载骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活性多肽P24的聚三甲基碳酸酯-(聚氧乙烯)-聚三甲基碳酸酯(PTMC11-F127-PTMC11)注射型可降解凝胶诱导大鼠体内异位成骨,测定P24体外释放曲线。将P24与不同质量浓度的PTMC11-F127-PTMC11水凝胶复合,采用二喹啉甲酸(BCA)法测定,绘制P24释放曲线。将复合P24凝胶植于大鼠骶棘肌,行组织学切片HE染色检测其异位成骨能力。PTMC11-F127-PTMC11浓度大于20%的复合凝胶其P24经突释期后可维持缓释1个月左右,满足缓释材料要求。组织学显示第6周切片可见骨小梁。载BMP-2活性多肽P24 PTMC11-F127-PTMC11凝胶在体内能有效发挥其诱导成骨活性,有望成为生长因子合适载体。
引用本文： 赵晶晶, 方真华, 黄若昆, 肖凯, 李静, 谢鸣, 勘武生. 载骨形态发生蛋白-2活性肽可降解水凝胶体内异位成骨研究. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(4): 811-815. doi: 10.7507/1001-5515.20140152 复制
引言
研究表明，天然人骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)由114个氨基酸组成，但真正发挥骨诱导作用的只是由20余个氨基酸组成的核心结构域[1]。本文作者所在课题组前期研究中通过BMP-2氨基酸序列中诱导成骨的核心功能区设计并人工合成了一种BMP-2活性肽P24。P24作为分子诱导信号，通过特定的细胞通讯与信息传递系统对细胞的黏附和向成骨方向定向分化等生物学行为调控，具有很好的骨诱导活性[2]。同时P24中包含磷酸化的丝氨酸以及天冬氨酸，能够极好地模拟天然骨基质的诱导矿化功能，在局部形成偏酸的环境，促进局部的钙、磷自组装沉积到体内局部组织中胶原纤维表面自主装矿化，生长成按同一方向排列的羟基磷灰石微型晶体结构，形成与天然骨极为相似的结构，可发挥与天然BMP-2类似的功能。以人工合成活性多肽代替其蛋白质，具有生物活性强、稳定性好、合成费用低等优点。但其成骨效应呈剂量和时间依赖性，如何使其持续有效地发挥其骨诱导作用一直是骨组织工程研究的一个难点[3]。
在多肽的载体材料方面，目前组织工程研究中应用最为广泛的是聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)及其共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]及Pluronic嵌段共聚物F127等，它们在力学强度、降解速度、细胞亲合性等各方面均不理想，并非理想的骨组织工程良好的基质材料及载药材料，限制了多肽在骨组织工程领域中进一步应用[4-5]。为了克服这些缺陷，Zhang等[6]在Pluronic嵌段共聚物F127分子链中引入疏水链段聚三甲基碳酸酯[poly(trimethylene carbonate),PTMC]链段，设计制备了聚三甲基碳酸酯-(聚氧乙烯)-聚三甲基碳酸酯[(poly(trimethylene carbonate)-F127-poly(trimethylene carbonate),PTMC11-F127-PTMC11]共聚物，获得比较好的水溶性。直接将共聚物在低温时(4 ℃)溶于水相介质，升温至室温，两亲性嵌段共聚物在水介质中通过自组装形成具有亲水外壳和疏水内核的胶束，进一步交联形成透明稳定的水凝胶，可缓慢降解，且理化特性可调节。
1 材料与方法
1.1 实验材料和仪器
PTMC11-F127-PTMC11多聚物材料由中山大学化学化工学院高分子研究所全大萍教授等制备：以Sn(Oct)2为催化剂，F127为大分子共引发剂进行trimethylene carbonate (TMC)的开环聚合，合成符合设计结构的PTMC11-F127-PTMC11嵌段共聚物；BMP-2活性多肽P24(委托吉尔生化公司合成,上海)；低温冻干机(VFD-2000，比朗，上海)、环境扫描电镜(Quanta 200,FEI,荷兰)、超声分散器、胶原海绵(孔率为88%，孔径200~300 μm，博士德，武汉)、真空干燥箱(大连第四仪表厂)；雄性SD大鼠,体重为(150±20) g (华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)。
1.2 凝胶制备与检测
取2 mg PTMC11-F127-PTMC11共聚物溶于1 mL预冷的4 ℃去离子水中，使PTMC11-F127-PTMC11共聚物的质量百分终浓度为20%，超声分散均匀，置于4 ℃冰箱冷存8 h，使PTMC11-F127-PTMC11水溶液达到平衡状态。温度缓慢上升至37 ℃，凝胶成形。冷冻干燥浓度为20% PTMC11-F127-PTMC11共聚物凝胶材料，真空喷金镀膜，扫描电镜拍照。
1.3 BCA法测定P24释放
将相应质量的PTMC11-F127-PTMC11共聚物溶于800 μL预冷的4 ℃去离子水中，再将2 mg P24溶解于200 μL磷酸盐缓冲液(PBS) (10 mg/mL PBS)后加入PTMC11-F127-PTMC11溶液中，使PTMC11-F127-PTMC11共聚物的终浓度为16%、20%、25%，超声分散均匀，置于4 ℃冰箱冷存8 h，温度缓慢上升至37 ℃，凝胶成形后置于10 mL PBS中，恒温摇床轻微振荡，1、3、5、7、10、14、21、28、35、42 d收集各组上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定P24。
1.4 大鼠体内成骨实验
按1.3节描述的方法制备载P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶，其中P24 2 mg，PTMC11-F127-PTMC11共聚物浓度20%。对照组采用胶原海绵，制备5 mm×5 mm×5 mm大小的胶原海绵为支架材料，P24以磷酸盐缓冲液溶解，按照2 mg P24的剂量滴加于胶原海绵上，待其充分吸收后冻干备用。不复合P24的浓度为20%等体积PTMC11-F127-PTMC11凝胶作为空白组。将24只SD大鼠随机平均分为两个实验组，即2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶组、2 mg P24/胶原海绵组，每组八只大鼠。实验大鼠采用氯胺酮腹腔注射麻醉。在背部骶棘肌制成1 cm长肌袋，分别植入2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶、2 mg P24/胶原海绵于一侧骶棘肌肌袋内，留缝线标记植入位置中心。两组大鼠分别在植入后第4周和第6周处死4只，对植入材料的局部组织进行取材，甲醛固定后行EDTA脱钙，经石蜡包埋切片，HE染色，进行组织学观察。
2 结果
2.1 凝胶材料扫描电镜观察
PTMC11-F127-PTMC11凝胶材料冷冻干燥后扫描电镜拍照(见图 1)。电镜观察可见在材料表面及内部疏松多孔结构，孔壁呈连续交联，高倍下呈薄片状分页结构，微孔直径范围为20~40 μm(见图 1)。
图1
冻干电镜扫描PTMC11-F127-PTMC11材料
Figure1.
Scanning electron microscope of freeze-dried PTMC11-F127-PTMC11 hydrogels
2.2 多肽释放曲线
根据图 2所示BCA法检测结果绘制释放曲线分析，浓度16%的P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶第1 d释放的P24总量，多于浓度20%和25%的P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶。后两者在突释效应后缓慢释放，可持续释放1月左右，累积释放97.4%。
图2
不同浓度PTMC11-F127-PTMC11凝胶释放P24曲线
Figure2.
Release kinetics of P24 from PTMC11-F127-PTMC11 hydrogels of various copolymer concentrations in vitro
2.3 组织学切片HE染色观察
2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶组4周时可见一些间充质干细胞及一定量不成熟、散在的针状骨小梁组织，出现成熟骨陷窝和骨细胞；6周时骨小梁、骨陷窝显著增多，散在巢状分布，其表面可见成排的活跃的骨细胞。材料周围未见大量的炎性细胞。2 mg P24/胶原海绵复合材料4周时可见少量纤细网状编织骨，体积较小，呈稀疏散在分布；6周时成骨量较4周时有一定量的增加(见图 3)。
图3
组织学观察大鼠肌内异位成骨情况(HE染色,100×)
(a)P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶置入4 周；(b)P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶置入6周;(c)P24/胶原海绵置入4周；(d)P24/胶原海绵置入6周
Figure3. Samples taken for morphological study with light microscopy (HE stain,100×)(a) sample of P24/PTMC11-F127-PTMC11 obtained at 4th week; (b) sample of P24/PTMC11-F127-PTMC11 obtained at 6th week; (c) sample of collagen loaded with P24 obtained at 4th week; (d) sample of collagen loaded with P24 obtained at 6th week
3 讨论
PTMC11-F127-PTMC11嵌段共聚物胶束化首先形成纳米粒子，进一步交联形成内部疏松多孔结构，孔壁呈连续交联，多孔结构具有很好的细胞黏附性和一定的力学强度。用于给药载体时，其特点是内核载药量可调节，主要由粒子大小和粒子表面性质决定，与内核包裹的药物无关。与小分子表面活性剂相比，聚合物的临界胶束浓度很低，在水溶液中离解速度慢，因此药物可在载体内停留较长时间，保证有足够量的药物释放于靶向部位。在载体内短链多肽活性位点能充分暴露并与细胞表面受体结合，不影响其生物活性，复合后随着凝胶材料本体的逐渐降解而释放，突释效应小于PLA、PGA、PLGA、Pluronic嵌段共聚物F127的微球及微囊制剂或蛋白胶原载体等[7]，体外降解释放持续时间长达6周，基本满足多肽在体内发挥骨诱导作用时间。Altunbas等[8]研究制备的20多肽形成水凝胶，亲水性好，但载药缓释时间24 h，仅能用于短时间依赖性药物，不能满足P24作用时间。
PTMC11-F127-PTMC11凝胶作为P24的载体，通过以下三个方面来发挥其生物学活性，诱导异位成骨：① PTMC11-F127-PTMC11凝胶为多肽提供了三维空间支架，对多肽起到了缓释的作用；② 肌肉中含有成纤维细胞和间充质干细胞，PTMC11-F127-PTMC11凝胶的多孔性状能提供细胞迁移或增殖的支架，良好的细胞亲合性，有利于这些细胞的增殖，迁移，它们在多肽的调控下可能转化为成骨细胞；③ PTMC11-F127-PTMC11凝胶随时间的推移逐渐降解吸收，避免了基质材料在体内过久的残留，大大降低了机体对材料的免疫排斥反应[9]。
体内实验中2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶组组织学检查可见载体凝胶材料周围明显新骨小梁形成，具有活跃的骨细胞和发育很充分的骨小梁组织，与传统载体胶原海绵比较其骨诱导活性更强，证实了P24与BMP-2类似的异位成骨能力和骨诱导活性。
4 结论
PTMC11-F127-PTMC11凝胶基质材料作为骨组织工程材料，具有良好的生物相容性、可降解性以及降解时间的可调控性等特点。同时具有良好的温度敏感性能，可以很方便地制备成注射制剂或三维多孔支架材料。可经皮注射携载多肽的PTMC11-F127-PTMC11凝胶发挥骨诱导作用修复骨缺损，有望为临床医生治疗各种部位的骨缺损，特别是很棘手的骨延迟愈合、不愈合等提供了一种方便有效的方法。
展望：如何调节PTMC11-F127-PTMC11凝胶基质材料在力学强度、降解速度等方面特性使其成为骨组织工程理想的基质材料及载药材料仍然是研究的难点与重点[10-11]。因此，我们下一步研究是把BMP-2活性多肽与力学强度、降解速度等不同性能的凝胶材料相结合，研究其成骨的时效和量效关系，以发挥其最佳成骨能力。
引言
研究表明，天然人骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)由114个氨基酸组成，但真正发挥骨诱导作用的只是由20余个氨基酸组成的核心结构域[1]。本文作者所在课题组前期研究中通过BMP-2氨基酸序列中诱导成骨的核心功能区设计并人工合成了一种BMP-2活性肽P24。P24作为分子诱导信号，通过特定的细胞通讯与信息传递系统对细胞的黏附和向成骨方向定向分化等生物学行为调控，具有很好的骨诱导活性[2]。同时P24中包含磷酸化的丝氨酸以及天冬氨酸，能够极好地模拟天然骨基质的诱导矿化功能，在局部形成偏酸的环境，促进局部的钙、磷自组装沉积到体内局部组织中胶原纤维表面自主装矿化，生长成按同一方向排列的羟基磷灰石微型晶体结构，形成与天然骨极为相似的结构，可发挥与天然BMP-2类似的功能。以人工合成活性多肽代替其蛋白质，具有生物活性强、稳定性好、合成费用低等优点。但其成骨效应呈剂量和时间依赖性，如何使其持续有效地发挥其骨诱导作用一直是骨组织工程研究的一个难点[3]。
在多肽的载体材料方面，目前组织工程研究中应用最为广泛的是聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)及其共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]及Pluronic嵌段共聚物F127等，它们在力学强度、降解速度、细胞亲合性等各方面均不理想，并非理想的骨组织工程良好的基质材料及载药材料，限制了多肽在骨组织工程领域中进一步应用[4-5]。为了克服这些缺陷，Zhang等[6]在Pluronic嵌段共聚物F127分子链中引入疏水链段聚三甲基碳酸酯[poly(trimethylene carbonate),PTMC]链段，设计制备了聚三甲基碳酸酯-(聚氧乙烯)-聚三甲基碳酸酯[(poly(trimethylene carbonate)-F127-poly(trimethylene carbonate),PTMC11-F127-PTMC11]共聚物，获得比较好的水溶性。直接将共聚物在低温时(4 ℃)溶于水相介质，升温至室温，两亲性嵌段共聚物在水介质中通过自组装形成具有亲水外壳和疏水内核的胶束，进一步交联形成透明稳定的水凝胶，可缓慢降解，且理化特性可调节。
1 材料与方法
1.1 实验材料和仪器
PTMC11-F127-PTMC11多聚物材料由中山大学化学化工学院高分子研究所全大萍教授等制备：以Sn(Oct)2为催化剂，F127为大分子共引发剂进行trimethylene carbonate (TMC)的开环聚合，合成符合设计结构的PTMC11-F127-PTMC11嵌段共聚物；BMP-2活性多肽P24(委托吉尔生化公司合成,上海)；低温冻干机(VFD-2000，比朗，上海)、环境扫描电镜(Quanta 200,FEI,荷兰)、超声分散器、胶原海绵(孔率为88%，孔径200~300 μm，博士德，武汉)、真空干燥箱(大连第四仪表厂)；雄性SD大鼠,体重为(150±20) g (华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)。
1.2 凝胶制备与检测
取2 mg PTMC11-F127-PTMC11共聚物溶于1 mL预冷的4 ℃去离子水中，使PTMC11-F127-PTMC11共聚物的质量百分终浓度为20%，超声分散均匀，置于4 ℃冰箱冷存8 h，使PTMC11-F127-PTMC11水溶液达到平衡状态。温度缓慢上升至37 ℃，凝胶成形。冷冻干燥浓度为20% PTMC11-F127-PTMC11共聚物凝胶材料，真空喷金镀膜，扫描电镜拍照。
1.3 BCA法测定P24释放
将相应质量的PTMC11-F127-PTMC11共聚物溶于800 μL预冷的4 ℃去离子水中，再将2 mg P24溶解于200 μL磷酸盐缓冲液(PBS) (10 mg/mL PBS)后加入PTMC11-F127-PTMC11溶液中，使PTMC11-F127-PTMC11共聚物的终浓度为16%、20%、25%，超声分散均匀，置于4 ℃冰箱冷存8 h，温度缓慢上升至37 ℃，凝胶成形后置于10 mL PBS中，恒温摇床轻微振荡，1、3、5、7、10、14、21、28、35、42 d收集各组上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定P24。
1.4 大鼠体内成骨实验
按1.3节描述的方法制备载P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶，其中P24 2 mg，PTMC11-F127-PTMC11共聚物浓度20%。对照组采用胶原海绵，制备5 mm×5 mm×5 mm大小的胶原海绵为支架材料，P24以磷酸盐缓冲液溶解，按照2 mg P24的剂量滴加于胶原海绵上，待其充分吸收后冻干备用。不复合P24的浓度为20%等体积PTMC11-F127-PTMC11凝胶作为空白组。将24只SD大鼠随机平均分为两个实验组，即2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶组、2 mg P24/胶原海绵组，每组八只大鼠。实验大鼠采用氯胺酮腹腔注射麻醉。在背部骶棘肌制成1 cm长肌袋，分别植入2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶、2 mg P24/胶原海绵于一侧骶棘肌肌袋内，留缝线标记植入位置中心。两组大鼠分别在植入后第4周和第6周处死4只，对植入材料的局部组织进行取材，甲醛固定后行EDTA脱钙，经石蜡包埋切片，HE染色，进行组织学观察。
2 结果
2.1 凝胶材料扫描电镜观察
PTMC11-F127-PTMC11凝胶材料冷冻干燥后扫描电镜拍照(见图 1)。电镜观察可见在材料表面及内部疏松多孔结构，孔壁呈连续交联，高倍下呈薄片状分页结构，微孔直径范围为20~40 μm(见图 1)。
图1
冻干电镜扫描PTMC11-F127-PTMC11材料
Figure1.
Scanning electron microscope of freeze-dried PTMC11-F127-PTMC11 hydrogels
2.2 多肽释放曲线
根据图 2所示BCA法检测结果绘制释放曲线分析，浓度16%的P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶第1 d释放的P24总量，多于浓度20%和25%的P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶。后两者在突释效应后缓慢释放，可持续释放1月左右，累积释放97.4%。
图2
不同浓度PTMC11-F127-PTMC11凝胶释放P24曲线
Figure2.
Release kinetics of P24 from PTMC11-F127-PTMC11 hydrogels of various copolymer concentrations in vitro
2.3 组织学切片HE染色观察
2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶组4周时可见一些间充质干细胞及一定量不成熟、散在的针状骨小梁组织，出现成熟骨陷窝和骨细胞；6周时骨小梁、骨陷窝显著增多，散在巢状分布，其表面可见成排的活跃的骨细胞。材料周围未见大量的炎性细胞。2 mg P24/胶原海绵复合材料4周时可见少量纤细网状编织骨，体积较小，呈稀疏散在分布；6周时成骨量较4周时有一定量的增加(见图 3)。
图3
组织学观察大鼠肌内异位成骨情况(HE染色,100×)
(a)P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶置入4 周；(b)P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶置入6周;(c)P24/胶原海绵置入4周；(d)P24/胶原海绵置入6周
Figure3. Samples taken for morphological study with light microscopy (HE stain,100×)(a) sample of P24/PTMC11-F127-PTMC11 obtained at 4th week; (b) sample of P24/PTMC11-F127-PTMC11 obtained at 6th week; (c) sample of collagen loaded with P24 obtained at 4th week; (d) sample of collagen loaded with P24 obtained at 6th week
3 讨论
PTMC11-F127-PTMC11嵌段共聚物胶束化首先形成纳米粒子，进一步交联形成内部疏松多孔结构，孔壁呈连续交联，多孔结构具有很好的细胞黏附性和一定的力学强度。用于给药载体时，其特点是内核载药量可调节，主要由粒子大小和粒子表面性质决定，与内核包裹的药物无关。与小分子表面活性剂相比，聚合物的临界胶束浓度很低，在水溶液中离解速度慢，因此药物可在载体内停留较长时间，保证有足够量的药物释放于靶向部位。在载体内短链多肽活性位点能充分暴露并与细胞表面受体结合，不影响其生物活性，复合后随着凝胶材料本体的逐渐降解而释放，突释效应小于PLA、PGA、PLGA、Pluronic嵌段共聚物F127的微球及微囊制剂或蛋白胶原载体等[7]，体外降解释放持续时间长达6周，基本满足多肽在体内发挥骨诱导作用时间。Altunbas等[8]研究制备的20多肽形成水凝胶，亲水性好，但载药缓释时间24 h，仅能用于短时间依赖性药物，不能满足P24作用时间。
PTMC11-F127-PTMC11凝胶作为P24的载体，通过以下三个方面来发挥其生物学活性，诱导异位成骨：① PTMC11-F127-PTMC11凝胶为多肽提供了三维空间支架，对多肽起到了缓释的作用；② 肌肉中含有成纤维细胞和间充质干细胞，PTMC11-F127-PTMC11凝胶的多孔性状能提供细胞迁移或增殖的支架，良好的细胞亲合性，有利于这些细胞的增殖，迁移，它们在多肽的调控下可能转化为成骨细胞；③ PTMC11-F127-PTMC11凝胶随时间的推移逐渐降解吸收，避免了基质材料在体内过久的残留，大大降低了机体对材料的免疫排斥反应[9]。
体内实验中2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝胶组组织学检查可见载体凝胶材料周围明显新骨小梁形成，具有活跃的骨细胞和发育很充分的骨小梁组织，与传统载体胶原海绵比较其骨诱导活性更强，证实了P24与BMP-2类似的异位成骨能力和骨诱导活性。
4 结论
PTMC11-F127-PTMC11凝胶基质材料作为骨组织工程材料，具有良好的生物相容性、可降解性以及降解时间的可调控性等特点。同时具有良好的温度敏感性能，可以很方便地制备成注射制剂或三维多孔支架材料。可经皮注射携载多肽的PTMC11-F127-PTMC11凝胶发挥骨诱导作用修复骨缺损，有望为临床医生治疗各种部位的骨缺损，特别是很棘手的骨延迟愈合、不愈合等提供了一种方便有效的方法。
展望：如何调节PTMC11-F127-PTMC11凝胶基质材料在力学强度、降解速度等方面特性使其成为骨组织工程理想的基质材料及载药材料仍然是研究的难点与重点[10-11]。因此，我们下一步研究是把BMP-2活性多肽与力学强度、降解速度等不同性能的凝胶材料相结合，研究其成骨的时效和量效关系，以发挥其最佳成骨能力。
