骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为一种具有多向分化潜能的干细胞广泛地运用于组织再生工程中。在促BMSCs向心肌样细胞分化的过程中,我们探讨周期性双轴力学应变对其的影响。本实验分为三组:力学应变组,将大鼠BMSCs(rBMSCs)接种于硅胶膜上,施加应变大小10%、频率1 Hz力学应变,持续时间分别为6、12、24 h;空白对照组,将rBMSCs接种于硅胶膜上,用完全培养基培养;基底对照组,将rBMSCs接种于六孔板中,用完全培养基培养。两组对照组分别于力学应变组加力相同时间点收集样本。通过实时荧光定量PCR方法检测各组rBMSCs的GATA4和肌细胞特异性增强因子-2C(MEF-2C)的mRNA表达,并利用Western blot方法检测各组rBMSCs的缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达。本实验结果表明,不同持续加力时间的力学应变组的GATA4、MEF-2C的mRNA表达量以及Cx43的蛋白表达量比相应的空白对照组明显增高(P＜0.05)。本研究提示,体外周期性双轴力学应变可以促进rBMSCs向心肌样细胞分化,但其具体机制尚未明确。
引用本文： 况薇, 唐敏, 何学令, 吴文超, 刘小菁, 李良. 周期性拉伸应变对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(3): 596-600. doi: 10.7507/1001-5515.20140112 复制
引言
骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)存在于骨髓基质，是一类具有多向分化潜能的干细胞,在特定的条件下,可以分化为多种细胞系,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肌细胞、内皮细胞、神经细胞等[1-2]。实验室数据和最近的临床试验表明,干细胞疗法可以改善心脏功能和促进心肌再生[3]。由于心脏的持续搏动，心肌细胞一直处于力学环境中，力学刺激在心肌细胞的生长和成熟中扮演着重要的角色[4]。BMSCs是一种力学敏感性细胞，力学刺激对BMSCs的生长、分化也起着重要的作用[5]。本研究旨在探讨体外周期性双轴拉伸应变对大鼠BMSCs(rat BMSCs,rBMSCs)向心肌样细胞分化的影响， 为rBMSCs在体外向心肌样细胞定向分化提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物、主要仪器和试剂
1.1.1 实验动物
健康清洁雌性SpragueDawley大鼠(4~6周龄)，体重为100~150 g，由四川大学华西动物实验中心提供。
1.1.2 主要仪器和试剂
CO2细胞培养孵箱(SANYO公司)，CFX96TM Real-time PCR System(BIO-RAD公司),DMEM低糖培养基干粉(DMEM-LG基础培养基，Gibco公司),澳洲胎牛血清(FBS，Gibco公司)，Trizol Reagent(Invitrogen公司)，逆转录聚合酶链反应试剂盒(IScriptTM cDNA Synthesis Kit,BIO-RAD公司)，实时荧光定量PCR试剂盒(SsoFastTM EvaGreen@Supermix,BIO-RAD公司)，双抗(Penicillin-Streptomycin Solution,Hyclone公司)，缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)抗体(Santa公司),辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体(中杉金桥公司)。DMEM-LG完全培养基：DMEM-LG基础培养基+15%胎牛血清+1%双抗。
1.1.3 力学加载装置
本实验采用我们实验室(四川大学)自制的周期性双轴拉伸应变加载的细胞培养装置，示意图如图 1。
图1
加载周期性双轴力学应变的细胞培养装置示意图
Figure1.
Schematic diagram of biaxial strain device for cultured cells
1.2 rBMSCs的分离与培养
我们采用的本实验室常规全骨髓贴壁法分离rBMSCs[6]。首先采用断颈法把实验用SD大鼠处死，在无菌条件下迅速分离出股骨和胫骨。然后用组织剪将附着在骨上的软组织、筋膜和骨膜剔除干净，放于75%乙醇浸泡消毒。将骨置于盛有PBS的培养皿中漂洗，漂洗后去除两端骨骺，用10 mL注射器吸取10 mL的DMEM-LG基础培养基,针尖插入骨骺端，冲出腔内骨髓，直至发白。含有骨髓的培养基用15 mL离心管收集，再以900 r/min离心5 min。用吸管轻轻吸取弃掉上清，再加入DMEM-LG完全培养基。小心用吸管将沉底细胞吹散。细胞悬液用细胞计数板计数后按3×105/cm2的细胞密度接种于25 cm2培养瓶中，将培养瓶放置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养孵箱中培养。细胞的首次换液在接种后3 h，弃掉悬浮细胞，换液时小心吸液和加液，以后的72 h内每8 h换液一次。第4 d起，每3 d给细胞换液1 次。当细胞长到80%左右的融合状态时，用0.25%胰蛋白酶消化已贴壁细胞进行传代。本实验选用的是2~3代rBMSCs。接种前对细胞进行台盼蓝细胞活力计数，细胞活力均在98%以上。
1.3 实验分组
rBMSCs随机分为三组，分别为拉伸应变组、空白对照组和基底对照组。
1.3.1 拉伸应变组
将rBMSCs以3×104/cm2接种于硅胶膜上，DMEM-LG完全培养基培养，待完全贴膜、细胞长至融合状态后，利用本实验室周期性双轴力学应变加载的细胞培养装置进行加载，应变幅度大小为10%，加载频率为1 Hz，分别持续加载6、12、24 h的拉伸应变，加载后收取样本。
1.3.2 空白对照组
将rBMSCs以3×104/cm2接种于硅胶膜上，DMEM-LG完全培养基培养，细胞完全贴膜、长至融合状态时作为实验开始时间，对rBMSCs不进行任何处理，分别在6、12、24 h后收取样本(取样时间与力学应变组相同)。
1.3.3 基底对照组
将rBMSCs以3×104/cm2接种于六孔板，DMEM-LG完全培养基培养，细胞完全贴壁、长至融合状态时作为实验开始时间，对rBMSCs不进行任何处理，分别在6、12、24 h后收取样本(取样时间与力学应变组相同)。
1.4 检测指标
1.4.1 实时定量PCR法测定各组中GATA4、肌细胞特异性增强因子-2C(myocyte-specific enhancer factor,MEF-2C)的mRNA表达
依据Invitrogen公司提供的Trizol Reagent试剂说明书，分别在相对应的时间点提取各组rBMSCs的总mRNA。将提取的总mRNA利用1%琼脂糖凝胶电泳的方法，检测各组mRNA的完整性。判定各组mRNA的纯度，则用紫外分光光度计检测A260与A280的比值，然后计算出mRNA浓度。每组样品取1.5 μg的总mRNA来逆转录生成cDNA，根据浓度算出所需体积。依据BIO-RAD公司所提供的逆转录试剂盒使用说明书依次加入反应液及样本mRNA到EP管中。将EP管放入PCR仪中，设定逆转录反应程序参数，25 ℃ 5 min,42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，进行逆转录。生成的cDNA取1 μL作为模板进行实时荧光定量PCR，根据SsoFastTMEvaGreen@Supermix试剂盒说明书进行操作，反应体系10 μL。荧光定量PCR的反应参数：95 ℃变性10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，总共40 个循环。与此同时做溶解曲线分析。目的基因相对表达量通过内参基因表达量的校正，即用目的基因的测量值与内参GAPDH测量值的比值表示。内参GAPDH mRNA、GATA4 mRNA和MEF-2C mRNA的实时荧光定量PCR的引物序列如表 1所示。
表1
GAPDH mRNA、GATA4 mRNA、MEF-2C mRNA的实时荧光定量PCR的引物序列
Table1.
Primer sequences of the real-time PCR for GAPDH mRNA,GATA4 mRNA and MEF-2C mRNA
1.4.2 蛋白免疫印记实验(Western blot)检测Cx43的蛋白表达
在相对应的取样时间点，分别弃掉力学应变组、空白对照组和基底对照组的细胞培养液，用4 ℃预冷的PBS漂洗细胞3次，再加入适量RIPA蛋白裂解液，用细胞刮子刮下细胞，将含有细胞碎片的裂解液移至EP管中，在冰上裂解30 min，然后以12 000 r/min在4 ℃下离心8 min，小心吸取上清到新的EP管。利用BCA试剂盒对各组的总蛋白进行定量，检测蛋白样品浓度后，与适量的5× Loading buffer混匀煮沸变性8 min，－20 ℃保存待用。取30 μg蛋白质样品加入上样孔，经10% SDS-PAGE电泳分离后，将蛋白转移至PVDF膜上，含5%脱脂奶粉封闭液于37 ℃封闭2 h。分别加入1∶200的内参β-actin和1∶200的Cx43抗体的一抗稀释液，4 ℃孵育过夜。第2天用TBST漂洗3次，分别加入1∶5 000的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗的稀释液，37 ℃孵育2~3 h。再用TBST清洗3次，加入ECL显色液后，利用凝胶成像仪扫描检测蛋白条带。电泳条带的灰度值用Image Lab软件进行分析。
1.5 统计学分析
本实验均重复3次，所有数据均用统计软件SPSS 17.0处理。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行组间差别比较，组间两两比较采用Student-Newman-Keuls(SNK)方法。每组数据以均数±标准差(
2 结果
2.1 GATA4 mRNA的表达
如图 2所示，空白对照组与基底对照组各时间点rBMSCs的GATA4 mRNA表达量均无差异(P＞0.05)。加力持续时间6、12和24 h的拉伸应变组rBMSCs的GATA4 mRNA的表达量分别是相应空白对照组的2.54、2.43和3.94倍(P＜0.05)。
图2
各组rBMSCs的GATA4 mRNA、MEF-2C mRNA的相对表达量(*：与相应的空白对照组比较，
*:
2.2 MEF-2C mRNA的表达
如图 2所示，空白对照组与基底对照组各时间点rBMSCs的MEF-2C mRNA表达量均无明显差异(P＞0.05)。加力持续时间6、12和24 h的拉伸应变组rBMSCs的MEF-2C mRNA表达量分别是相应空白对照组的2.57、4.22和5.55倍(P＜0.05)。各拉伸应变组间比较，加力持续时间24 h组rBMSCs的MEF-2C mRNA表达最为明显，与6 h和12 h组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。
图3
各组rBMSCs的Cx43蛋白电泳条带及其相对表达量(M:力学应变组；C:空白对照组；B:基底对照组。*：与相对应的空白对照组相比，
M: the mechanical strain groups; C:the control groups; B:the blank groups. *: P＜
2.3 Cx43的蛋白表达量
如图 3所示，加力持续时间6、12和24 h的力学应变组rBMSCs的Cx43蛋白表达量分别为相应空白对照组的1.79、1.91和2.04倍(P＜0.05)；加力12 h和24 h组与6 h组之间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3 讨论
以心肌血供减少为特征的缺血性心脏病已经成为世界上主要的死亡原因，当它病程迁延，最终将发展成为心力衰竭[1-2]。治疗缺血性心脏病以及心力衰竭除了用药对症治疗、心脏移植之外，通过干细胞的植入实现心肌再生已经成为一种新的治疗策略。而植入心肌内进行再生治疗的干细胞有很多种，例如胚胎干细胞[7]、BMSCs[8]、脂肪间充质干细胞[9]等。
目前已有促BMSCs向心肌样细胞分化的方法，例如将rBMSCs与新生大鼠心室肌细胞共同培养，发现部分rBMSCs有心肌特异性蛋白TNNT2的阳性表达[10]；而化学试剂5-氮胞苷的处理也使BMSCs成功地表达了心肌相关的特异性基因[11]。但是，这些方法效率都不高，所以科学研究者正在努力寻求新的诱导方法来促BMSCs向心肌样细胞分化。
心脏作为机体的“泵”，是重要的动力器官，处于不断搏动的状态，所以心肌细胞时刻处于一个力、电、生物化学的微环境中。力学刺激对细胞的生长、增殖、分化等生物学行为有着重要的影响，BMSCs的分化也不例外。迄今为止，国内外就力学刺激促BMSCs向心肌细胞分化影响的相关报道还较少。Schmelter等[12]的实验表明小鼠胚胎干细胞源性的类胚体在经过2 h应变大小为10%的静态力学应变后，心肌特异性标志物α-actinin的表达量增加。Illi等[13]的研究发现经过10 dyn/cm2流体剪切应力处理培养的小鼠胚胎干细胞，其心肌相关基因MEF-2C的表达上调，预示了流体剪切力可能应用于体外促干细胞向心肌细胞分化。本实验室的前期实验也证明，利用低频脉冲电磁场以及双向脉冲电刺激能促rBMSCs向心肌样细胞分化[6, 14]。本实验想通过另外一些物理刺激手段比如力学刺激来诱导rBMSCs向心肌样细胞分化，进一步完善在体外促rBMSCs向心肌样细胞分化的实验诱导条件。
心肌早期发育的重要转录因子GATA4是一类具有锌指结构的转录因子，它是调节胚胎心脏发生和诱导心肌分化的重要基因之一。MEF-2C参与了心脏形态发生、肌细胞生成和血管的发展。Cx43是心肌细胞间闰盘的组成蛋白之一，在促进心肌细胞同步收缩以及细胞间信号传递过程中起着重要作用。所以本实验选取这三种指标来反映rBMSCs向心肌样细胞分化的情况。
对于心肌细胞来说,双轴牵拉应变可以更好地模拟心脏搏动的生理情况下心肌细胞的受力变化，与体内心肌受到的机械载荷比较相似。目前多数研究认为,应变大小为10%左右的拉伸应变对于心肌细胞属于正性刺激，而频率1 Hz与平常心脏跳动的节奏类似。Huang等[15]发现在频率为1 Hz、 应变大小为10%的单轴拉伸力学应变下，BMSCs心肌细胞特异性基因Nkx2.5表达明显增高。本实验所用力学应变加载装置是周期性双轴力学牵拉应变的细胞培养装置，能很好地模拟心脏搏动时细胞所受的力学刺激。我们采用应变幅度为10%、频率为1 Hz的双轴周期性拉伸应变，持续加载时间分别为6、12和24 h。实验结果显示，力学应变加载后其心肌特异性基因GATA4和MEF-2C的表达明显高于相应的对照组(P＜0.05)，其中MEF-2C的相对表达量在加力持续时间24 h组增高最为明显；力学应变加载后力学应变组Cx43蛋白表达量明显高于相应对照组，而且加载持续时间12 h和24 h组Cx43蛋白较6 h组明显增高。本实验得出结论：在体外周期性双轴力学应变能促进rBMSCs向心肌样细胞分化，而比较好的加载参数为力学应变幅度大小10%、加载频率1 Hz和持续加载时间24 h，但是力学应变促其分化的机制尚不明确，与其他如电、生化等相关诱导因素联合作用的效应也还未知，有待我们进一步研究。
引言
骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)存在于骨髓基质，是一类具有多向分化潜能的干细胞,在特定的条件下,可以分化为多种细胞系,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肌细胞、内皮细胞、神经细胞等[1-2]。实验室数据和最近的临床试验表明,干细胞疗法可以改善心脏功能和促进心肌再生[3]。由于心脏的持续搏动，心肌细胞一直处于力学环境中，力学刺激在心肌细胞的生长和成熟中扮演着重要的角色[4]。BMSCs是一种力学敏感性细胞，力学刺激对BMSCs的生长、分化也起着重要的作用[5]。本研究旨在探讨体外周期性双轴拉伸应变对大鼠BMSCs(rat BMSCs,rBMSCs)向心肌样细胞分化的影响， 为rBMSCs在体外向心肌样细胞定向分化提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物、主要仪器和试剂
1.1.1 实验动物
健康清洁雌性SpragueDawley大鼠(4~6周龄)，体重为100~150 g，由四川大学华西动物实验中心提供。
1.1.2 主要仪器和试剂
CO2细胞培养孵箱(SANYO公司)，CFX96TM Real-time PCR System(BIO-RAD公司),DMEM低糖培养基干粉(DMEM-LG基础培养基，Gibco公司),澳洲胎牛血清(FBS，Gibco公司)，Trizol Reagent(Invitrogen公司)，逆转录聚合酶链反应试剂盒(IScriptTM cDNA Synthesis Kit,BIO-RAD公司)，实时荧光定量PCR试剂盒(SsoFastTM EvaGreen@Supermix,BIO-RAD公司)，双抗(Penicillin-Streptomycin Solution,Hyclone公司)，缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)抗体(Santa公司),辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体(中杉金桥公司)。DMEM-LG完全培养基：DMEM-LG基础培养基+15%胎牛血清+1%双抗。
1.1.3 力学加载装置
本实验采用我们实验室(四川大学)自制的周期性双轴拉伸应变加载的细胞培养装置，示意图如图 1。
图1
加载周期性双轴力学应变的细胞培养装置示意图
Figure1.
Schematic diagram of biaxial strain device for cultured cells
1.2 rBMSCs的分离与培养
我们采用的本实验室常规全骨髓贴壁法分离rBMSCs[6]。首先采用断颈法把实验用SD大鼠处死，在无菌条件下迅速分离出股骨和胫骨。然后用组织剪将附着在骨上的软组织、筋膜和骨膜剔除干净，放于75%乙醇浸泡消毒。将骨置于盛有PBS的培养皿中漂洗，漂洗后去除两端骨骺，用10 mL注射器吸取10 mL的DMEM-LG基础培养基,针尖插入骨骺端，冲出腔内骨髓，直至发白。含有骨髓的培养基用15 mL离心管收集，再以900 r/min离心5 min。用吸管轻轻吸取弃掉上清，再加入DMEM-LG完全培养基。小心用吸管将沉底细胞吹散。细胞悬液用细胞计数板计数后按3×105/cm2的细胞密度接种于25 cm2培养瓶中，将培养瓶放置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养孵箱中培养。细胞的首次换液在接种后3 h，弃掉悬浮细胞，换液时小心吸液和加液，以后的72 h内每8 h换液一次。第4 d起，每3 d给细胞换液1 次。当细胞长到80%左右的融合状态时，用0.25%胰蛋白酶消化已贴壁细胞进行传代。本实验选用的是2~3代rBMSCs。接种前对细胞进行台盼蓝细胞活力计数，细胞活力均在98%以上。
1.3 实验分组
rBMSCs随机分为三组，分别为拉伸应变组、空白对照组和基底对照组。
1.3.1 拉伸应变组
将rBMSCs以3×104/cm2接种于硅胶膜上，DMEM-LG完全培养基培养，待完全贴膜、细胞长至融合状态后，利用本实验室周期性双轴力学应变加载的细胞培养装置进行加载，应变幅度大小为10%，加载频率为1 Hz，分别持续加载6、12、24 h的拉伸应变，加载后收取样本。
1.3.2 空白对照组
将rBMSCs以3×104/cm2接种于硅胶膜上，DMEM-LG完全培养基培养，细胞完全贴膜、长至融合状态时作为实验开始时间，对rBMSCs不进行任何处理，分别在6、12、24 h后收取样本(取样时间与力学应变组相同)。
1.3.3 基底对照组
将rBMSCs以3×104/cm2接种于六孔板，DMEM-LG完全培养基培养，细胞完全贴壁、长至融合状态时作为实验开始时间，对rBMSCs不进行任何处理，分别在6、12、24 h后收取样本(取样时间与力学应变组相同)。
1.4 检测指标
1.4.1 实时定量PCR法测定各组中GATA4、肌细胞特异性增强因子-2C(myocyte-specific enhancer factor,MEF-2C)的mRNA表达
依据Invitrogen公司提供的Trizol Reagent试剂说明书，分别在相对应的时间点提取各组rBMSCs的总mRNA。将提取的总mRNA利用1%琼脂糖凝胶电泳的方法，检测各组mRNA的完整性。判定各组mRNA的纯度，则用紫外分光光度计检测A260与A280的比值，然后计算出mRNA浓度。每组样品取1.5 μg的总mRNA来逆转录生成cDNA，根据浓度算出所需体积。依据BIO-RAD公司所提供的逆转录试剂盒使用说明书依次加入反应液及样本mRNA到EP管中。将EP管放入PCR仪中，设定逆转录反应程序参数，25 ℃ 5 min,42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，进行逆转录。生成的cDNA取1 μL作为模板进行实时荧光定量PCR，根据SsoFastTMEvaGreen@Supermix试剂盒说明书进行操作，反应体系10 μL。荧光定量PCR的反应参数：95 ℃变性10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，总共40 个循环。与此同时做溶解曲线分析。目的基因相对表达量通过内参基因表达量的校正，即用目的基因的测量值与内参GAPDH测量值的比值表示。内参GAPDH mRNA、GATA4 mRNA和MEF-2C mRNA的实时荧光定量PCR的引物序列如表 1所示。
表1
GAPDH mRNA、GATA4 mRNA、MEF-2C mRNA的实时荧光定量PCR的引物序列
Table1.
Primer sequences of the real-time PCR for GAPDH mRNA,GATA4 mRNA and MEF-2C mRNA
1.4.2 蛋白免疫印记实验(Western blot)检测Cx43的蛋白表达
在相对应的取样时间点，分别弃掉力学应变组、空白对照组和基底对照组的细胞培养液，用4 ℃预冷的PBS漂洗细胞3次，再加入适量RIPA蛋白裂解液，用细胞刮子刮下细胞，将含有细胞碎片的裂解液移至EP管中，在冰上裂解30 min，然后以12 000 r/min在4 ℃下离心8 min，小心吸取上清到新的EP管。利用BCA试剂盒对各组的总蛋白进行定量，检测蛋白样品浓度后，与适量的5× Loading buffer混匀煮沸变性8 min，－20 ℃保存待用。取30 μg蛋白质样品加入上样孔，经10% SDS-PAGE电泳分离后，将蛋白转移至PVDF膜上，含5%脱脂奶粉封闭液于37 ℃封闭2 h。分别加入1∶200的内参β-actin和1∶200的Cx43抗体的一抗稀释液，4 ℃孵育过夜。第2天用TBST漂洗3次，分别加入1∶5 000的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗的稀释液，37 ℃孵育2~3 h。再用TBST清洗3次，加入ECL显色液后，利用凝胶成像仪扫描检测蛋白条带。电泳条带的灰度值用Image Lab软件进行分析。
1.5 统计学分析
本实验均重复3次，所有数据均用统计软件SPSS 17.0处理。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行组间差别比较，组间两两比较采用Student-Newman-Keuls(SNK)方法。每组数据以均数±标准差(
2 结果
2.1 GATA4 mRNA的表达
如图 2所示，空白对照组与基底对照组各时间点rBMSCs的GATA4 mRNA表达量均无差异(P＞0.05)。加力持续时间6、12和24 h的拉伸应变组rBMSCs的GATA4 mRNA的表达量分别是相应空白对照组的2.54、2.43和3.94倍(P＜0.05)。
图2
各组rBMSCs的GATA4 mRNA、MEF-2C mRNA的相对表达量(*：与相应的空白对照组比较，
*:
2.2 MEF-2C mRNA的表达
如图 2所示，空白对照组与基底对照组各时间点rBMSCs的MEF-2C mRNA表达量均无明显差异(P＞0.05)。加力持续时间6、12和24 h的拉伸应变组rBMSCs的MEF-2C mRNA表达量分别是相应空白对照组的2.57、4.22和5.55倍(P＜0.05)。各拉伸应变组间比较，加力持续时间24 h组rBMSCs的MEF-2C mRNA表达最为明显，与6 h和12 h组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。
图3
各组rBMSCs的Cx43蛋白电泳条带及其相对表达量(M:力学应变组；C:空白对照组；B:基底对照组。*：与相对应的空白对照组相比，
M: the mechanical strain groups; C:the control groups; B:the blank groups. *: P＜
2.3 Cx43的蛋白表达量
如图 3所示，加力持续时间6、12和24 h的力学应变组rBMSCs的Cx43蛋白表达量分别为相应空白对照组的1.79、1.91和2.04倍(P＜0.05)；加力12 h和24 h组与6 h组之间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3 讨论
以心肌血供减少为特征的缺血性心脏病已经成为世界上主要的死亡原因，当它病程迁延，最终将发展成为心力衰竭[1-2]。治疗缺血性心脏病以及心力衰竭除了用药对症治疗、心脏移植之外，通过干细胞的植入实现心肌再生已经成为一种新的治疗策略。而植入心肌内进行再生治疗的干细胞有很多种，例如胚胎干细胞[7]、BMSCs[8]、脂肪间充质干细胞[9]等。
目前已有促BMSCs向心肌样细胞分化的方法，例如将rBMSCs与新生大鼠心室肌细胞共同培养，发现部分rBMSCs有心肌特异性蛋白TNNT2的阳性表达[10]；而化学试剂5-氮胞苷的处理也使BMSCs成功地表达了心肌相关的特异性基因[11]。但是，这些方法效率都不高，所以科学研究者正在努力寻求新的诱导方法来促BMSCs向心肌样细胞分化。
心脏作为机体的“泵”，是重要的动力器官，处于不断搏动的状态，所以心肌细胞时刻处于一个力、电、生物化学的微环境中。力学刺激对细胞的生长、增殖、分化等生物学行为有着重要的影响，BMSCs的分化也不例外。迄今为止，国内外就力学刺激促BMSCs向心肌细胞分化影响的相关报道还较少。Schmelter等[12]的实验表明小鼠胚胎干细胞源性的类胚体在经过2 h应变大小为10%的静态力学应变后，心肌特异性标志物α-actinin的表达量增加。Illi等[13]的研究发现经过10 dyn/cm2流体剪切应力处理培养的小鼠胚胎干细胞，其心肌相关基因MEF-2C的表达上调，预示了流体剪切力可能应用于体外促干细胞向心肌细胞分化。本实验室的前期实验也证明，利用低频脉冲电磁场以及双向脉冲电刺激能促rBMSCs向心肌样细胞分化[6, 14]。本实验想通过另外一些物理刺激手段比如力学刺激来诱导rBMSCs向心肌样细胞分化，进一步完善在体外促rBMSCs向心肌样细胞分化的实验诱导条件。
心肌早期发育的重要转录因子GATA4是一类具有锌指结构的转录因子，它是调节胚胎心脏发生和诱导心肌分化的重要基因之一。MEF-2C参与了心脏形态发生、肌细胞生成和血管的发展。Cx43是心肌细胞间闰盘的组成蛋白之一，在促进心肌细胞同步收缩以及细胞间信号传递过程中起着重要作用。所以本实验选取这三种指标来反映rBMSCs向心肌样细胞分化的情况。
对于心肌细胞来说,双轴牵拉应变可以更好地模拟心脏搏动的生理情况下心肌细胞的受力变化，与体内心肌受到的机械载荷比较相似。目前多数研究认为,应变大小为10%左右的拉伸应变对于心肌细胞属于正性刺激，而频率1 Hz与平常心脏跳动的节奏类似。Huang等[15]发现在频率为1 Hz、 应变大小为10%的单轴拉伸力学应变下，BMSCs心肌细胞特异性基因Nkx2.5表达明显增高。本实验所用力学应变加载装置是周期性双轴力学牵拉应变的细胞培养装置，能很好地模拟心脏搏动时细胞所受的力学刺激。我们采用应变幅度为10%、频率为1 Hz的双轴周期性拉伸应变，持续加载时间分别为6、12和24 h。实验结果显示，力学应变加载后其心肌特异性基因GATA4和MEF-2C的表达明显高于相应的对照组(P＜0.05)，其中MEF-2C的相对表达量在加力持续时间24 h组增高最为明显；力学应变加载后力学应变组Cx43蛋白表达量明显高于相应对照组，而且加载持续时间12 h和24 h组Cx43蛋白较6 h组明显增高。本实验得出结论：在体外周期性双轴力学应变能促进rBMSCs向心肌样细胞分化，而比较好的加载参数为力学应变幅度大小10%、加载频率1 Hz和持续加载时间24 h，但是力学应变促其分化的机制尚不明确，与其他如电、生化等相关诱导因素联合作用的效应也还未知，有待我们进一步研究。
