为了探讨Survivin负性突变体T34A对乳腺癌细胞MCF-7增殖与凋亡的影响,本文分别采用生理盐水、空载体质粒(PORF-9-null)及Survivin-T34A与MCF-7细胞共培养,观察体外MCF-7细胞的增殖及凋亡情况;建立乳腺癌裸鼠模型,体内实验检测Survivin-T34A对乳腺癌的抑制作用。结果表明转染了Survivin-T34A的细胞增殖率明显低于PORF-9-null组,电镜下观察可见细胞凋亡增多,流式细胞术检测显示其凋亡率明显高于空载体组。瘤内注射Survivin-T34A组的抑瘤效果明显,抑制率达47.1%。本研究提示Survivin-T34A负性突变体能够有效地抑制乳腺癌细胞的增殖,并促进其凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。
引用本文： 邓晓慧, 宋海岩, 任铭新. Survivin突变体对乳腺癌细胞的体内外作用. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(3): 648-651. doi: 10.7507/1001-5515.20140121 复制
引言
乳腺癌是严重影响妇女健康甚至危及生命的常见恶性肿瘤之一，在我国其发病率及死亡率占女性恶性肿瘤之首，而且呈逐年升高趋势[1]。因此，寻找有效的乳腺癌治疗方法，对降低我国乃至全球乳腺癌的发病、死亡具有重要意义[2]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein,IAP)成员之一，在肿瘤组织和胚胎组织中高表达而在正常组织中不表达[3-4]，Survivin的 BIR(baculo-virus iap repeat)单元中含有对抑制凋亡有重要作用的氨基酸残基(Pro、Trp和Cys)，通过这些残基与caspase-3和caspase-7结合抑制caspase的活性，阻止多种凋亡信号诱导的细胞凋亡。Survivin显性负突变体为一种结构发生变化而失去正常生物学功能的蛋白质分子，可与相应野生型蛋白进行竞争性抑制而阻断后者的生物学功能。已有研究表明Survivin负性突变体Survivin-T34A能够使多种肿瘤细胞发生自发性凋亡，但不影响正常组织细胞的增殖生长[5]。目前很少有该突变体治疗乳腺癌的研究报道，本课题利用阳离子脂质体包裹Survivin-T34A并观察其在体内外抑制乳腺癌细胞的增殖及诱导凋亡作用，以期为乳腺癌的临床治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
人乳腺癌细胞MCF-7购于美国模式培养物集存库(ATCC)，阳离子脂质体LipofectamineTM2000(lip2000)、重组Survivin-T34A突变基因质粒及空载体质粒(PORF-9-null) DMEM培养基均购于Invitrogen公司，MTT、DMSO购于Sigma公司，胎牛血清(FCS)购于博士德生物工程有限公司，细胞周期及细胞凋亡-Hoechst试剂盒购于碧云天生物技术研究所。雌性Balb /c-nu /nu 裸鼠购自北京华阜康公司。
1.2 方法
1.2.1 体外实验
① 细胞培养: 人乳腺癌细胞MCF-7常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、含5% CO2的饱和湿度无菌孵育箱中培养，2~3 d细胞贴壁80%~90%时用0.25%的胰酶消化传代培养。② 细胞分组: 参照文献[6]方法,取对数生长期的MCF-7细胞置于6孔板中，待细胞80%融合时开始实验，弃培养基，随机分为三组，即空载体组、实验组及生理盐水组[(NS)组]，分别加入lip2000包被的PORF-9-null质粒(5 μg，总体积1 mL)、Survivin-T34A质粒(5 μg，总体积1 mL)及生理盐水1 mL,然后加不含血清的DMEM培养基至2 mL，继续培养4~6 h后，换含血清的DMEM培养基继续培养48 h。③ 细胞活性检测: 将上述方法得到的各组细胞置于96孔板中，加入MTT(5 mg/mL)各20 μL，4 h后，吸出培养液每孔加入DMSO 150 μL，震荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪570 nm波长下测吸光度(A)值，计算抑制率，抑制率(%)=(1-药物组A570/对照组A570)×100%。④ 流式细胞术检测细胞凋亡：收集三组培养后的细胞于10 mL离心管中，1 500 r/min、4 ℃离心5 min，弃上清液，用4 ℃预冷的PBS洗涤两次离心后弃去PBS，再加入4 ℃预冷的70%乙醇固定40 min后，弃固定液，再用4 ℃预冷的PBS洗涤两次，加入碘化丙啶(PI)，避光室温反应30 min，用流式细胞仪检测。⑤ 细胞凋亡-Hoechst染色：按照试剂盒操作步骤，将各组转染后细胞置于6孔板培养48 h，取出6孔板中的盖玻片，PBS洗涤后加入0.5 mL固定液固定10 min，PBS洗涤两遍各 3 min，加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液，于摇床上染色5 min后PBS 洗涤两遍，每次3 min，抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下检测细胞核。
1.2.2 体内实验
① 乳腺癌动物模型建立：取对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7，置于不含血清DMEM培养基中离心洗涤三次，用生理盐水调至5×107个/mL，接种于6~8周龄的裸鼠，每只200 μL，接种1 d后严格按照随机数字表将裸鼠分为三组，每组10只，接种10 d后分别给予生理盐水、PORF-9-null(20 μg)、Survivin-T34A(20 μg)各100 μL，瘤内注射给药，一周两次，共给药6次。② 肿瘤生长曲线及抑制率：出瘤后隔2~3 d用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，按公式计算肿瘤体积(肿瘤体积=宽2×长×0.52)，并以测量肿瘤生长的时间点为横轴，以肿瘤体积为纵轴描绘肿瘤生长曲线。接种后第42 d脱颈处死裸鼠，剖其肿瘤组织，称肿瘤重量，计算肿瘤抑制率，肿瘤抑制率(%)=(1-平均实验组瘤重/平均NS对照组瘤重)×100%。
1.2.3 统计方法
数据以均数±标准差(
2 结果
2.1 MTT细胞活性检测
细胞增殖率检测显示，转染了Survivin-T34A的实验组乳腺癌细胞的抑制率为46.50%，明显高于空载体组4.9%(P＜0.05)，显示Survivin突变体能够使乳腺癌细胞活性降低，抑制其增殖。
2.2 细胞凋亡检测
流式细胞仪检测结果显示，Survivin-T34A质粒诱导细胞凋亡，与空载体组相比明显增高(P＜0.05)(见表 1)，用Hoechst 33258染色后，在荧光显微镜下观察，可见正常细胞核呈现均匀蓝染，而凋亡的细胞核呈现出致密浓染或呈碎块状致密浓染，颜色呈现亮白，实验组细胞凋亡数明显增多(见图 1)。
表1
Survivin-T34A对乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响(
图1
各组细胞凋亡染色结果
Figure1.
Results of Hoechst 33258 staining
2.3 Survivin-T34A对肿瘤的抑制作用
Survivin-T34A治疗组的实体瘤体积与NS组及空载体组比较增长明显减缓，如图 2所示。与空载体组相比，Survivin-T34A质粒对肿瘤有明显的抑制作用(见表 2)。
图2
乳腺癌实体瘤生长曲线
Figure2.
Growth curves of tumor volume
表2
Survivin-T34A对裸鼠乳腺癌的抑瘤作用
Table2.
Anti-tumor effect of Survivin-T34A on breast cancer in mice
3 讨论
随着分子生物学的深入研究和应用，乳腺癌的基因治疗逐渐成为生物治疗中的重要探索方向并显出很好的前景。乳腺癌的基因治疗包括多种，其中以Survivin为靶点的肿瘤基因治疗受到广泛的关注。 Survivin是目前发现作用最强的凋亡抑制因子，研究证明Survivin高表达可抑制Fas、Bax、caspases、肿瘤坏死因子、抗癌药物等诱导的细胞凋亡，逃避机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和清除[7]。Survivin为靶点的治疗主要是通过抑制Survivin的抗凋亡作用以及抑制其促细胞增殖作用，从而有效破坏肿瘤的生存发展，诱导细胞凋亡，降低其生长潜能。相关的研究主要集中在反义寡核苷酸、RNA干扰和显性失活突变体等。
Survivin基因显性负突变体已成为生物靶向治疗研究的热点[8]，它是一种结构发生变化而失去其正常凋亡抑制功能的蛋白质分子，可与Survivin蛋白进行竞争性抑制，从而阻断Survivin正常的生物功能，抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡，而且能够增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[9]。近年来研究证明抑制效能最高的突变体为本课题所用到的Survivin-T34A[10]，其34位上磷酸化位点缺失，促进其与细胞内野生型Survivin蛋白竞争性结合CDC2-cyclinB1,使内源性Survivin无法发挥其抑制凋亡的作用，从而引起肿瘤细胞的凋亡，达到治疗效果。本实验利用细胞和动物模型观察了Survivin突变体对乳腺癌细胞的体内外抗瘤效果。体外实验将Survivin-T34A及PORF-9-null质粒转染乳腺癌细胞MCF-7，运用MTT及流式细胞术检测到Survivin-T34A组能够抑制MCF-7细胞的增殖，使乳腺癌细胞G0/G1期明显增多，凋亡率较其余两组明显升高，说明Survivin-T34A在体外能够诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡。为了进一步明确Survivin-T34A对乳腺癌细胞增殖凋亡的影响，课题组又做了Survivin-T34A体内抗瘤作用实验，建立裸鼠乳腺癌模型，显示Survivin-T34A能够减缓肿瘤生长速度，与其余两组比较抑瘤率明显升高。
本实验通过体外转染细胞及体内肿瘤模型显示了Survivin-T34A对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响以及体内的抑瘤作用。然而以Survivin为治疗靶点的实验还处于早期阶段，能否运用于临床，Survivin-T34A在体内如何发挥抗肿瘤的效应，其机制如何等，还有待进一步的研究。接下来我们将从凋亡通路的角度切入Survivin-T34A抗瘤机制的研究，以期为乳腺癌的基因治疗、抗肿瘤药物的开发提供思路。
引言
乳腺癌是严重影响妇女健康甚至危及生命的常见恶性肿瘤之一，在我国其发病率及死亡率占女性恶性肿瘤之首，而且呈逐年升高趋势[1]。因此，寻找有效的乳腺癌治疗方法，对降低我国乃至全球乳腺癌的发病、死亡具有重要意义[2]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein,IAP)成员之一，在肿瘤组织和胚胎组织中高表达而在正常组织中不表达[3-4]，Survivin的 BIR(baculo-virus iap repeat)单元中含有对抑制凋亡有重要作用的氨基酸残基(Pro、Trp和Cys)，通过这些残基与caspase-3和caspase-7结合抑制caspase的活性，阻止多种凋亡信号诱导的细胞凋亡。Survivin显性负突变体为一种结构发生变化而失去正常生物学功能的蛋白质分子，可与相应野生型蛋白进行竞争性抑制而阻断后者的生物学功能。已有研究表明Survivin负性突变体Survivin-T34A能够使多种肿瘤细胞发生自发性凋亡，但不影响正常组织细胞的增殖生长[5]。目前很少有该突变体治疗乳腺癌的研究报道，本课题利用阳离子脂质体包裹Survivin-T34A并观察其在体内外抑制乳腺癌细胞的增殖及诱导凋亡作用，以期为乳腺癌的临床治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
人乳腺癌细胞MCF-7购于美国模式培养物集存库(ATCC)，阳离子脂质体LipofectamineTM2000(lip2000)、重组Survivin-T34A突变基因质粒及空载体质粒(PORF-9-null) DMEM培养基均购于Invitrogen公司，MTT、DMSO购于Sigma公司，胎牛血清(FCS)购于博士德生物工程有限公司，细胞周期及细胞凋亡-Hoechst试剂盒购于碧云天生物技术研究所。雌性Balb /c-nu /nu 裸鼠购自北京华阜康公司。
1.2 方法
1.2.1 体外实验
① 细胞培养: 人乳腺癌细胞MCF-7常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、含5% CO2的饱和湿度无菌孵育箱中培养，2~3 d细胞贴壁80%~90%时用0.25%的胰酶消化传代培养。② 细胞分组: 参照文献[6]方法,取对数生长期的MCF-7细胞置于6孔板中，待细胞80%融合时开始实验，弃培养基，随机分为三组，即空载体组、实验组及生理盐水组[(NS)组]，分别加入lip2000包被的PORF-9-null质粒(5 μg，总体积1 mL)、Survivin-T34A质粒(5 μg，总体积1 mL)及生理盐水1 mL,然后加不含血清的DMEM培养基至2 mL，继续培养4~6 h后，换含血清的DMEM培养基继续培养48 h。③ 细胞活性检测: 将上述方法得到的各组细胞置于96孔板中，加入MTT(5 mg/mL)各20 μL，4 h后，吸出培养液每孔加入DMSO 150 μL，震荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪570 nm波长下测吸光度(A)值，计算抑制率，抑制率(%)=(1-药物组A570/对照组A570)×100%。④ 流式细胞术检测细胞凋亡：收集三组培养后的细胞于10 mL离心管中，1 500 r/min、4 ℃离心5 min，弃上清液，用4 ℃预冷的PBS洗涤两次离心后弃去PBS，再加入4 ℃预冷的70%乙醇固定40 min后，弃固定液，再用4 ℃预冷的PBS洗涤两次，加入碘化丙啶(PI)，避光室温反应30 min，用流式细胞仪检测。⑤ 细胞凋亡-Hoechst染色：按照试剂盒操作步骤，将各组转染后细胞置于6孔板培养48 h，取出6孔板中的盖玻片，PBS洗涤后加入0.5 mL固定液固定10 min，PBS洗涤两遍各 3 min，加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液，于摇床上染色5 min后PBS 洗涤两遍，每次3 min，抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下检测细胞核。
1.2.2 体内实验
① 乳腺癌动物模型建立：取对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7，置于不含血清DMEM培养基中离心洗涤三次，用生理盐水调至5×107个/mL，接种于6~8周龄的裸鼠，每只200 μL，接种1 d后严格按照随机数字表将裸鼠分为三组，每组10只，接种10 d后分别给予生理盐水、PORF-9-null(20 μg)、Survivin-T34A(20 μg)各100 μL，瘤内注射给药，一周两次，共给药6次。② 肿瘤生长曲线及抑制率：出瘤后隔2~3 d用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，按公式计算肿瘤体积(肿瘤体积=宽2×长×0.52)，并以测量肿瘤生长的时间点为横轴，以肿瘤体积为纵轴描绘肿瘤生长曲线。接种后第42 d脱颈处死裸鼠，剖其肿瘤组织，称肿瘤重量，计算肿瘤抑制率，肿瘤抑制率(%)=(1-平均实验组瘤重/平均NS对照组瘤重)×100%。
1.2.3 统计方法
数据以均数±标准差(
2 结果
2.1 MTT细胞活性检测
细胞增殖率检测显示，转染了Survivin-T34A的实验组乳腺癌细胞的抑制率为46.50%，明显高于空载体组4.9%(P＜0.05)，显示Survivin突变体能够使乳腺癌细胞活性降低，抑制其增殖。
2.2 细胞凋亡检测
流式细胞仪检测结果显示，Survivin-T34A质粒诱导细胞凋亡，与空载体组相比明显增高(P＜0.05)(见表 1)，用Hoechst 33258染色后，在荧光显微镜下观察，可见正常细胞核呈现均匀蓝染，而凋亡的细胞核呈现出致密浓染或呈碎块状致密浓染，颜色呈现亮白，实验组细胞凋亡数明显增多(见图 1)。
表1
Survivin-T34A对乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响(
图1
各组细胞凋亡染色结果
Figure1.
Results of Hoechst 33258 staining
2.3 Survivin-T34A对肿瘤的抑制作用
Survivin-T34A治疗组的实体瘤体积与NS组及空载体组比较增长明显减缓，如图 2所示。与空载体组相比，Survivin-T34A质粒对肿瘤有明显的抑制作用(见表 2)。
图2
乳腺癌实体瘤生长曲线
Figure2.
Growth curves of tumor volume
表2
Survivin-T34A对裸鼠乳腺癌的抑瘤作用
Table2.
Anti-tumor effect of Survivin-T34A on breast cancer in mice
3 讨论
随着分子生物学的深入研究和应用，乳腺癌的基因治疗逐渐成为生物治疗中的重要探索方向并显出很好的前景。乳腺癌的基因治疗包括多种，其中以Survivin为靶点的肿瘤基因治疗受到广泛的关注。 Survivin是目前发现作用最强的凋亡抑制因子，研究证明Survivin高表达可抑制Fas、Bax、caspases、肿瘤坏死因子、抗癌药物等诱导的细胞凋亡，逃避机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和清除[7]。Survivin为靶点的治疗主要是通过抑制Survivin的抗凋亡作用以及抑制其促细胞增殖作用，从而有效破坏肿瘤的生存发展，诱导细胞凋亡，降低其生长潜能。相关的研究主要集中在反义寡核苷酸、RNA干扰和显性失活突变体等。
Survivin基因显性负突变体已成为生物靶向治疗研究的热点[8]，它是一种结构发生变化而失去其正常凋亡抑制功能的蛋白质分子，可与Survivin蛋白进行竞争性抑制，从而阻断Survivin正常的生物功能，抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡，而且能够增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[9]。近年来研究证明抑制效能最高的突变体为本课题所用到的Survivin-T34A[10]，其34位上磷酸化位点缺失，促进其与细胞内野生型Survivin蛋白竞争性结合CDC2-cyclinB1,使内源性Survivin无法发挥其抑制凋亡的作用，从而引起肿瘤细胞的凋亡，达到治疗效果。本实验利用细胞和动物模型观察了Survivin突变体对乳腺癌细胞的体内外抗瘤效果。体外实验将Survivin-T34A及PORF-9-null质粒转染乳腺癌细胞MCF-7，运用MTT及流式细胞术检测到Survivin-T34A组能够抑制MCF-7细胞的增殖，使乳腺癌细胞G0/G1期明显增多，凋亡率较其余两组明显升高，说明Survivin-T34A在体外能够诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡。为了进一步明确Survivin-T34A对乳腺癌细胞增殖凋亡的影响，课题组又做了Survivin-T34A体内抗瘤作用实验，建立裸鼠乳腺癌模型，显示Survivin-T34A能够减缓肿瘤生长速度，与其余两组比较抑瘤率明显升高。
本实验通过体外转染细胞及体内肿瘤模型显示了Survivin-T34A对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响以及体内的抑瘤作用。然而以Survivin为治疗靶点的实验还处于早期阶段，能否运用于临床，Survivin-T34A在体内如何发挥抗肿瘤的效应，其机制如何等，还有待进一步的研究。接下来我们将从凋亡通路的角度切入Survivin-T34A抗瘤机制的研究，以期为乳腺癌的基因治疗、抗肿瘤药物的开发提供思路。
