted HepG2 cells
与NAC结果一致的是，由表 4可知，在平面细胞中GSH对细胞活性和白蛋白分泌同样无显著效果。而在微囊中(见表 5)，自第5 d起囊内细胞活性增加20%~55%，白蛋白水平增加15%~40%，但这种改善效果仅在10 mmol/L 时具有统计学意义(P＜0.05)。
表4
GSH对平面HepG2细胞增殖和白蛋白水平的影响
Table4.
Effect of GSH on proliferation and albumin level of monolayer HepG2 cells
表5
GSH对微囊HepG2细胞增殖和白蛋白水平的影响
Table5.
Effect of GSH on proliferation and albumin level of microencapsualted HepG2 cells
3 讨论
随着生物技术和膜技术研究不断深入,微胶囊已在固定化培养、药物控释筛选、人工器官及基因运载等领域广泛应用。但微囊微环境对囊内细胞影响机制尚不清楚，制约了该技术的改进和应用。近年研究结果显示，微囊化细胞特殊行为可能是囊内多种应激胁迫因素作用的结果，但其中涉及的作用方式和机制尚不清晰[4]，为此，我们选择了与氧化应激相关的HO-1和GST-A1基因进行研究，考察其在囊内表达变化，以便为相关机制研究提供实验依据。
HO-1是广泛存在的抗氧化防御酶，在缺氧、热休克、过氧化氢等诱导的氧化应激反应中表达上调，以加强细胞对氧化应激的抵抗性[7]。而GST-A1则是GST超家族中一员，其编码蛋白参与催化GSH巯基反应。GST-A1通过抑制微粒体过氧化、修复自由基膜磷脂损伤等途径，解除氧化应激诱变剂损伤效果，是Nrf2/ARE下游重要抗氧化应激分子[8]。
实验中发现，以上基因在微囊化细胞中均出现表达增高，表明囊内存在氧化应激因素，其产生原因可能来自以下几个。首先是微囊制作过程中存在的高压脉冲静电场和Ca2+的冲击。高压静电可使H2O分解，其中OH-在电场作用下被水中O2获得形成超氧负离子。同时，电场也会直接破坏胞膜两侧电荷平衡，提高胞内过氧化氢和超氧负离子含量，氧化胞膜上的不饱和脂肪酸，使其产生相变而降低膜流动性，从而激发胞内氧化应激反应[9]。而微囊钙化过程中的Ca2+可提高黄嘌呤氧化酶活性，一方面促进烷自由基向脂质过氧化物的转换得以继续，产生新的自由基，另一方面促进OH-转化，重新激发自由基连锁反应，造成瀑布式的氧化应激应答，而 Ca2+内流在线粒体内聚集同样会造成黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性复合物途径被过度利用，诱发氧化应激[10]。因此在以上因素影响下，微囊化细胞抗氧化应激基因表达出现上调，其主要目的是保护细胞，启动氧化应激防御以减轻细胞损伤。
其次，除了微囊制备条件影响外，HO-1和GST-A1的表达改变还可能是囊内细胞三维生长方式影响的结果。Brian等发现三维细胞球中HO-1表达高出平面细胞13倍以上[7]，而Chang等[8]在旋转反应器培养的细胞球中也发现了GST-A1的表达上调。研究者们认为，这一方面与细胞间接触和紧密结构的形成有关，另一方面也是细胞在底物和氧气缺乏下的生长维持需要[7-8]。考虑到微囊结构对物质扩散的影响[4]，HO-1和GST-A1表达上调可能也与囊内细胞在物质扩散受限条件下的生存维持有关。
针对以上结果，我们在培养液中添加两种抗氧化物NAC和GSH，以考察其作为外源性调控因子在微囊化条件培养中的应用价值。GSH和NAC能够改善氧化应激状态下的细胞功能，可通过清除自由基维持细胞氧化还原平衡，抑制活性氧致突变性，并可作用于信号转导过程，调整细胞因子生成释放，调节DNA修复，保护细胞正常生长和增殖[11]。以往研究显示，在肝衰血清中加入NAC和GSH，不但对细胞无生物毒性，相反可改善细胞增殖活力，增加对安定的清除能力[11]。且NAC处理细胞后，能降低重金属造成的氧化应激性损伤，抑制线粒体膜电势崩塌以及细胞色素C的释放，降低细胞凋亡应答[12]。从我们的实验结果可知，在微囊化细胞培养过程中添加NAC和GSH，一定程度上起到了降低细胞氧化性损伤的作用，从而保存了细胞活力和功能。另外，本研究显示，与GSH相比，NAC可使细胞在微囊环境下具有相对较好的活力状态，且在提高白蛋白水平方面，GSH效果也不如NAC明显。这可能是由于NAC可减少炎性细胞因子、趋化因子产生[12]，间接改善细胞状态，而且两者在分子量上的差异并因此造成的在微囊膜孔及囊内扩散率上的不同，可能也是造成NAC在调控效果上优于GSH原因。
4 结论
微囊内存在氧化应激因素，能诱导氧化应激基因HO-1和GST-A1表达增高；NAC和GSH能在一定程度上缓解此类应激环境对细胞活性的抑制作用，提高白蛋白合成。以上实验结果，将有助于了解微囊微环境对细胞生长代谢影响的具体机制，为微囊化技术改进和实际应用提供实验依据。
引言
细胞微囊化是将细胞包埋在具半透膜性质的微囊膜内并保持其活性的过程，囊内细胞呈三维立体多细胞聚集生长，更接近在体组织特性，在异体移植[1]、大规模培养[2]、药物控释筛选[3]等领域广泛应用。但微囊化细胞依然存在囊内细胞坏死、增殖速率降低、生长延迟期增加等问题。这些问题的解决依赖于对微囊环境及囊内细胞行为的充分认识。
近年来，虽然研究者们从物质传递方面对微囊环境进行了探索，对微囊化细胞代谢规律有了初步认识，但因微囊微环境的复杂性而使结果相对局限。现在研究发现，除了物质传递因素外，微囊化过程中还存在多种“胁迫”应激因素，如热“胁迫”、氧化“胁迫”、渗透压“胁迫”等，这些应激因素可通过诱导基因表达和相关信号传递，调控囊内细胞生长和功能[4-7]。但目前相关研究多建立于微生物模型如微囊化酵母细胞，在动物细胞微囊化中的研究少见报道。而事实上微生物生长代谢规律有异于哺乳动物细胞，且动物细胞对外界环境变化更为敏感。如我实验室发现，微囊化HepG2细胞渗透压相关应激基因表达增高，并出现代谢通量改变[6]。鉴于微囊中影响因素众多，是否还有其他应激基因表达改变并对细胞生长发挥调控作用尚不可知，因此有必要以微囊化动物细胞为模型，对微囊微环境以及相关应激反应进行考察，以便为微囊化技术改进和应用提供更多数据。
鉴于以上情况，本文选择以HepG2为模型,以平面细胞为参照,考察微囊化对氧化应激相关的血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)和谷胱甘肽转硫酶-A1 (glutathione S-transferases-A1,GST-A1)基因表达的影响，同时添加抗氧化物质即还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)进行外源性干预，以了解囊内细胞生存状态，为优化微囊化细胞培养提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验用人肝癌细胞株HepG2购自ATCC，海藻酸钠、聚赖氨酸、胰蛋白酶、Hoechst 33258、还原型谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸购自Sigma公司，白蛋白检测试剂盒购自Bethyl公司，Trizol裂解液、RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司，MEM培养液购自Hyclone公司，胎牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所，其他试剂均为国产分析纯。实验仪器包括YD-4型微胶囊静电液滴发生器(中国科学院大连化学物理研究所)、CX31数码图像采集系统(日本Olympus公司)、PCR 仪(德国Eppendorf公司)、微量紫外定量分析仪(日本NanoDrop公司)、全自动酶标仪(芬兰Labsystems公司)和LS55荧光分光光度计(英国PerkinElmer公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
平面细胞：HepG2细胞用MEM培养液(15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、1 mmol/L丙酮酸钠)5% CO2细胞培养箱中常规培养。微囊化细胞：细胞生长至对数期，用0.25%胰酶消化离心收集，悬浮于1.5% (w/v)海藻酸钠溶液，细胞密度2×109 /L。利用微囊静电液滴发生器喷入0.1 mol/L CaCl2溶液形成海藻酸钙胶珠，电压400 V，频率0.05 Hz，脉宽2 ms，然后用0.05% (w/v)多聚赖氨酸包裹，再与0.15% (w/v)海藻酸钠溶液反应，最后用55 mmol/L柠檬酸钠溶液液化，微囊直径为(300±50) μm。获得微囊化HepG2细胞37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
1.2.2 细胞形态学观察
用相差显微镜观察微囊化细胞生长状态。
1.2.3 MTT法测定细胞活性
平面细胞：待测孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL，PBS 溶液配制，4 ℃避光保存)，37 ℃培养4 h，镜下观察有不溶性甲臜颗粒生成，弃上清加入200 μL DMSO溶解结晶。微囊化细胞：待测孔加入100 μL MTT 溶液，37 ℃ 孵育24 h 后筛网过滤收集微囊，溶于1 mL DMSO 溶液。检测时吸取平面细胞或微囊化细胞紫色DMSO溶解上清液100 μL，置酶标仪测定每孔OD 值，测定波长570 nm，参考波长620 nm。
1.2.4 DNA分析法测定细胞数量
平面细胞胰酶消化后用含proteinase K裂解液50 ℃孵育12 h，释放DNA；微囊化细胞用PBS清洗破囊，加入含proteinase K裂解液释放DNA。加入荧光染料Hoechst 33258，测定荧光光度值变化(Ex=355 nm，Em=460 nm)，根据细胞数和DNA荧光光度标准曲线确定细胞数。
1.2.5 ELISA检测白蛋白分泌水平
白蛋白检测依试剂说明书，每检测孔加100 μL样品或标准品，用酶标仪测定450 nm的吸光度值。
1.2.6 NAC和GSH对细胞生长和蛋白合成影响
分别配置含有不同浓度NAC (1、2、5、10 mmol/L) 和GSH (1、2、5、10 mmol/L) 的培养液，培养微囊化细胞或平面细胞。于培养不同时间留取上清，检测白蛋白含量，MTT法测定细胞活性，DNA分析法测定细胞数量。
1.2.7 real time-PCR检测基因表达
提取细胞总RNA，两步法反转录和实时PCR，反转录条件37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s；实时PCR条件：预变性95 ℃ 30 s，PCR反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，扩增40个循环，引物设计如表 1所示。
表1
基因引物设计
Table1.
Prime sequences of different gene detected by PCR
1.3 统计学分析
实验所涉及数据用
2 结果
2.1 微囊化细胞生长情况
如图 1中所示，微囊化细胞在制备初期生长相对缓慢,且以数个分散细胞团的方式进行聚团，逐渐汇集。随着培养时间延长，逐渐形成大小不同的细胞聚集体，并向微囊中心迁移，到培养第13 d细胞团大小达到100 μm左右，并在培养第23 d时聚集成较大细胞团，占据大部分囊内空间。
图1
微囊化HepG2细胞生长方式
Figure1.
The growth profile of microencapsulated HepG2 cells
2.2 微囊化培养对氧化应激基因表达影响
培养第6 d和第16 d时，微囊化细胞HO-1表达水平分别为平面细胞的4.9倍和3.1倍，而GST-A1表达水平则为同天数下平面细胞的11.2和33倍，由结果可知，两种氧化应激基因的表达均在微囊内出现了显著增高(P＜0.05)。
2.3 NAC和GSH对不同培养方式下HepG2活性及白蛋白分泌的影响
针对以上实验结果，向培养液中分别添加NAC和GSH，以考察不同抗氧化物质对HepG2细胞生长及功能产物白蛋白分泌的影响。
NAC是一种含巯基小分子氨基酸衍生物，作为谷胱甘肽合成前体进入细胞，经脱乙酰基促进GSH合成。GSH是胞内主要抗氧化物质，主要通过其巯基结构稳定生物大分子功能以降低活性氧攻击造成的损伤，具有抗氧化以及干扰和清除自由基生成等作用，是调节胞内氧化还原状态的关键。添加NAC后，平面细胞结果如表 2所示。NAC在1 ~10 mmol/L浓度范围内对平面细胞活性并无显著提升，虽然在培养后期10 mmol/L NAC能使HepG2细胞活性出现小幅度上升，但差异并无统计学意义。同时也未发现平面细胞NAC各浓度组白蛋白水平显著变化，说明NAC的添加对平面培养下HepG2细胞的活性和功能产物分泌均无显著效果。但如表 3所示，对于微囊化细胞，NAC浓度在5~10 mmol/L时使细胞活性出现增高，从第3 d开始，细胞活性上升了40%~70%(P＜0.05)。与此结果类似，从第5 d开始5~10 mmol/L NAC使微囊化细胞白蛋白水平增加约20%~30%(P＜0.05)，且随培养时间延长，趋势更为明显。
表2
NAC对平面HepG2细胞增殖和白蛋白水平的影响
Table2.
Effect of NAC on proliferation and albumin level of monolayer HepG2 cells
表3
NAC对微囊HepG2细胞增殖和白蛋白水平的影响
Table3.
Effect of NAC on proliferation and albumin level of microencapsualted HepG2 cells
与NAC结果一致的是，由表 4可知，在平面细胞中GSH对细胞活性和白蛋白分泌同样无显著效果。而在微囊中(见表 5)，自第5 d起囊内细胞活性增加20%~55%，白蛋白水平增加15%~40%，但这种改善效果仅在10 mmol/L 时具有统计学意义(P＜0.05)。
表4
GSH对平面HepG2细胞增殖和白蛋白水平的影响
Table4.
Effect of GSH on proliferation and albumin level of monolayer HepG2 cells
表5
GSH对微囊HepG2细胞增殖和白蛋白水平的影响
Table5.
Effect of GSH on proliferation and albumin level of microencapsualted HepG2 cells
3 讨论
随着生物技术和膜技术研究不断深入,微胶囊已在固定化培养、药物控释筛选、人工器官及基因运载等领域广泛应用。但微囊微环境对囊内细胞影响机制尚不清楚，制约了该技术的改进和应用。近年研究结果显示，微囊化细胞特殊行为可能是囊内多种应激胁迫因素作用的结果，但其中涉及的作用方式和机制尚不清晰[4]，为此，我们选择了与氧化应激相关的HO-1和GST-A1基因进行研究，考察其在囊内表达变化，以便为相关机制研究提供实验依据。
HO-1是广泛存在的抗氧化防御酶，在缺氧、热休克、过氧化氢等诱导的氧化应激反应中表达上调，以加强细胞对氧化应激的抵抗性[7]。而GST-A1则是GST超家族中一员，其编码蛋白参与催化GSH巯基反应。GST-A1通过抑制微粒体过氧化、修复自由基膜磷脂损伤等途径，解除氧化应激诱变剂损伤效果，是Nrf2/ARE下游重要抗氧化应激分子[8]。
实验中发现，以上基因在微囊化细胞中均出现表达增高，表明囊内存在氧化应激因素，其产生原因可能来自以下几个。首先是微囊制作过程中存在的高压脉冲静电场和Ca2+的冲击。高压静电可使H2O分解，其中OH-在电场作用下被水中O2获得形成超氧负离子。同时，电场也会直接破坏胞膜两侧电荷平衡，提高胞内过氧化氢和超氧负离子含量，氧化胞膜上的不饱和脂肪酸，使其产生相变而降低膜流动性，从而激发胞内氧化应激反应[9]。而微囊钙化过程中的Ca2+可提高黄嘌呤氧化酶活性，一方面促进烷自由基向脂质过氧化物的转换得以继续，产生新的自由基，另一方面促进OH-转化，重新激发自由基连锁反应，造成瀑布式的氧化应激应答，而 Ca2+内流在线粒体内聚集同样会造成黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性复合物途径被过度利用，诱发氧化应激[10]。因此在以上因素影响下，微囊化细胞抗氧化应激基因表达出现上调，其主要目的是保护细胞，启动氧化应激防御以减轻细胞损伤。
其次，除了微囊制备条件影响外，HO-1和GST-A1的表达改变还可能是囊内细胞三维生长方式影响的结果。Brian等发现三维细胞球中HO-1表达高出平面细胞13倍以上[7]，而Chang等[8]在旋转反应器培养的细胞球中也发现了GST-A1的表达上调。研究者们认为，这一方面与细胞间接触和紧密结构的形成有关，另一方面也是细胞在底物和氧气缺乏下的生长维持需要[7-8]。考虑到微囊结构对物质扩散的影响[4]，HO-1和GST-A1表达上调可能也与囊内细胞在物质扩散受限条件下的生存维持有关。
针对以上结果，我们在培养液中添加两种抗氧化物NAC和GSH，以考察其作为外源性调控因子在微囊化条件培养中的应用价值。GSH和NAC能够改善氧化应激状态下的细胞功能，可通过清除自由基维持细胞氧化还原平衡，抑制活性氧致突变性，并可作用于信号转导过程，调整细胞因子生成释放，调节DNA修复，保护细胞正常生长和增殖[11]。以往研究显示，在肝衰血清中加入NAC和GSH，不但对细胞无生物毒性，相反可改善细胞增殖活力，增加对安定的清除能力[11]。且NAC处理细胞后，能降低重金属造成的氧化应激性损伤，抑制线粒体膜电势崩塌以及细胞色素C的释放，降低细胞凋亡应答[12]。从我们的实验结果可知，在微囊化细胞培养过程中添加NAC和GSH，一定程度上起到了降低细胞氧化性损伤的作用，从而保存了细胞活力和功能。另外，本研究显示，与GSH相比，NAC可使细胞在微囊环境下具有相对较好的活力状态，且在提高白蛋白水平方面，GSH效果也不如NAC明显。这可能是由于NAC可减少炎性细胞因子、趋化因子产生[12]，间接改善细胞状态，而且两者在分子量上的差异并因此造成的在微囊膜孔及囊内扩散率上的不同，可能也是造成NAC在调控效果上优于GSH原因。
4 结论
微囊内存在氧化应激因素，能诱导氧化应激基因HO-1和GST-A1表达增高；NAC和GSH能在一定程度上缓解此类应激环境对细胞活性的抑制作用，提高白蛋白合成。以上实验结果，将有助于了解微囊微环境对细胞生长代谢影响的具体机制，为微囊化技术改进和实际应用提供实验依据。
