早期生物起搏的研究大都围绕HCN通道展开,通过增强If 电流来构建生物起搏器,近年来人们发现Tbx3基因在心脏传导系统尤其是窦房结的分化成熟及功能维持中发挥着重要作用,能够进一步优化生物起搏器,有可能成为生物起搏及心脏传导系统疾病新的治疗靶点。本文总结近年来Tbx3在生物起搏中的一些最新研究进展,希望为今后Tbx3的临床应用提供理论依据。
引用本文： 李勇, 李宾公. Tbx3在生物起搏中的研究进展. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(4): 923-926. doi: 10.7507/1001-5515.20140173 复制
引言
目前对于病窦综合征等心动过缓疾病，主要采用植入电子起搏器来治疗，虽然电子起搏器在技术上已相当成熟，但仍存在电池寿命有限、电极脱位、缺乏对神经激素自动反应性，不能达到真正意义上的生理起搏等固有缺陷。因此人们把目光放在更接近心脏生理功能的生物起搏器研究上。心脏生物起搏是指利用分子生物学及组织工程学相关技术对心脏受损的自律性节律点或特殊传导系统的细胞进行修复或替代，使心脏的起搏或传导功能得以恢复，目前主要采用基因治疗和细胞治疗来构建生物起搏器。早期的研究大都通过HCN通道增强If 电流来构建生物起搏器，近年来越来越多的证据发现，在窦房结细胞的分化成熟中Tbx3发挥着重要作用[1]，而且这一功能还可用于生物起搏的治疗，能够进一步优化生物起搏器，而这已成为目前生物起搏的研究热点之一。现就Tbx3在目前生物起搏中的研究进展做一综述。
1 Tbx3基因及其生物学特性
Tbx基因家族[T-box]是近几年研究较多的一类在脊椎动物胚胎发育中起着重要调节作用的转录因子，其家族成员包括Tbx1、Tbx2、Tbx3、Tbx5、Tbx18、Tbx20等，其中多个基因广泛参与心脏的生长发育过程，在脊椎动物早期心脏发育中发挥着非常重要的时间、空间调节作用。Tbx3基因位于染色体12q24.1上，同源基因位于5号染色体，全长为9.0 kb,至少包括6个外显子，在进化上具有高度保守性，在胚胎形成时期多个组织及器官均有表达。目前的研究发现，剔去Tbx3基因的小鼠在胚胎发育的11～14 d均因心脏发育障碍而流产死亡，而Tbx3基因突变的小鼠则出现了尺骨乳腺综合症并伴有先天性心脏发育异常[2]。这说明Tbx3基因在脊椎动物心血管系统、四肢、乳腺等器官的发育中均发挥着重要作用。
1.1 Tbx3基因在心脏传导系统发育中的作用
哺乳动物心脏传导系统是由窦房结、房室结、希氏束、左右心室束、浦肯野纤维细胞等组成。目前对心脏传导系统的发育，尤其是窦房结的发育不是完全清楚。有研究表明心脏传导系统的细胞可能直接来自于中胚层的前体细胞，迁移到心脏形成心脏的传导系统[3]。其中转录因子Tbx3与心脏其它早期转录因子如Nkx2.5、GATA4、Shox2等相互作用形成心脏发育特殊的核心转录调控网络(cardiac-specific gene regulatory network)[4]，作用于早期心脏发育的各个阶段，调控心脏细胞，保证了正常窦房结组织的分化、成熟。
Hoogaars等[5]发现在鸡与鼠的胚胎发育的第9.5～10 d，在窦房结形成前，Tbx3在原始心管和房室通道中表达，同时伴有起搏基因HCN4的明显升高，推测Tbx3可能与心脏传导系统发育密切相关。Sizarov等[6]发现在人早期心脏的发育过程中，在静脉窦、房室管、流出道的部分区域，Tbx3可抑制心脏前体细胞向房室工作肌分化，增强起搏相关基因的表达,并且通过分析心脏在发育中的分子组成，进一步证实了Tbx3在人心脏发育中能够促进窦房结细胞的分化成熟[7]。
Singh等[8]通过基因芯片技术分析敲除或上调Tbx3基因的大鼠胚胎模型发现，在早期心脏发育中，Tbx3是一种较强的转录抑制剂，在局部可以直接抑制心房心室相关标记基因的表达，并通过激活起搏相关基因，与Tbx2协同调节细胞向起搏类细胞分化，在起搏类细胞的发育成熟中发挥重要作用。Wiese等[9]通过观察Tbx3或Tbx18基因突变的小鼠心脏传导系统的发育发现，Tbx18基因突变形成的窦房结在形态学上明显发育不良，而在功能上基本正常；而Tbx3基因突变形成的窦房结在形态学上基本正常、但无正常窦房结功能。据此推测Tbx3和Tbx18基因在窦房结的发育中相继发挥作用，Tbx18动员心脏前体细胞在形态学上分化为窦房结，随后Tbx3在启动起搏细胞的分化程序中发挥着关键作用，调控着起搏细胞的最终分化成熟[10]。
1.2 Tbx3在成熟心脏窦房结中的表达
哺乳动物成熟窦房结是一种被称为逗点样的细长结构，头部较大，位于右上腔静脉与右心房的连接处，尾部较小，终止于右心耳与右心房侧壁交界处。目前的研究表明，成熟窦房结不同部位的组织结构及功能各不相同。Wiese等通过重建小鼠窦房结三维形态模型发现，窦房结头部主要表达Tbx18、Tbx3、HCN4基因,不表达Nkx2.5基因，尾部则表达较高的Tbx3和HCN4，Nkx2.5低表达，不表达Tbx18，同时尾部含有大量起搏细胞。Greener等[11]通过实时定量PCR(quantitative real-time PCR,QRT-PCR)、免疫组化分析人心脏传导系统的分子组成发现，Tbx3在窦房结等心脏传导系统中有较高表达，而在心房、心室等工作肌中表达较低。目前大量研究表明Tbx3基因在窦房结内特异性地持续稳定表达,并对窦房结细胞的功能维持发挥着关键作用，常和HCN4作为起搏组织的标志基因[12]。此外还有研究提示，Tbx3的表达异常与某些心脏传导系统疾病的产生密切相关[13]，今后可能作为某些心脏传导系统疾病的遗传标记[14]，为未来这些疾病的诊断及治疗提供了新的方向。
2 Tbx3在生物起搏中的应用
Hoogaars等将Tbx3基因注射入大鼠右心房发现异位表达的Tbx3能抑制心房相关基因如Cx40、Nppa等表达，明显提高起搏基因HCN4的表达，并且足够形成心脏异位起搏点，导致出现心律失常。此外通过Tbx3突变的大鼠胚胎模型发现，Tbx3的正常表达也是维持窦房结功能稳定所必须的。
Bakker等[15]在体内及体外构建超表达Tbx3的心室肌细胞模型，通过基因芯片技术、QRT-PCR、膜片钳检查等发现，Tbx3不但在心脏起搏组织的发育中发挥重要作用，而且还能够重新设定成熟心肌细胞的基因程序，使其分化为起搏样细胞，今后可用于修复或新建心脏起搏点。Zhu等[16]发现在胚胎干细胞体外心肌样分化过程干预NRG-1/ErbB通路可以提高Tbx3的表达,而Tbx3通过提高窦房结相关基因表达促进干细胞向窦房结样细胞分化,并能检测到窦房结样动作电位，可用于今后生物起搏的研究。
3 Tbx3优化生物起搏器
缝隙连接蛋白(connexin,Cx)组成的缝隙连接通道，是心肌细胞间信号传导的主要渠道，心肌组织中由于各自Cx的不同，决定了各自不同的传导速度。窦房结的中心部分主要表达传导性低的Cx45，保证了窦房结中心部分的起搏细胞由于低传导性而不被邻近心房肌超极化所抑制，向外则传导性逐渐增强，与之相邻的心房肌则以Cx43及Cx40为主，而Cx43及Cx40也大量存在于心室及心房肌间，缝隙连接蛋白在心脏中的分布特征，对窦房结的正常起搏及电信号的正常传导具有重要的保护作用。如果在今后的生物起搏器周围能够模拟窦房结周围的缝隙连接蛋白分布特征，则有望进一步提高生物起搏器的起搏效率。细胞学研究表明，Cx通道是动态的、可被精细调节的[17]，而Tbx3也参与了这一调节并发挥着重要作用。Boogerd等[18]通过对斑马鱼心脏转染Tbx3基因发现，它能够抑制在移植部位传导性较强的Cx43、Cx40等缝隙连接蛋白的表达。Bakker等发现Tbx3可通过改变心肌细胞间Cx的表达,上调低传导性的Cx45在移植部位的表达，使Cx45更加符合窦房结内的生理分布，有望改善移植细胞起搏心室的效果，进一步优化生物起搏器。
4 Tbx3的上下游信号通路
心脏的发育受一个核心转录网络的调控，该调控网络将上游诱导信号与下游调控基因联系起来，控制心脏前体细胞的定向分化,而Tbx3虽然不是传导系统唯一的调节因子，但是其中一个与窦房结起搏功能密切相关的关键调节点。Nkx2.5是脊椎动物心脏发育的早期标志物之一,其作用贯穿于心脏发育的各个阶段,是包括传导系统在内的心肌细胞定向分化的重要前提。Espinoza等[19]通过观察超表达Shox2的非洲蟾蜍心脏发育，发现当Shox2基因增强时可激活Tbx3基因、抑制Nkx2.5的表达,并伴有起搏基因HCN4表达明显增强，心房标记基因Nppa、Cx40的表达明显下降，反之Shox2基因突变的小鼠胚胎则出现窦房结发育障碍，在胚胎发育的第11.5～13.5 d流产死亡。此外，还有研究发现当小鼠胚胎Nkx2.5持续高表达时，则可抑制心脏前体细胞向窦房结细胞分化,而心房心室工作肌相关基因表达明显增强[20]。有趣的是Puskaric等[21]还发现当Nkx2.5高表达时还可以激活Shox2的表达。此外还有研究发现内皮素-1(Endothelin-1)也能上调Tbx3基因的表达，促进由胚胎干细胞分化而来的心脏前体细胞向窦房结细胞分化[22]。
5 存在的问题
目前Tbx3在脊椎动物早期窦房结发育中的作用已被越来越多的研究者所认可，并将其用于生物起搏及心脏传导系统疾病的研究。但也有研究发现适当强度的Tbx3能够抑制抑癌基因p14ARF等细胞周期调节因子的表达[23]，促进细胞的自我更新[24]，可能与肿瘤的发生密切相关[25]。此外，Tbx3通过调节心脏的起搏及传导，相关基因还可导致新的心脏传导系统疾病及心律失常[26]，因此Tbx3的生物安全性还有待进一步研究。
6 展望
目前随着生物起搏研究的不断深入，生物起搏器在治疗缓慢性心律失常上的可行性越来越大，但诸多研究尚处于动物实验的初级阶段,在持久性、稳定性方面与正常窦房结仍有明显差距，在起搏功能上还达不到高效、稳定。而Tbx3能够促进干细胞及心脏前体细胞向窦房结样细胞分化，增强并维持起搏相关基因的表达，优化起搏组织周围缝隙连接蛋白的表达，对起搏功能的稳定与维持发挥着重要作用，有利于今后性能持久稳定的新型生物起搏器的获得,也可能为今后某些心脏传导系统疾病的治疗提供新的靶点，是未来生物起搏研究另一重要调节点。
引言
目前对于病窦综合征等心动过缓疾病，主要采用植入电子起搏器来治疗，虽然电子起搏器在技术上已相当成熟，但仍存在电池寿命有限、电极脱位、缺乏对神经激素自动反应性，不能达到真正意义上的生理起搏等固有缺陷。因此人们把目光放在更接近心脏生理功能的生物起搏器研究上。心脏生物起搏是指利用分子生物学及组织工程学相关技术对心脏受损的自律性节律点或特殊传导系统的细胞进行修复或替代，使心脏的起搏或传导功能得以恢复，目前主要采用基因治疗和细胞治疗来构建生物起搏器。早期的研究大都通过HCN通道增强If 电流来构建生物起搏器，近年来越来越多的证据发现，在窦房结细胞的分化成熟中Tbx3发挥着重要作用[1]，而且这一功能还可用于生物起搏的治疗，能够进一步优化生物起搏器，而这已成为目前生物起搏的研究热点之一。现就Tbx3在目前生物起搏中的研究进展做一综述。
1 Tbx3基因及其生物学特性
Tbx基因家族[T-box]是近几年研究较多的一类在脊椎动物胚胎发育中起着重要调节作用的转录因子，其家族成员包括Tbx1、Tbx2、Tbx3、Tbx5、Tbx18、Tbx20等，其中多个基因广泛参与心脏的生长发育过程，在脊椎动物早期心脏发育中发挥着非常重要的时间、空间调节作用。Tbx3基因位于染色体12q24.1上，同源基因位于5号染色体，全长为9.0 kb,至少包括6个外显子，在进化上具有高度保守性，在胚胎形成时期多个组织及器官均有表达。目前的研究发现，剔去Tbx3基因的小鼠在胚胎发育的11～14 d均因心脏发育障碍而流产死亡，而Tbx3基因突变的小鼠则出现了尺骨乳腺综合症并伴有先天性心脏发育异常[2]。这说明Tbx3基因在脊椎动物心血管系统、四肢、乳腺等器官的发育中均发挥着重要作用。
1.1 Tbx3基因在心脏传导系统发育中的作用
哺乳动物心脏传导系统是由窦房结、房室结、希氏束、左右心室束、浦肯野纤维细胞等组成。目前对心脏传导系统的发育，尤其是窦房结的发育不是完全清楚。有研究表明心脏传导系统的细胞可能直接来自于中胚层的前体细胞，迁移到心脏形成心脏的传导系统[3]。其中转录因子Tbx3与心脏其它早期转录因子如Nkx2.5、GATA4、Shox2等相互作用形成心脏发育特殊的核心转录调控网络(cardiac-specific gene regulatory network)[4]，作用于早期心脏发育的各个阶段，调控心脏细胞，保证了正常窦房结组织的分化、成熟。
Hoogaars等[5]发现在鸡与鼠的胚胎发育的第9.5～10 d，在窦房结形成前，Tbx3在原始心管和房室通道中表达，同时伴有起搏基因HCN4的明显升高，推测Tbx3可能与心脏传导系统发育密切相关。Sizarov等[6]发现在人早期心脏的发育过程中，在静脉窦、房室管、流出道的部分区域，Tbx3可抑制心脏前体细胞向房室工作肌分化，增强起搏相关基因的表达,并且通过分析心脏在发育中的分子组成，进一步证实了Tbx3在人心脏发育中能够促进窦房结细胞的分化成熟[7]。
Singh等[8]通过基因芯片技术分析敲除或上调Tbx3基因的大鼠胚胎模型发现，在早期心脏发育中，Tbx3是一种较强的转录抑制剂，在局部可以直接抑制心房心室相关标记基因的表达，并通过激活起搏相关基因，与Tbx2协同调节细胞向起搏类细胞分化，在起搏类细胞的发育成熟中发挥重要作用。Wiese等[9]通过观察Tbx3或Tbx18基因突变的小鼠心脏传导系统的发育发现，Tbx18基因突变形成的窦房结在形态学上明显发育不良，而在功能上基本正常；而Tbx3基因突变形成的窦房结在形态学上基本正常、但无正常窦房结功能。据此推测Tbx3和Tbx18基因在窦房结的发育中相继发挥作用，Tbx18动员心脏前体细胞在形态学上分化为窦房结，随后Tbx3在启动起搏细胞的分化程序中发挥着关键作用，调控着起搏细胞的最终分化成熟[10]。
1.2 Tbx3在成熟心脏窦房结中的表达
哺乳动物成熟窦房结是一种被称为逗点样的细长结构，头部较大，位于右上腔静脉与右心房的连接处，尾部较小，终止于右心耳与右心房侧壁交界处。目前的研究表明，成熟窦房结不同部位的组织结构及功能各不相同。Wiese等通过重建小鼠窦房结三维形态模型发现，窦房结头部主要表达Tbx18、Tbx3、HCN4基因,不表达Nkx2.5基因，尾部则表达较高的Tbx3和HCN4，Nkx2.5低表达，不表达Tbx18，同时尾部含有大量起搏细胞。Greener等[11]通过实时定量PCR(quantitative real-time PCR,QRT-PCR)、免疫组化分析人心脏传导系统的分子组成发现，Tbx3在窦房结等心脏传导系统中有较高表达，而在心房、心室等工作肌中表达较低。目前大量研究表明Tbx3基因在窦房结内特异性地持续稳定表达,并对窦房结细胞的功能维持发挥着关键作用，常和HCN4作为起搏组织的标志基因[12]。此外还有研究提示，Tbx3的表达异常与某些心脏传导系统疾病的产生密切相关[13]，今后可能作为某些心脏传导系统疾病的遗传标记[14]，为未来这些疾病的诊断及治疗提供了新的方向。
2 Tbx3在生物起搏中的应用
Hoogaars等将Tbx3基因注射入大鼠右心房发现异位表达的Tbx3能抑制心房相关基因如Cx40、Nppa等表达，明显提高起搏基因HCN4的表达，并且足够形成心脏异位起搏点，导致出现心律失常。此外通过Tbx3突变的大鼠胚胎模型发现，Tbx3的正常表达也是维持窦房结功能稳定所必须的。
Bakker等[15]在体内及体外构建超表达Tbx3的心室肌细胞模型，通过基因芯片技术、QRT-PCR、膜片钳检查等发现，Tbx3不但在心脏起搏组织的发育中发挥重要作用，而且还能够重新设定成熟心肌细胞的基因程序，使其分化为起搏样细胞，今后可用于修复或新建心脏起搏点。Zhu等[16]发现在胚胎干细胞体外心肌样分化过程干预NRG-1/ErbB通路可以提高Tbx3的表达,而Tbx3通过提高窦房结相关基因表达促进干细胞向窦房结样细胞分化,并能检测到窦房结样动作电位，可用于今后生物起搏的研究。
3 Tbx3优化生物起搏器
缝隙连接蛋白(connexin,Cx)组成的缝隙连接通道，是心肌细胞间信号传导的主要渠道，心肌组织中由于各自Cx的不同，决定了各自不同的传导速度。窦房结的中心部分主要表达传导性低的Cx45，保证了窦房结中心部分的起搏细胞由于低传导性而不被邻近心房肌超极化所抑制，向外则传导性逐渐增强，与之相邻的心房肌则以Cx43及Cx40为主，而Cx43及Cx40也大量存在于心室及心房肌间，缝隙连接蛋白在心脏中的分布特征，对窦房结的正常起搏及电信号的正常传导具有重要的保护作用。如果在今后的生物起搏器周围能够模拟窦房结周围的缝隙连接蛋白分布特征，则有望进一步提高生物起搏器的起搏效率。细胞学研究表明，Cx通道是动态的、可被精细调节的[17]，而Tbx3也参与了这一调节并发挥着重要作用。Boogerd等[18]通过对斑马鱼心脏转染Tbx3基因发现，它能够抑制在移植部位传导性较强的Cx43、Cx40等缝隙连接蛋白的表达。Bakker等发现Tbx3可通过改变心肌细胞间Cx的表达,上调低传导性的Cx45在移植部位的表达，使Cx45更加符合窦房结内的生理分布，有望改善移植细胞起搏心室的效果，进一步优化生物起搏器。
4 Tbx3的上下游信号通路
心脏的发育受一个核心转录网络的调控，该调控网络将上游诱导信号与下游调控基因联系起来，控制心脏前体细胞的定向分化,而Tbx3虽然不是传导系统唯一的调节因子，但是其中一个与窦房结起搏功能密切相关的关键调节点。Nkx2.5是脊椎动物心脏发育的早期标志物之一,其作用贯穿于心脏发育的各个阶段,是包括传导系统在内的心肌细胞定向分化的重要前提。Espinoza等[19]通过观察超表达Shox2的非洲蟾蜍心脏发育，发现当Shox2基因增强时可激活Tbx3基因、抑制Nkx2.5的表达,并伴有起搏基因HCN4表达明显增强，心房标记基因Nppa、Cx40的表达明显下降，反之Shox2基因突变的小鼠胚胎则出现窦房结发育障碍，在胚胎发育的第11.5～13.5 d流产死亡。此外，还有研究发现当小鼠胚胎Nkx2.5持续高表达时，则可抑制心脏前体细胞向窦房结细胞分化,而心房心室工作肌相关基因表达明显增强[20]。有趣的是Puskaric等[21]还发现当Nkx2.5高表达时还可以激活Shox2的表达。此外还有研究发现内皮素-1(Endothelin-1)也能上调Tbx3基因的表达，促进由胚胎干细胞分化而来的心脏前体细胞向窦房结细胞分化[22]。
5 存在的问题
目前Tbx3在脊椎动物早期窦房结发育中的作用已被越来越多的研究者所认可，并将其用于生物起搏及心脏传导系统疾病的研究。但也有研究发现适当强度的Tbx3能够抑制抑癌基因p14ARF等细胞周期调节因子的表达[23]，促进细胞的自我更新[24]，可能与肿瘤的发生密切相关[25]。此外，Tbx3通过调节心脏的起搏及传导，相关基因还可导致新的心脏传导系统疾病及心律失常[26]，因此Tbx3的生物安全性还有待进一步研究。
6 展望
目前随着生物起搏研究的不断深入，生物起搏器在治疗缓慢性心律失常上的可行性越来越大，但诸多研究尚处于动物实验的初级阶段,在持久性、稳定性方面与正常窦房结仍有明显差距，在起搏功能上还达不到高效、稳定。而Tbx3能够促进干细胞及心脏前体细胞向窦房结样细胞分化，增强并维持起搏相关基因的表达，优化起搏组织周围缝隙连接蛋白的表达，对起搏功能的稳定与维持发挥着重要作用，有利于今后性能持久稳定的新型生物起搏器的获得,也可能为今后某些心脏传导系统疾病的治疗提供新的靶点，是未来生物起搏研究另一重要调节点。