本研究探讨海藻酸钠-多聚鸟氨酸-海藻酸(A-PLO-A)和海藻酸钡-多聚鸟氨酸-海藻酸(B-PLO-A)两种新型微囊作为细胞移植载体的效果。两种微囊包裹小鼠肝细胞后,植入D-氨基半乳糖腹腔注射法制备的急性肝衰竭模型大鼠体内,观察大鼠死亡率,检测微囊内肝细胞的生长、增殖、代谢的情况,以及能否有效改善肝衰大鼠的肝功能。实验分为A-PLO-A空微囊、B-PLO-A空微囊、移植游离的肝细胞、A-PLO-A微囊化肝细胞、B-PLO-A微囊化肝细胞五组。研究结果表明,单纯的空微囊对肝衰大鼠病情无缓解作用,移植后两个空囊移植组3 d死亡率均达到了100%。游离肝细胞组、A-PLO-A微囊化肝细胞组和B-PLO-A微囊化肝细胞组大鼠的ALT、AST、ALB水平均有所恢复,4周时微囊移植组的上述指标均优于游离肝细胞组,说明微囊化肝细胞移植有效缓解了肝脏损伤的程度,治疗效果好于游离肝细胞组。微囊化肝细胞组大鼠的存活率明显高于空囊移植组和游离肝细胞移植组;4周后回收的微囊表面光滑,无细胞包裹,无纤维化。研究结果提示基于多聚鸟氨酸的海藻酸微囊物理稳定性和生物相容性良好,适合作为肝细胞体内移植的载体。
引用本文： 王健, 徐丽明, 汤京龙, 王硕, 王春仁. 基于多聚鸟氨酸的海藻酸微囊化肝细胞体内移植治疗肝衰竭大鼠的研究. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(3): 642-647. doi: 10.7507/1001-5515.20140120 复制
引言
急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是一种严重危害人类健康的临床常见疾病，ALF患者在短时间内即可出现肝细胞大量坏死，进而导致严重肝功能损伤，病情发展迅速，死亡率高，因此，寻找有效的ALF治疗方法极为迫切。
肝组织工程研究在治疗ALF方面较为有效的方案之一是微囊化肝细胞移植，微囊化技术可为外源肝细胞提供有效的免疫隔离保护，进而有利于肝细胞移植后的生存和生物学功能的发挥。早在20世纪80年代，Sun 等就将APA微囊包裹肝细胞移植治疗大鼠肝衰竭，取得了预期效果[1]。近年来的微囊化肝细胞的技术与方法不断改进，微囊材料对囊内肝细胞发挥了较明显的免疫隔离作用，并且由于小分子营养物质可自由通过微囊，囊内肝细胞分泌的活性成分可以发挥功能，使得移植后肝衰动物的存活率明显提高[2-4]。
微囊化细胞技术目前面临的主要问题是如何提高微囊材料的物理稳定性和生物相容性，因此将各种新材料用于微囊制备的研究是近年来微囊研究领域的发展趋势。本研究采用海藻酸钠-多聚鸟氨酸-海藻酸(alginate-poly ornithine-alginate,A-PLO-A) 和海藻酸钡-多聚鸟氨酸-海藻酸(barium alginate-poly ornithine-alginate,B-PLO-A)两种新型微囊包裹小鼠原代肝细胞，植入急性肝衰竭大鼠体内，观察大鼠存活率，检测微囊内肝细胞的生长、增殖、代谢情况，检测肝衰竭大鼠血液中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和白蛋白(albumin，ALB)的浓度变化情况；此外，移植4周后回收微囊，观察移植微囊化细胞的完整性并探讨其生物相容性。
1 材料和方法
1.1 大鼠肝衰模型的建立
D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-gal)按1.2 g/kg 比例腹腔一次性给药，用以诱导急性肝功能衰竭。模型的自然病程为2周，如给药后存活超过2周者则可长期存活。D-gal诱发急性肝衰的原理是：其在肝内通过半乳糖途径代谢，抑制核酸及糖蛋白等生物大分子的合成，诱导肝细胞凋亡、自由基产生和脂质过氧化反应等在内的多种机制综合作用，可迅速造成大面积肝脏损伤。通常在注射后48 h内即可观测到因大量肝细胞受损、死亡所释放的各种肝细胞内容物。
1.2 小鼠原代肝细胞分离
断颈处死C57BL/6小鼠。固定小鼠，喷洒75%酒精消毒后，腹壁正中切口打开腹腔。取出肝脏并将其放入装有4 ℃含双抗的D-Hanks 液中漂洗2次，之后在培养皿中用眼科剪将鼠肝组织剪成1 mm3左右的小块，放入试管中，用吸管吹打，待组织沉淀后吸出上清,如此反复3次，最后一次清洗后，将试管放入离心机800 r/min离心4 min。离心后的试管取出弃上清，加入10倍肝组织体积的含0.2% Ⅳ型胶原酶的消化液，消化完全者可用吸管吹打散开，若消化不完全而吹打不开者，可继续于37 ℃消化15 min。将肝细胞悬液取样在光镜下计数，用血细胞计数板计算肝细胞的产率，并用浓度为0.4%的台盼蓝拒染实验检测肝细胞的存活率。
1.3 微囊化肝细胞的制备
将新分离的肝细胞与2%的海藻酸钠溶液混合，最终达到每毫升海藻酸钠含肝细胞的数量为5×106个。用静电微囊发生仪(NISCO VARV1，瑞典)将其分别喷入氯化钡和氯化钙溶液中，作用2 min，以形成海藻酸钡(钙)微球。吸出氯化钡(钙)溶液，用生理盐水洗涤2次，再将微球分别与多聚鸟赖氨酸溶液/多聚赖氨酸反应数分钟，形成B-PLO-A和A-PLO-A微球，再使用生理盐水洗涤2次；之后，将两种微胶珠与0.05%的海藻酸钠溶液反应数分钟，中和微胶珠表面的正电荷，再将B-PLO-A和A-PLO-A微胶珠与柠檬酸钠溶液反应数分钟，液化囊芯，分别制备成A-PLO-A微囊化肝细胞和B-PLO-A微囊化肝细胞。
1.4 实验分组
将大鼠肝衰竭动物模型随机分为5组(每组n=20)，分别进行腹腔移植实验，包括：A-PLO-A空微囊组：移植1 mL的A-PLO-A空微囊；B-PLO-A空微囊组：移植1 mL的B-PLO-A空微囊；移植游离肝细胞组：移植1 mL游离的小鼠原代肝细胞；A-PLO-A微囊化肝细胞组：移植1 mL A-PLO-A微囊化肝细胞；B-PLO-A微囊化肝细胞组：移植1 mL B-PLO-A微囊化肝细胞。
1.5 动物死亡率的检测以及肝功能检测
以上5组动物每天观察记录死亡情况和死亡时间。并在移植术后的1、3、5 d及1、2、3、4周眼眦静脉取血测定血液中的肝脏生化指标。使用分光光度计测定并计算ALT、AST和ALB的含量。
1.6 统计学处理
实验数据以均数±标准差(
2 结果
2.1 相差显微镜观察
光镜下可见A-PLO-A和B-PLO-A空微囊以及两种包裹了肝细胞的微囊形态完好，囊表面光滑均匀，如图 1所示。
图1
移植前微囊形态的相差显微镜观察
(a)B-PLO-A空微囊(100×)；(b)A-PLO-A空微囊(100×)；(c)B-PLO-A微囊化肝细胞(50×)；(d)A-PLO-A微囊化肝细胞(50×)
Figure1. Phase-contrast microscope observation of the pre-transplant microcapsules(a) B-PLO-A blank microcapsules (100×); (b) A-PLO-A blank microcapsules (100×); (c) B-PLO-A microencapsulated hepatocytes (50×); (d) A-PLO-A microencapsulated hepatocyte (50×)
2.2 死亡率检测
A-PLO-A空微囊组和B-PLO-A空微囊组大鼠移植3 d死亡率达到100% (20/20)；游离细胞组由于免疫排斥反应持续存在，死亡率呈不断上升趋势，3 d死亡率20%(4/20)，移植3周死亡率达到75%(15/20)，其后死亡率维持不变；A-PLO-A微囊化肝细胞组在移植后3周死亡率为35%(7/20)，其后死亡率维持不变；B-PLO-A微囊化肝细胞组在移植后3周死亡率为30%(6/20)，其后死亡率维持不变，如图 2所示。
图2
死亡率统计
Figure2.
Mortality statistics
2.3 肝功能检测
2.3.1 ALT变化
A-PLO-A和B-PLO-A空微囊组的肝衰大鼠ALT水平3 d内持续升高，直至大鼠全部死亡；游离肝细胞组大鼠ALT水平从第5 d开始逐渐下降，第14 d达到最低，随后有升高的趋势；A-PLO-A微囊化肝细胞组、B-PLO-A微囊化肝细胞组ALT浓度水平均在移植3 d~4周内持续下降，在各时间点A-PLO-A微囊化肝细胞组、B-PLO-A微囊化肝细胞组ALT水平与游离肝细胞组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)，但A-PLO-A微囊化肝细胞组和B-PLO-A微囊化肝细胞组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。上述结果表明，与游离肝细胞移植相比，A-PLO-A微囊化肝细胞、B-PLO-A微囊化肝细胞移植4周内均能有效地降低肝衰大鼠ALT的水平，如图 3所示。
图3
移植各组ALT 变化
*各时间点不同移植组间比较
*comparing among the different transplant groups at each time point,
2.3.2 AST变化
A-PLO-A和B-PLO-A空微囊组的肝衰大鼠AST水平3 d内持续升高，直至大鼠全部死亡；游离肝细胞组肝衰大鼠AST水平从第3 d开始逐渐下降，第14 d达到最低，随后有升高的趋势；A-PLO-A微囊化肝细胞组、B-PLO-A微囊化肝细胞组AST浓度水平均在移植3 d~4周内持续下降，在各时间点A-PLO-A微囊化肝细胞组、B-PLO-A微囊化肝细胞组AST水平与游离肝细胞组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)，而A-PLO-A微囊化肝细胞组和B-PLO-A微囊化肝细胞组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。上述结果表明，与游离肝细胞移植相比，A-PLO-A微囊化肝细胞、B-PLO-A微囊化肝细胞移植4周内均能有效地降低肝衰大鼠AST的水平，如图 4所示。
图4
移植各组AST 变化
*各时间点不同移植组间比较，
* comparing among the different transplant groups at each time point,
2.3.3 ALB变化
A-PLO-A和B-PLO-A空微囊组的肝衰大鼠ALB水平3 d内持续下降，直至大鼠全部死亡；游离肝细胞组肝衰大鼠ALB水平从第3 d开始逐渐升高，第21 d达到最高，随后有下降的趋势；A-PLO-A微囊化肝细胞组、B-PLO-A微囊化肝细胞组ALB浓度水平均在移植3 d~4周内持续升高，其中，在各时间点A-PLO-A微囊化肝细胞组、B-PLO-A微囊化肝细胞组ALB水平与游离肝细胞组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)，而A-PLO-A微囊化肝细胞组和B-PLO-A微囊化肝细胞组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。上述结果表明，与游离肝细胞移植相比，A-PLO-A微囊化肝细胞、B-PLO-A微囊化肝细胞移植4周内均能有效地提高肝衰大鼠的ALB水平，如图 5所示。
图5
移植各组ALB 变化
*各时间点不同移植组间比较，
* comparing among the different transplant groups at each time point,
2.4 显微镜观察移植后回收的微囊
在移植4周后，打开各微囊化肝细胞移植组大鼠腹腔，可见大鼠腹腔内表面及腹腔脏器表面光滑，无明显的异常结节；回收的微囊体积占植入微囊体积的90%以上，微囊表面光滑，无明显细胞包绕，无纤维化现象，如图 6所示。
图6
显微镜观察移植后回收的微囊(100×)
Figure6.
Microscope to observe the microcapsules recovery after transplantation (100×)
3 讨论
ALF作为一种临床高发的严重肝病，病程发展快，死亡率高。目前治疗ALF最有效的方法是原位肝移植(orthotopic liver transplantation，OLT)，但是由于供体缺乏、治疗费用高昂、需要终生服用免疫抑制剂等问题，其临床应用还存在很大的局限性。目前利用肝细胞移植来替代原位肝脏移植，在治疗ALF上也取得了一定进展，但是肝细胞对植入宿主体内后的生存环境有较高的要求。因此，迫切需要新的技术和方法来提高ALF的治疗水平。
伴随组织工程学的蓬勃发展，越来越多组织工程技术应用于肝脏疾病的治疗，肝组织工程学应运而生。肝组织工程学面临的一大难题就是肝细胞的来源。自体肝细胞不宜大量体外扩增，外源性肝细胞虽然可以大量获得，却无法避免宿主免疫排斥反应造成的破坏。细胞微囊化技术由于可对包裹其中的各种细胞进行有效保护，在一定程度上可避免细胞体内移植后引发的免疫排斥反应。因此，以微囊化肝细胞为基础的生物型人工肝研究目前已经成为肝组织工程学的重要组成部分之一。
微囊制备材料是微囊化人造细胞性能优劣的物质基础，各国学者通过提高海藻酸盐纯度、观察海藻酸化学构成对微囊性能的影响和寻找新型替代材料，来研发物理性能、生物相容性更好，更为稳定可靠的微囊材料。海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-poly-L-lysine-alginate，A-PLL-A)微囊化制备技术是迄今为止研究最深入、应用最广泛的微囊制备技术，被广泛应用于各类细胞的包裹。研究表明微囊的稳定性很大程度上依靠其囊膜上多聚阳离子与海藻酸的结合效率[5]。由于PLL与海藻酸的结合效率不足，导致微囊表面有暴露的PLL基团，因此影响了材料的稳定性。多聚鸟氨酸(poly-L-ornithine，PLO)是一种表面带有阳离子的氨基酸，近年来的研究表明，与PLL相比，PLO与海藻酸盐结合后，两者之间形成的化学键更短，增强了彼此之间的结合效率，如用PLO取代PLL来制备微囊材料，可在一定程度上提高材料稳定性,所制备的微囊变形率较小，具有更好的机械性能[6]。目前国外文献报道采用PLO材料制备的微囊,主要为包裹胰岛细胞治疗糖尿病的研究[7-8]，基于PLO的海藻酸微囊包裹肝细胞体外移植治疗急性肝衰的研究目前国内外尚未见报道。
本研究主要探讨A-PLO-A 和B-PLO-A两种新型微囊包裹小鼠肝细胞后，植入D-gal腹腔注射法急性肝衰竭模型大鼠体内，观察大鼠存活率，微囊内肝细胞的生长、增殖、代谢的情况，以及微囊化肝细胞能否有效改善肝衰大鼠的肝功能。
实验结果表明，单纯的空微囊对肝衰大鼠病情的恢复没有作用，两个单纯的空微囊移植组动物的死亡率在移植后3 d达到100%。游离肝细胞组、A-PLO-A微囊化肝细胞组和B-PLO-A微囊化肝细胞组的大鼠ALT、AST在血液中的浓度均较移植初有所降低，但术后4周，微囊化肝细胞移植组的上述两指标均显著低于游离肝细胞组，说明微囊化肝细胞移植组有效缓解了肝脏损伤的程度，治疗效果好于游离肝细胞组。游离肝细胞组肝衰大鼠ALB水平从第3 d开始逐渐升高，第21 d 达到最高，随后有下降的趋势；A-PLO-A微囊化肝细胞组和B-PLO-A微囊化肝细胞组大鼠血液中的ALB浓度均逐渐升高，两组间无明显差异，但明显高于游离肝细胞组。微囊化肝细胞组大鼠的存活率明显高于空微囊移植组和游离肝细胞移植组。4周后回收的微囊表面光滑，无细胞包裹，无纤维化。说明基于PLO的海藻酸微囊物理稳定性和生物相容性良好，适合作为肝细胞体内移植的载体。同时，我们也注意到Hillberg 等[7]的研究中发现植入体内的海藻酸微囊囊外层结构的逐渐降解会导致PLO层的暴露，进而降低其生物相容性。由于相关的研究报道还较少，PLO作为微囊制备材料的评价还不够全面，进一步的评价研究还需继续进行。
基于PLO的海藻酸微囊的研制目的是进一步提升微囊的物理性能和生物学性能，以期研制出性能更为优良的微囊材料，同时也为今后进一步将此类型微囊应用于肝组织工程研究奠定坚实的基础。
引言
急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是一种严重危害人类健康的临床常见疾病，ALF患者在短时间内即可出现肝细胞大量坏死，进而导致严重肝功能损伤，病情发展迅速，死亡率高，因此，寻找有效的ALF治疗方法极为迫切。
肝组织工程研究在治疗ALF方面较为有效的方案之一是微囊化肝细胞移植，微囊化技术可为外源肝细胞提供有效的免疫隔离保护，进而有利于肝细胞移植后的生存和生物学功能的发挥。早在20世纪80年代，Sun 等就将APA微囊包裹肝细胞移植治疗大鼠肝衰竭，取得了预期效果[1]。近年来的微囊化肝细胞的技术与方法不断改进，微囊材料对囊内肝细胞发挥了较明显的免疫隔离作用，并且由于小分子营养物质可自由通过微囊，囊内肝细胞分泌的活性成分可以发挥功能，使得移植后肝衰动物的存活率明显提高[2-4]。
微囊化细胞技术目前面临的主要问题是如何提高微囊材料的物理稳定性和生物相容性，因此将各种新材料用于微囊制备的研究是近年来微囊研究领域的发展趋势。本研究采用海藻酸钠-多聚鸟氨酸-海藻酸(alginate-poly ornithine-alginate,A-PLO-A) 和海藻酸钡-多聚鸟氨酸-海藻酸(barium alginate-poly ornithine-alginate,B-PLO-A)两种新型微囊包裹小鼠原代肝细胞，植入急性肝衰竭大鼠体内，观察大鼠存活率，检测微囊内肝细胞的生长、增殖、代谢情况，检测肝衰竭大鼠血液中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和白蛋白(albumin，ALB)的浓度变化情况；此外，移植4周后回收微囊，观察移植微囊化细胞的完整性并探讨其生物相容性。
1 材料和方法
1.1 大鼠肝衰模型的建立
D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-gal)按1.2 g/kg 比例腹腔一次性给药，用以诱导急性肝功能衰竭。模型的自然病程为2周，如给药后存活超过2周者则可长期存活。D-gal诱发急性肝衰的原理是：其在肝内通过半乳糖途径代谢，抑制核酸及糖蛋白等生物大分子的合成，诱导肝细胞凋亡、自由基产生和脂质过氧化反应等在内的多种机制综合作用，可迅速造成大面积肝脏损伤。通常在注射后48 h内即可观测到因大量肝细胞受损、死亡所释放的各种肝细胞内容物。
1.2 小鼠原代肝细胞分离
断颈处死C57BL/6小鼠。固定小鼠，喷洒75%酒精消毒后，腹壁正中切口打开腹腔。取出肝脏并将其放入装有4 ℃含双抗的D-Hanks 液中漂洗2次，之后在培养皿中用眼科剪将鼠肝组织剪成1 mm3左右的小块，放入试管中，用吸管吹打，待组织沉淀后吸出上清,如此反复3次，最后一次清洗后，将试管放入离心机800 r/min离心4 min。离心后的试管取出弃上清，加入10倍肝组织体积的含0.2% Ⅳ型胶原酶的消化液，消化完全者可用吸管吹打散开，若消化不完全而吹打不开者，可继续于37 ℃消化15 min。将肝细胞悬液取样在光镜下计数，用血细胞计数板计算肝细胞的产率，并用浓度为0.4%的台盼蓝拒染实验检测肝细胞的存活率。
1.3 微囊化肝细胞的制备
将新分离的肝细胞与2%的海藻酸钠溶液混合，最终达到每毫升海藻酸钠含肝细胞的数量为5×106个。用静电微囊发生仪(NISCO VARV1，瑞典)将其分别喷入氯化钡和氯化钙溶液中，作用2 min，以形成海藻酸钡(钙)微球。吸出氯化钡(钙)溶液，用生理盐水洗涤2次，再将微球分别与多聚鸟赖氨酸溶液/多聚赖氨酸反应数分钟，形成B-PLO-A和A-PLO-A微球，再使用生理盐水洗涤2次；之后，将两种微胶珠与0.05%的海藻酸钠溶液反应数分钟，中和微胶珠表面的正电荷，再将B-PLO-A和A-PLO-A微胶珠与柠檬酸钠溶液反应数分钟，液化囊芯，分别制备成A-PLO-A微囊化肝细胞和B-PLO-A微囊化肝细胞。
1.4 实验分组
将大鼠肝衰竭动物模型随机分为5组(每组n=20)，分别进行腹腔移植实验，包括：A-PLO-A空微囊组：移植1 mL的A-PLO-A空微囊；B-PLO-A空微囊组：移植1 mL的B-PLO-A空微囊；移植游离肝细胞组：移植1 mL游离的小鼠原代肝细胞；A-PLO-A微囊化肝细胞组：移植1 mL A-PLO-A微囊化肝细胞；B-PLO-A微囊化肝细胞组：移植1 mL B-PLO-A微囊化肝细胞。
1.5 动物死亡率的检测以及肝功能检测
以上5组动物每天观察记录死亡情况和死亡时间。并在移植术后的1、3、5 d及1、2、3、4周眼眦静脉取血测定血液中的肝脏生化指标。使用分光光度计测定并计算ALT、AST和ALB的含量。
1.6 统计学处理
实验数据以均数±标准差(
2 结果
2.1 相差显微镜观察
光镜下可见A-PLO-A和B-PLO-A空微囊以及两种包裹了肝细胞的微囊形态完好，囊表面光滑均匀，如图 1所示。
图1
移植前微囊形态的相差显微镜观察
(a)B-PLO-A空微囊(100×)；(b)A-PLO-A空微囊(100×)；(c)B-PLO-A微囊化肝细胞(50×)；(d)A-PLO-A微囊化肝细胞(50×)
Figure1. Phase-contrast microscope observation of the pre-transplant microcapsules(a) B-PLO-A blank microcapsules (100×); (b) A-PLO-A blank microcapsules (100×); (c) B-PLO-A microencapsulated hepatocytes (50×); (d) A-PLO-A microencapsulated hepatocyte (50×)
2.2 死亡率检测
A-PLO-A空微囊组和B-PLO-A空微囊组大鼠移植3 d死亡率达到100% (20/20)；游离细胞组由于免疫排斥反应持续存在，死亡率呈不断上升趋势，3 d死亡率20%(4/20)，移植3周死亡率达到75%(15/20)，其后死亡率维持不变；A-PLO-A微囊化肝细胞组在移植后3周死亡率为35%(7/20)，其后死亡率维持不变；B-PLO-A微囊化肝细胞组在移植后3周死亡率为30%(6/20)，其后死亡率维持不变，如图 2所示。
图2
死亡率统计
Figure2.
Mortality statistics
2.3 肝功能检测
2.3.1 ALT变化
A-PLO-A和B-PLO-A空微囊组的肝衰大鼠ALT水平3 d内持续升高，直至大鼠全部死亡；游离肝细胞组大鼠ALT水平从第5 d开始逐渐下降，第14 d达到最低，随后有升高的趋势；A-PLO-A微囊化肝细胞组、B-PLO-A微囊化肝细胞组ALT浓度水平均在移植3 d~4周内持续下降，在各时间点A-PLO-A微囊化肝细胞组、B-PLO-A微囊化肝细胞组ALT水平与游离肝细胞组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)，但A-PLO-A微囊化肝细胞组和B-PLO-A微囊化肝细胞组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。上述结果表明，与游离肝细胞移植相比，A-PLO-A微囊化肝细胞、B-PLO-A微囊化肝细胞移植4周内均能有效地降低肝衰大鼠ALT的水平，如图 3所示。
图3
移植各组ALT 变化
*各时间点不同移植组间比较
*comparing among the different transplant groups at each time point,
2.3.2 AST变化
A-PLO-A和B-PLO-A空微囊组的肝衰大鼠AST水平3 d内持续升高，直至大鼠全部死亡；游离肝细胞组肝衰大鼠AST水平从第3 d开始逐渐下降，第14 d达到最低，随后有升高的趋势；A-PLO-A微囊化肝细胞组、B-PLO-A微囊化肝细胞组AST浓度水平均在移植3 d~4周内持续下降，在各时间点A-PLO-A微囊化肝细胞组、B-PLO-A微囊化肝细胞组AST水平与游离肝细胞组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)，而A-PLO-A微囊化肝细胞组和B-PLO-A微囊化肝细胞组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。上述结果表明，与游离肝细胞移植相比，A-PLO-A微囊化肝细胞、B-PLO-A微囊化肝细胞移植4周内均能有效地降低肝衰大鼠AST的水平，如图 4所示。
图4
移植各组AST 变化
*各时间点不同移植组间比较，
* comparing among the different transplant groups at each time point,
2.3.3 ALB变化
A-PLO-A和B-PLO-A空微囊组的肝衰大鼠ALB水平3 d内持续下降，直至大鼠全部死亡；游离肝细胞组肝衰大鼠ALB水平从第3 d开始逐渐升高，第21 d达到最高，随后有下降的趋势；A-PLO-A微囊化肝细胞组、B-PLO-A微囊化肝细胞组ALB浓度水平均在移植3 d~4周内持续升高，其中，在各时间点A-PLO-A微囊化肝细胞组、B-PLO-A微囊化肝细胞组ALB水平与游离肝细胞组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)，而A-PLO-A微囊化肝细胞组和B-PLO-A微囊化肝细胞组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。上述结果表明，与游离肝细胞移植相比，A-PLO-A微囊化肝细胞、B-PLO-A微囊化肝细胞移植4周内均能有效地提高肝衰大鼠的ALB水平，如图 5所示。
图5
移植各组ALB 变化
*各时间点不同移植组间比较，
* comparing among the different transplant groups at each time point,
2.4 显微镜观察移植后回收的微囊
在移植4周后，打开各微囊化肝细胞移植组大鼠腹腔，可见大鼠腹腔内表面及腹腔脏器表面光滑，无明显的异常结节；回收的微囊体积占植入微囊体积的90%以上，微囊表面光滑，无明显细胞包绕，无纤维化现象，如图 6所示。
图6
显微镜观察移植后回收的微囊(100×)
Figure6.
Microscope to observe the microcapsules recovery after transplantation (100×)
3 讨论
ALF作为一种临床高发的严重肝病，病程发展快，死亡率高。目前治疗ALF最有效的方法是原位肝移植(orthotopic liver transplantation，OLT)，但是由于供体缺乏、治疗费用高昂、需要终生服用免疫抑制剂等问题，其临床应用还存在很大的局限性。目前利用肝细胞移植来替代原位肝脏移植，在治疗ALF上也取得了一定进展，但是肝细胞对植入宿主体内后的生存环境有较高的要求。因此，迫切需要新的技术和方法来提高ALF的治疗水平。
伴随组织工程学的蓬勃发展，越来越多组织工程技术应用于肝脏疾病的治疗，肝组织工程学应运而生。肝组织工程学面临的一大难题就是肝细胞的来源。自体肝细胞不宜大量体外扩增，外源性肝细胞虽然可以大量获得，却无法避免宿主免疫排斥反应造成的破坏。细胞微囊化技术由于可对包裹其中的各种细胞进行有效保护，在一定程度上可避免细胞体内移植后引发的免疫排斥反应。因此，以微囊化肝细胞为基础的生物型人工肝研究目前已经成为肝组织工程学的重要组成部分之一。
微囊制备材料是微囊化人造细胞性能优劣的物质基础，各国学者通过提高海藻酸盐纯度、观察海藻酸化学构成对微囊性能的影响和寻找新型替代材料，来研发物理性能、生物相容性更好，更为稳定可靠的微囊材料。海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-poly-L-lysine-alginate，A-PLL-A)微囊化制备技术是迄今为止研究最深入、应用最广泛的微囊制备技术，被广泛应用于各类细胞的包裹。研究表明微囊的稳定性很大程度上依靠其囊膜上多聚阳离子与海藻酸的结合效率[5]。由于PLL与海藻酸的结合效率不足，导致微囊表面有暴露的PLL基团，因此影响了材料的稳定性。多聚鸟氨酸(poly-L-ornithine，PLO)是一种表面带有阳离子的氨基酸，近年来的研究表明，与PLL相比，PLO与海藻酸盐结合后，两者之间形成的化学键更短，增强了彼此之间的结合效率，如用PLO取代PLL来制备微囊材料，可在一定程度上提高材料稳定性,所制备的微囊变形率较小，具有更好的机械性能[6]。目前国外文献报道采用PLO材料制备的微囊,主要为包裹胰岛细胞治疗糖尿病的研究[7-8]，基于PLO的海藻酸微囊包裹肝细胞体外移植治疗急性肝衰的研究目前国内外尚未见报道。
本研究主要探讨A-PLO-A 和B-PLO-A两种新型微囊包裹小鼠肝细胞后，植入D-gal腹腔注射法急性肝衰竭模型大鼠体内，观察大鼠存活率，微囊内肝细胞的生长、增殖、代谢的情况，以及微囊化肝细胞能否有效改善肝衰大鼠的肝功能。
实验结果表明，单纯的空微囊对肝衰大鼠病情的恢复没有作用，两个单纯的空微囊移植组动物的死亡率在移植后3 d达到100%。游离肝细胞组、A-PLO-A微囊化肝细胞组和B-PLO-A微囊化肝细胞组的大鼠ALT、AST在血液中的浓度均较移植初有所降低，但术后4周，微囊化肝细胞移植组的上述两指标均显著低于游离肝细胞组，说明微囊化肝细胞移植组有效缓解了肝脏损伤的程度，治疗效果好于游离肝细胞组。游离肝细胞组肝衰大鼠ALB水平从第3 d开始逐渐升高，第21 d 达到最高，随后有下降的趋势；A-PLO-A微囊化肝细胞组和B-PLO-A微囊化肝细胞组大鼠血液中的ALB浓度均逐渐升高，两组间无明显差异，但明显高于游离肝细胞组。微囊化肝细胞组大鼠的存活率明显高于空微囊移植组和游离肝细胞移植组。4周后回收的微囊表面光滑，无细胞包裹，无纤维化。说明基于PLO的海藻酸微囊物理稳定性和生物相容性良好，适合作为肝细胞体内移植的载体。同时，我们也注意到Hillberg 等[7]的研究中发现植入体内的海藻酸微囊囊外层结构的逐渐降解会导致PLO层的暴露，进而降低其生物相容性。由于相关的研究报道还较少，PLO作为微囊制备材料的评价还不够全面，进一步的评价研究还需继续进行。
基于PLO的海藻酸微囊的研制目的是进一步提升微囊的物理性能和生物学性能，以期研制出性能更为优良的微囊材料，同时也为今后进一步将此类型微囊应用于肝组织工程研究奠定坚实的基础。
