本文研究壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料的皮肤刺激性和烧伤治疗效果。通过参照GB/T16886.10-2005评价该敷料的皮肤刺激性,同时制备烧伤兔模型,分为三组,空白对照组用凡士林油纱包扎,阳性对照组用纳米银创伤贴包扎,实验样品组用壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料包扎,分别于3、6、9、14、21、28 d进行伤口未愈合面积测量、羟脯氨酸含量及组织病理学检查。实验结果显示该敷料原发性刺激指数为0;实验样品组和阳性对照组在6、9、14、21 d时,未愈合伤口面积均小于空白对照组(P＜0.05),实验样品组在9 d和14 d时其未愈合伤口面积显著低于阳性对照组(P＜0.05);实验样品组在6、9和14 d时羟脯氨酸含量显著高于阳性对照组和空白对照组(P＜0.05);通过病理学观察,在21 d时实验样品组最早出现附属器。由此说明壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料的皮肤刺激性极轻微,能够有效促进烧伤创面愈合。
引用本文： 高萍, 王晓辉, 黄姝杰, 王瑛, 关静, 李毅敏, 陶遵威. 壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料的烧伤疗效研究. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(4): 806-810. doi: 10.7507/1001-5515.20140151 复制
引言
烧伤是由于光、热、辐射等引起的组织损伤，是一种极其复杂的外伤性疾病，烧伤治疗的最终目标是创面愈合，所以保护创面、防止感染、促进上皮生长的新型敷料成为研究热点。
壳聚糖是天然产物，具有烧伤治疗所必需的属性，例如：生物相容性、可降解性、保湿性、透气性[1]，并且由于壳聚糖特殊的分子结构，易于制成水凝胶[2]、纳米纤维[3]、微/纳米粒子[4]等新剂型。本文通过浸渍法在壳聚糖无纺布表面复合了适量左氧氟沙星-壳聚糖微球，制成一种长效缓释敷料[5]。本文将对壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料进行皮肤刺激评价，并与纳米银敷料促进伤口愈合的能力进行比较。
1 材料与方法
1.1 实验动物
33只日本大耳白兔，普通级，雄性，体重2.0~2.5 kg，由北京方元缘养殖场提供，合格证号：scxk(京)2010-0002。
1.2 实验仪器
紫外分光光度计[UV-260，岛津企业管理(中国)有限责任公司]，离心机[J6-MI，贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司]，超净工作台 (ACD-201，苏州市汉达工业自动化有限责任公司)，显微镜[BH-2，奥林巴斯(中国)有限公司]，组织切片机(RM2255，Leica company)，高压蒸汽灭菌器(MLS-3750，日本三洋电器股份有限公司)
1.3 实验材料
壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料(中国人民解放军军事医学科学院卫生装备研究所)，纳米银敷料(湖南安信医用高分子材料有限公司，批号：20100607)，生理盐水(中国大冢制药有限公司，批号：OL71G4)，羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20100902)，包音氏(Bouin's)固定液(过饱和苦味酸∶甲醛∶冰醋酸=15∶5∶1)。
1.4 方法
1.4.1 动物皮肤刺激实验
参照GB/T16886.10-2005，取3只兔，剪剃背部脊柱两侧兔毛备皮，75%乙醇消毒皮肤。在每只兔脊柱两侧各选两点，将壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料剪成2.5 cm×2.5 cm直接敷贴在脊柱左上和右下两点，作为实验样品组；将生理盐水滴到2.5 cm×2.5 cm的纱布块上，每块纱布滴0.5 mL，敷贴在脊柱左下和右上两点，作为阴性对照组。用半封闭性包扎带固定6 h，然后除去敷贴物。在除去敷贴物后分别于24、48和72 h三个时间点按表 1对试验创面记分。
表1
记分标准
Table1.
Scoring standards
依据标准，皮肤刺激程度用原发性刺激指数表示。计算出每只动物在每一规定时间内实验样品引起的红斑、水肿的原发性刺激记分相加后再除以观察总数之和；同样计算出阴性对照的原发性刺激记分，将实验材料原发性刺激记分减去阴性对照的记分即得出原发性刺激指数。原发性刺激指数与动物的刺激反应类型对应关系如表 2所示。
表2
刺激反应类型
Table2.
Response types
1.4.2 烧伤动物模型制备与分组
将兔用2%戊巴比妥钠麻醉，剪剃背部兔毛备皮，以75%酒精棉球消毒，用触头直径2.0 cm的电烙铁，以温度100 ℃，1 kg压力熨烫兔皮肤10 s，制备烧伤模型。每只兔子沿脊柱上中下三个位置，烫三个创面。接近头部的创面(上位)为实验样品组，用壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料包扎；中间部位的创面(中位)为空白对照组，用凡士林油纱包扎；接近尾部的创面(下位)为阳性对照组，用纳米银敷料包扎。按照时间3、6、9、14、21、28 d分为6组，每组5只兔，共计30只兔。
1.4.3 烧伤面积实验
分别在3、6、9、14、21、28 d观察动物创面，用透明薄膜描绘未愈合伤口大小，扫描薄膜后用计算机软件photoshop计算其面积，绘制未愈合伤口面积随时间的变化曲线。
1.4.4 羟脯氨酸含量实验
分别在3、6、9、14、21、28 d处死动物，与伤口处取组织标本0.5 g，采用碱水解法处理标本，使用羟脯氨酸试剂盒，根据羟脯氨酸的氧化产物与二甲氨基苯甲醛呈色深浅推算出其含量。
1.4.5 组织病理学实验
分别在3、6、9、14、21、28 d处死动物，在伤口处取组织标本，浸泡于包音氏固定液中30 d，然后石蜡包埋、切片、HE染色，进行组织病理学观察。
1.4.6 使用统计学软件
使用SPSS 16.0对各组实验数据做单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 动物皮肤刺激实验结果
在24、48和72 h三个时间点对3只兔进行创面观察并按照表 1标准记分。实验结果显示，壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料与皮肤接触的6处均无红斑产生，与生理盐水对照组一致，故均记分为0。根据定义计算壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料原发性刺激指数，该指数=(0-0)÷18=0.0。所以我们认为，本文使用的壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料对日本大耳白兔无皮肤刺激性。
2.2 烧伤面积实验结果
实验样品组和阳性对照组在6、9、14、21 d时，未愈合伤口面积均小于空白对照组(P＜0.05)，3 d和28 d时，三组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；实验样品组在3、6、21、28 d时和阳性对照组之间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，在9 d和14 d时实验样品组未愈合伤口面积显著低于阳性对照组(P＜0.05)(见表 3)。
表3
未愈合伤口面积测量结果(n＝5，cm2，2.3 羟脯氨酸含量实验结果
实验样品组在6、9和14 d时羟脯氨酸含量显著高于阳性对照组和空白对照组(P＜0.05)，3、21和28 d时，三组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；阳性对照组在各个时间点与空白对照组之间，差异无统计学意义(P＞0.05)(见表 4)。
表4
羟脯氨酸含量测量结果(n＝5，μg/mg，2.4 组织病理学实验结果
在3 d时，三组的组织形态大致相似，均在血痂下见皮下组织水肿及新生肉芽组织形成。在6 d时，实验对照组和阳性对照组的创面为晚期肉芽组织，其中实验对照组有2只动物创面边缘见新生上皮(见图 1)，空白对照组的创面为早期或中、晚期肉芽组织。在9 d时，三组的创面均为晚期肉芽组织及边缘见新生上皮，开始修复创面，并且实验样品组的新生上皮覆盖全部创面的50%，而阳性对照组仅有1只动物的新生上皮覆盖全部创面的50%。在14 d时，实验样品组的创面覆盖的新生上皮生长更多，其中2个动物已全部愈合，阳性对照组和空白对照组的创面均见新生上皮生长，但未全部覆盖愈合。在21 d时，实验样品组的创面已全部为新生上皮覆盖，并有3只已见附属器生长(见图 1)，阳性对照组和空白对照组的创面纤维化明显，但不见附属器结构。在28 d时，实验样品组的动物伤口已经全部完全恢复，而阳性对照组还有2只动物未见附属器生长，空白对照组中还有4只动物未见附属器生长。
图1
组织病理学切片(HE染色，100×)
Figure1.
Pathological organization chart (HE stain，100×)
3 讨论
壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释材料含有第三代喹诺酮类抗菌药物左氧氟沙星，随着它在临床上的广泛应用，不良反应的报道不断增加，例如皮肤红肿[6]。但通过药物制剂控制药物释放量和释放时间，可有效降低毒性，Kimura等[7]研制的控释左氧氟沙星植入剂(PT-01)的刺激性显著降低。本研究所用的壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料中的壳聚糖纳米微粒的包封率高、稳定性好，能够有效控制左氧氟沙星的释放，实验结果证明，该敷料对日本大耳白兔无皮肤刺激性。
创面愈合过程主要包括血小板聚集、血液凝固、纤维蛋白形成、炎性反应发生、基质变化、细胞增殖和再生，受损组织修复和重塑等过程。壳聚糖可促进上皮细胞的再生，通过介导细胞增殖而促进伤口愈合，通过温和的急性炎性反应吸引大量的多形核细胞和巨噬细胞以清除组织碎片和血凝块。壳聚糖可促进纤维细胞的迁移，对基质细胞有趋化、迁移、激活作用，并加速细胞增殖和组织重塑过程，促进皮肤组织修复[8]。所以本文烧伤面积实验中，实验样品组的伤口愈合快于空白对照组(P＜0.05)。壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料具有很强的透气、透湿性，所以能有效吸收创面渗出液，维持一个仿效创面生理性愈合的局部湿润环境，有利于创面肉芽组织生长和上皮细胞再生，促进了自体皮片的扩展及创面愈合。
羟脯氨酸对形成三股螺旋绳状结构的胶原蛋白及其稳定性都具有重要意义，并且它在胶原蛋白中所占比例相对恒定(12%~15%)，而胶原蛋白是烧伤创面修复过程中形成组织的主要成分，其代谢状况可以反映创面愈合的情况，因此检测羟脯氨酸含量可以反映胶原蛋白含量，是创面愈合的重要指标[9]。实验样品组分别在6、9和14 d时羟脯氨酸含量显著高于空白对照组(P＜0.05)，与组织病理学实验结果相似，在21 d时实验样品组最早出现附属器，说明实验样品组的烧伤恢复最快，进一步证明壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料能够促进烧伤创面愈合。
引言
烧伤是由于光、热、辐射等引起的组织损伤，是一种极其复杂的外伤性疾病，烧伤治疗的最终目标是创面愈合，所以保护创面、防止感染、促进上皮生长的新型敷料成为研究热点。
壳聚糖是天然产物，具有烧伤治疗所必需的属性，例如：生物相容性、可降解性、保湿性、透气性[1]，并且由于壳聚糖特殊的分子结构，易于制成水凝胶[2]、纳米纤维[3]、微/纳米粒子[4]等新剂型。本文通过浸渍法在壳聚糖无纺布表面复合了适量左氧氟沙星-壳聚糖微球，制成一种长效缓释敷料[5]。本文将对壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料进行皮肤刺激评价，并与纳米银敷料促进伤口愈合的能力进行比较。
1 材料与方法
1.1 实验动物
33只日本大耳白兔，普通级，雄性，体重2.0~2.5 kg，由北京方元缘养殖场提供，合格证号：scxk(京)2010-0002。
1.2 实验仪器
紫外分光光度计[UV-260，岛津企业管理(中国)有限责任公司]，离心机[J6-MI，贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司]，超净工作台 (ACD-201，苏州市汉达工业自动化有限责任公司)，显微镜[BH-2，奥林巴斯(中国)有限公司]，组织切片机(RM2255，Leica company)，高压蒸汽灭菌器(MLS-3750，日本三洋电器股份有限公司)
1.3 实验材料
壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料(中国人民解放军军事医学科学院卫生装备研究所)，纳米银敷料(湖南安信医用高分子材料有限公司，批号：20100607)，生理盐水(中国大冢制药有限公司，批号：OL71G4)，羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20100902)，包音氏(Bouin's)固定液(过饱和苦味酸∶甲醛∶冰醋酸=15∶5∶1)。
1.4 方法
1.4.1 动物皮肤刺激实验
参照GB/T16886.10-2005，取3只兔，剪剃背部脊柱两侧兔毛备皮，75%乙醇消毒皮肤。在每只兔脊柱两侧各选两点，将壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料剪成2.5 cm×2.5 cm直接敷贴在脊柱左上和右下两点，作为实验样品组；将生理盐水滴到2.5 cm×2.5 cm的纱布块上，每块纱布滴0.5 mL，敷贴在脊柱左下和右上两点，作为阴性对照组。用半封闭性包扎带固定6 h，然后除去敷贴物。在除去敷贴物后分别于24、48和72 h三个时间点按表 1对试验创面记分。
表1
记分标准
Table1.
Scoring standards
依据标准，皮肤刺激程度用原发性刺激指数表示。计算出每只动物在每一规定时间内实验样品引起的红斑、水肿的原发性刺激记分相加后再除以观察总数之和；同样计算出阴性对照的原发性刺激记分，将实验材料原发性刺激记分减去阴性对照的记分即得出原发性刺激指数。原发性刺激指数与动物的刺激反应类型对应关系如表 2所示。
表2
刺激反应类型
Table2.
Response types
1.4.2 烧伤动物模型制备与分组
将兔用2%戊巴比妥钠麻醉，剪剃背部兔毛备皮，以75%酒精棉球消毒，用触头直径2.0 cm的电烙铁，以温度100 ℃，1 kg压力熨烫兔皮肤10 s，制备烧伤模型。每只兔子沿脊柱上中下三个位置，烫三个创面。接近头部的创面(上位)为实验样品组，用壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料包扎；中间部位的创面(中位)为空白对照组，用凡士林油纱包扎；接近尾部的创面(下位)为阳性对照组，用纳米银敷料包扎。按照时间3、6、9、14、21、28 d分为6组，每组5只兔，共计30只兔。
1.4.3 烧伤面积实验
分别在3、6、9、14、21、28 d观察动物创面，用透明薄膜描绘未愈合伤口大小，扫描薄膜后用计算机软件photoshop计算其面积，绘制未愈合伤口面积随时间的变化曲线。
1.4.4 羟脯氨酸含量实验
分别在3、6、9、14、21、28 d处死动物，与伤口处取组织标本0.5 g，采用碱水解法处理标本，使用羟脯氨酸试剂盒，根据羟脯氨酸的氧化产物与二甲氨基苯甲醛呈色深浅推算出其含量。
1.4.5 组织病理学实验
分别在3、6、9、14、21、28 d处死动物，在伤口处取组织标本，浸泡于包音氏固定液中30 d，然后石蜡包埋、切片、HE染色，进行组织病理学观察。
1.4.6 使用统计学软件
使用SPSS 16.0对各组实验数据做单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 动物皮肤刺激实验结果
在24、48和72 h三个时间点对3只兔进行创面观察并按照表 1标准记分。实验结果显示，壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料与皮肤接触的6处均无红斑产生，与生理盐水对照组一致，故均记分为0。根据定义计算壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料原发性刺激指数，该指数=(0-0)÷18=0.0。所以我们认为，本文使用的壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料对日本大耳白兔无皮肤刺激性。
2.2 烧伤面积实验结果
实验样品组和阳性对照组在6、9、14、21 d时，未愈合伤口面积均小于空白对照组(P＜0.05)，3 d和28 d时，三组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；实验样品组在3、6、21、28 d时和阳性对照组之间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，在9 d和14 d时实验样品组未愈合伤口面积显著低于阳性对照组(P＜0.05)(见表 3)。
表3
未愈合伤口面积测量结果(n＝5，cm2，2.3 羟脯氨酸含量实验结果
实验样品组在6、9和14 d时羟脯氨酸含量显著高于阳性对照组和空白对照组(P＜0.05)，3、21和28 d时，三组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；阳性对照组在各个时间点与空白对照组之间，差异无统计学意义(P＞0.05)(见表 4)。
表4
羟脯氨酸含量测量结果(n＝5，μg/mg，2.4 组织病理学实验结果
在3 d时，三组的组织形态大致相似，均在血痂下见皮下组织水肿及新生肉芽组织形成。在6 d时，实验对照组和阳性对照组的创面为晚期肉芽组织，其中实验对照组有2只动物创面边缘见新生上皮(见图 1)，空白对照组的创面为早期或中、晚期肉芽组织。在9 d时，三组的创面均为晚期肉芽组织及边缘见新生上皮，开始修复创面，并且实验样品组的新生上皮覆盖全部创面的50%，而阳性对照组仅有1只动物的新生上皮覆盖全部创面的50%。在14 d时，实验样品组的创面覆盖的新生上皮生长更多，其中2个动物已全部愈合，阳性对照组和空白对照组的创面均见新生上皮生长，但未全部覆盖愈合。在21 d时，实验样品组的创面已全部为新生上皮覆盖，并有3只已见附属器生长(见图 1)，阳性对照组和空白对照组的创面纤维化明显，但不见附属器结构。在28 d时，实验样品组的动物伤口已经全部完全恢复，而阳性对照组还有2只动物未见附属器生长，空白对照组中还有4只动物未见附属器生长。
图1
组织病理学切片(HE染色，100×)
Figure1.
Pathological organization chart (HE stain，100×)
3 讨论
壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释材料含有第三代喹诺酮类抗菌药物左氧氟沙星，随着它在临床上的广泛应用，不良反应的报道不断增加，例如皮肤红肿[6]。但通过药物制剂控制药物释放量和释放时间，可有效降低毒性，Kimura等[7]研制的控释左氧氟沙星植入剂(PT-01)的刺激性显著降低。本研究所用的壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料中的壳聚糖纳米微粒的包封率高、稳定性好，能够有效控制左氧氟沙星的释放，实验结果证明，该敷料对日本大耳白兔无皮肤刺激性。
创面愈合过程主要包括血小板聚集、血液凝固、纤维蛋白形成、炎性反应发生、基质变化、细胞增殖和再生，受损组织修复和重塑等过程。壳聚糖可促进上皮细胞的再生，通过介导细胞增殖而促进伤口愈合，通过温和的急性炎性反应吸引大量的多形核细胞和巨噬细胞以清除组织碎片和血凝块。壳聚糖可促进纤维细胞的迁移，对基质细胞有趋化、迁移、激活作用，并加速细胞增殖和组织重塑过程，促进皮肤组织修复[8]。所以本文烧伤面积实验中，实验样品组的伤口愈合快于空白对照组(P＜0.05)。壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料具有很强的透气、透湿性，所以能有效吸收创面渗出液，维持一个仿效创面生理性愈合的局部湿润环境，有利于创面肉芽组织生长和上皮细胞再生，促进了自体皮片的扩展及创面愈合。
羟脯氨酸对形成三股螺旋绳状结构的胶原蛋白及其稳定性都具有重要意义，并且它在胶原蛋白中所占比例相对恒定(12%~15%)，而胶原蛋白是烧伤创面修复过程中形成组织的主要成分，其代谢状况可以反映创面愈合的情况，因此检测羟脯氨酸含量可以反映胶原蛋白含量，是创面愈合的重要指标[9]。实验样品组分别在6、9和14 d时羟脯氨酸含量显著高于空白对照组(P＜0.05)，与组织病理学实验结果相似，在21 d时实验样品组最早出现附属器，说明实验样品组的烧伤恢复最快，进一步证明壳聚糖-左氧氟沙星长效缓释敷料能够促进烧伤创面愈合。
