本研究目的为探究γ-分泌酶抑制剂DAPT(3, 5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S苯基甘氨酸t-丁酯)对神经元前体细胞系分化的影响, 检验经DAPT诱导产生更多可用于移植的神经元的可能性。培养神经元前体细胞系GE6时, 以培养基中加入4μmol/L DAPT的为实验组, 不加DAPT的为对照组, 分化4 d, 采用免疫荧光染色的方法分别检测两组细胞Tuj1、GFAP、O4的阳性率, 采用qRT-PCR分别检测两组细胞Tuj1 mRNA、GFAP mRNA相对表达量。免疫荧光染色表明实验组Tuj1阳性率较对照组增加, 而GFAP和O4的阳性率较对照组减少, 这些差异均有统计学意义(P＜0.05)。qRT-PCR中两组Tuj1和GFAP mRNA的变化趋势与免疫荧光染色结果一致。结果提示DAPT能促进神经元前体细胞系向神经元分化, 抑制其向胶质细胞分化, 可以用DAPT诱导产生更多的可用于移植的神经元。
引用本文： 王琪, 李赫冬. γ-分泌酶抑制剂DAPT对神经前体细胞系分化的作用研究. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(1): 126-130. doi: 10.7507/1001-5515.20150023 复制
引言
神经退行性疾病(neurodegeneration)是指一类发生在中枢神经系统(central nervous system, CNS)中神经元减少的疾病。中枢神经系统发育成熟以后，神经元便不能再生，这种神经元的减少往往不可逆[1]。因此，这一类疾病会给患者造成严重的功能障碍。此外，癫痫等疾病的发生与神经元缺失也有直接关系[2]。理论上，我们可以将神经干细胞或者神经元移植到受损的神经系统，替代死亡的神经元，重建神经环路，改善症状，从而对这些疾病进行治疗。已经有很多人尝试了对这些疾病进行神经干细胞移植治疗[3-5]，但仍处于实验室阶段，在走向临床应用前还有许多问题亟待解决。其中移植所需的细胞来源便是一个关键问题。
Notch信号通路和细胞连接以及信号传递息息相关，它能使细胞保持干性，且广泛存在于各种生命过程中。在Notch信号通路激活过程中，γ-分泌酶复合物是一个关键因素[6]。研究发现，γ-分泌酶复合物抑制剂——DAPT(3, 5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S苯基甘氨酸t-丁酯)可以抑制Notch信号通路激活。体内试验证明，发育过程中DAPT可通过抑制Notch信号通路激活以促进神经元生成[7-8]。
GE6来自于自带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的胚胎期大鼠的大脑，经过病毒感染和单克隆筛选得到。实验表明，GE6在体外可以分化成特定的神经元，且具有电生理活性[9]。GE6细胞系有望成为干细胞移植的细胞来源，治疗相关疾病。本文欲通过一系列实验，研究DAPT阻断Notch信号通路对GE6分化的影响，检测能否通过DAPT的处理使GE6更多地分化为神经元，为相关细胞移植提供一个更为高效的细胞来源。
本次实验中主要涉及以下相关蛋白或基因。神经特异性贝塔微管蛋白Ⅲ(neuronal classⅢβ-Tubulin，Tuj1)是微管蛋白的一种，是一种神经元特有的微管蛋白。Tuj1在神经轴突的伸展和保持过程中有着很重要的作用，并且参与了神经元形成。Tuj1是神经元特异性标志物。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是一种由GFAP基因编码的中间纤维蛋白，在细胞骨架的构成和功能的行使中起很重要的作用。通常认为GFAP能够维持细胞的机械力和细胞形态。在中枢神经系统中，GFAP还参与了比如细胞间的信号传递和血脑屏障的构成等许多重要过程。GFAP在星形胶质细胞中大量而广泛地表达，所以在神经生物学研究当中通常将其作为星形胶质细胞特异性标志物[10]。少突胶质细胞标志物O4(oligodendrocyte marker O4)是一种少突胶质细胞所特有的糖脂类物质，存在于细胞膜上。可以作为少突胶质细胞的特异性标志物，用于识别少突胶质细胞。本实验通过检测上述相关标志物表达情况来检测细胞分化情况。
1 材料和方法
1.1 实验材料
GE6细胞系由四川大学李赫冬实验室[9]提供。加葡萄糖、双抗的DMEM/F12培养基(Invitrogen公司，美国)；肝素(Heprin，Sigma公司，美国)；B27(Invitrogen公司，美国)；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Preprotech公司，英国)；DAPT(Sigma公司，美国); 神经元标志物Tuj1(mouse)抗体(AVES LABS公司，美国)；星形胶质细胞标志物GFAP(chicken)抗体(AVES LABS公司，美国)；少突胶质细胞标志物O4(mouse)抗体(Millipore公司，德国)；4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司，美国)；反转录试剂盒(PrimeScript RT, TaKaRa公司，日本)；荧光qRT-PCR试剂盒(iQTM SYBR Green Supermix，BIO-RAD公司，美国)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
GE6用10 mL含有bFGF、Heprin、B27、葡萄糖和双抗的DMEM/F12生长培养基悬浮培养。细胞密度为1×106个每培养皿(100 mm)。培养条件为37℃、5% CO2及饱和湿度。复苏后第二天每培养皿补加1 mL 10倍浓度的bFGF培养基，3 d传代一次。
1.2.2 实验处理
6孔板和放入圆形盖玻片的24孔板预先经过多聚赖氨酸和层粘连蛋白处理。GE6细胞稀释至3 000个/μL，吸取10μL含细胞的培养基接种于24孔板中的盖玻片上，培养箱中放置1 h后，补加500μL的生长培养基。24 h后分别换上500μL含4μmol/L DAPT(实验组)和不含DAPT(对照组)的分化培养基(含有B27、葡萄糖和双抗的DMEM/F12培养基)。培养4 d后，细胞爬片用4%多聚甲醛固定后，换上磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)浸泡保存，待用。6孔板中操作与24孔板操作大致相同。接种细胞密度为10 000个/μL，接种100μL含细胞的培养基。补加的生长培养基和分化培养基分别为2 mL，培养4 d后，细胞用Trizol收集，保存于-20℃，待用。
1.2.3 免疫荧光染色
在实验中使用的抗体分别为神经元特异性Tuj1抗体；星形胶质细胞特异性GFAP抗体；少突胶质细胞特异性O4抗体。取出PBS中保存的细胞爬片，PBS洗3次，加入按比例稀释的一抗(Tuj1 1 :400；GFAP 1 :1 000；O4 1 :50)室温孵育2 h，PBS-Tween 20(PBST)洗3次，加对应的按比例稀释的二抗(1 :500)以及DAPI(1 :1 000)室温孵育1 h后PBST洗3次，封片。本次实验中，Tuj1使用山羊抗鼠二抗(CY5)，GFAP使用山羊抗鸡二抗(CY5)，O4使用山羊抗鼠二抗(CY3)。O4染色时，将所有用到的PBST用PBS代替。片子晾干后，在荧光倒置显微镜下照相。将各个通道得到的图片进行合并，然后计数。每次实验选取3个视野计数，计数结果取平均数。然后计算各个抗体的阳性率(n≥3)。比如，Tuj1阳性率=Tuj1阳性细胞数/细胞总数(即绿色细胞数)。
1.2.4 qRT-PCR
实验选用GAPDH为内参，上游引物5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′；下游引物：5′-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3′。Tuj1上游引物：5′-GGCCTTTGGACACCTATTCAG-3′；下游引物：5′-TCTCACATTCTTTCCTCACG-AC-3′。GFAP上游引物：5′-GACTTTCTCCAAC-CTCCAGATC-3′；下游引物：5′-CTCCTGCTTC-GACTCCTTAATG-3′。O4没有相应的mRNA，故此处不做检测。引物由上海捷瑞生物工程有限公司提供。首先将Trizol收取的细胞样品提取总RNA，进行含量测定。然后用反转录试剂盒进行cDNA反转，反转采用10μL体系，RNA总量为500 ng。反转得到的cDNA用来进行定量检测。qRT-PCR采用10μL体系：预混液5μL，cDNA 50倍稀释后取4.4μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL。反应条件为：变性95℃10 s，退火58℃30 s，延伸72℃30 s，35个循环。重复实验3次，结果采用2△△Ct方法计算相关mRNA相对表达量(n≥3)。
1.3 统计学方法
所有的统计结果采用单因素ANOVA进行分析，其中α=0.05。
2 实验结果
2.1 免疫荧光染色
免疫荧光染色计数以及统计结果显示，实验组Tuj1阳性率(0.201±0.030)明显高于对照组Tuj1阳性率(0.104±0.024)(P＜0.05)(图 1), 实验组中GFAP阳性率(0.091±0.013)明显低于对照组中GFAP阳性率(0.207±0.008)(P＜0.05)(图 2), 实验组O4阳性率(0.028±0.013)明显低于对照组O4阳性率(0.144±0.008)(P＜0.05)(图 3)。
图1
GE6细胞中Tuj1免疫荧光染色结果(40×)
Figure1.
Immunofluorescent staining of Tuj1 in GE6 cells (40×)
图2
GE6细胞中GFAP免疫荧光染色结果(40×)
Figure2.
Immunofluorescent staining of GFAP in GE6 cells (40×)
图3
GE6细胞中O4免疫荧光染色结果(40×)
Figure3.
Immunofluorescent staining of O4 in GE6 cells (40×)
2.2 qRT-PCR
qRT-PCR检测的结果显示，实验组Tuj1 mRNA的表达量(1.348±0.109)高于对照组Tuj1 mRNA的表达量(1.063±0.055)(P＜0.05), 实验组GFAP mRNA的表达量(0.036±0.004)远远低于对照组GFAP mRNA的表达量(0.970±0.040)(P＜0.05)。这种变化趋势和免疫荧光染色以及计数统计的结果一致。
3 讨论
Notch信号通路和神经干细胞的分化有重要联系[11]。DAPT能够通过抑制Notch信号通路γ-分泌酶复合物的活性来抑制Notch信号通路[8]。本实验拟通过观察DAPT作用于GE6细胞以后GE6各种细胞类型比例的变化来研究DAPT对神经元前体细胞系分化的影响。并且我们希望通过使用DAPT处理GE6，得到更多神经元，为GE6用于神经退行性疾病的细胞移植治疗研究做好铺垫。
在我们的实验中，使用含DAPT的培养基培养的GE6可以更多地分化为神经元。与之相对应的是少突胶质细胞和星形胶质细胞分化比例降低。这说明，DAPT可以有效地促进神经元前体细胞向神经元分化，抑制其向胶质细胞分化。这和前人体内试验结果高度一致。接下来我们会进一步的研究这些现象背后的机制。而且考虑体外实验简单可控，接下来，我们便可以用DAPT和GE6为体外模型，更深入地研究神经元发育以及神经退行性疾病发生的相关机制。此外，因为DAPT可以促进神经元的生成，我们甚至可以将DAPT用于神经退行性疾病的治疗。具体的分子药理学机制也可以用GE6为体外模型进行研究。
神经退行性疾病以及癫痫等疾病和大脑相关部位神经元减少高度相关[2, 12]。因为特异性高以及损伤小等优势，神经干细胞移植是治疗这一类疾病一种很有潜力的方法。已经有许多人进行了尝试。但这些尝试都处于实验室阶段，而且这些尝试都是以原代细胞为细胞来源进行的移植[13-15]。显而易见，原代细胞并不是一种稳定的细胞来源。如果应用到临床，稳定的细胞来源是一个亟须解决的问题。体外神经干细胞系能够为这一类移植治疗提供有效的细胞来源，因为细胞系可以长时间传代培养，随时得到大量细胞。但是细胞系都存在一定的干细胞特性，而且神经干细胞可以分化为三大类细胞，神经元只是其中之一。要得到更多的神经元则需要减弱这种干性，并且促使其向神经元分化。用DAPT阻断Notch信号通路是一种很好的思路。我们的实验结果表明，使用DAPT处理可以有效地促进神经干细胞细胞系GE6的分化，使其产生较多的神经元、较少的星形胶质细胞或者少突胶质细胞。这样的细胞系就有可能用于相关疾病的细胞移植治疗，从而有效地解决大量纯净神经元的来源问题，具有较大的临床价值。
综上所述，Notch信号通路抑制剂DAPT对神经元前体细胞系GE6的分化有明显作用，能够有效促进其向神经元分化。希望这个研究能为更深入地研究神经元发育以及神经退行性疾病的具体机制提供一个适当的体外模型，同时为解决细胞移植治疗中细胞来源问题提供一个可能思路。
引言
神经退行性疾病(neurodegeneration)是指一类发生在中枢神经系统(central nervous system, CNS)中神经元减少的疾病。中枢神经系统发育成熟以后，神经元便不能再生，这种神经元的减少往往不可逆[1]。因此，这一类疾病会给患者造成严重的功能障碍。此外，癫痫等疾病的发生与神经元缺失也有直接关系[2]。理论上，我们可以将神经干细胞或者神经元移植到受损的神经系统，替代死亡的神经元，重建神经环路，改善症状，从而对这些疾病进行治疗。已经有很多人尝试了对这些疾病进行神经干细胞移植治疗[3-5]，但仍处于实验室阶段，在走向临床应用前还有许多问题亟待解决。其中移植所需的细胞来源便是一个关键问题。
Notch信号通路和细胞连接以及信号传递息息相关，它能使细胞保持干性，且广泛存在于各种生命过程中。在Notch信号通路激活过程中，γ-分泌酶复合物是一个关键因素[6]。研究发现，γ-分泌酶复合物抑制剂——DAPT(3, 5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S苯基甘氨酸t-丁酯)可以抑制Notch信号通路激活。体内试验证明，发育过程中DAPT可通过抑制Notch信号通路激活以促进神经元生成[7-8]。
GE6来自于自带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的胚胎期大鼠的大脑，经过病毒感染和单克隆筛选得到。实验表明，GE6在体外可以分化成特定的神经元，且具有电生理活性[9]。GE6细胞系有望成为干细胞移植的细胞来源，治疗相关疾病。本文欲通过一系列实验，研究DAPT阻断Notch信号通路对GE6分化的影响，检测能否通过DAPT的处理使GE6更多地分化为神经元，为相关细胞移植提供一个更为高效的细胞来源。
本次实验中主要涉及以下相关蛋白或基因。神经特异性贝塔微管蛋白Ⅲ(neuronal classⅢβ-Tubulin，Tuj1)是微管蛋白的一种，是一种神经元特有的微管蛋白。Tuj1在神经轴突的伸展和保持过程中有着很重要的作用，并且参与了神经元形成。Tuj1是神经元特异性标志物。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是一种由GFAP基因编码的中间纤维蛋白，在细胞骨架的构成和功能的行使中起很重要的作用。通常认为GFAP能够维持细胞的机械力和细胞形态。在中枢神经系统中，GFAP还参与了比如细胞间的信号传递和血脑屏障的构成等许多重要过程。GFAP在星形胶质细胞中大量而广泛地表达，所以在神经生物学研究当中通常将其作为星形胶质细胞特异性标志物[10]。少突胶质细胞标志物O4(oligodendrocyte marker O4)是一种少突胶质细胞所特有的糖脂类物质，存在于细胞膜上。可以作为少突胶质细胞的特异性标志物，用于识别少突胶质细胞。本实验通过检测上述相关标志物表达情况来检测细胞分化情况。
1 材料和方法
1.1 实验材料
GE6细胞系由四川大学李赫冬实验室[9]提供。加葡萄糖、双抗的DMEM/F12培养基(Invitrogen公司，美国)；肝素(Heprin，Sigma公司，美国)；B27(Invitrogen公司，美国)；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Preprotech公司，英国)；DAPT(Sigma公司，美国); 神经元标志物Tuj1(mouse)抗体(AVES LABS公司，美国)；星形胶质细胞标志物GFAP(chicken)抗体(AVES LABS公司，美国)；少突胶质细胞标志物O4(mouse)抗体(Millipore公司，德国)；4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司，美国)；反转录试剂盒(PrimeScript RT, TaKaRa公司，日本)；荧光qRT-PCR试剂盒(iQTM SYBR Green Supermix，BIO-RAD公司，美国)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
GE6用10 mL含有bFGF、Heprin、B27、葡萄糖和双抗的DMEM/F12生长培养基悬浮培养。细胞密度为1×106个每培养皿(100 mm)。培养条件为37℃、5% CO2及饱和湿度。复苏后第二天每培养皿补加1 mL 10倍浓度的bFGF培养基，3 d传代一次。
1.2.2 实验处理
6孔板和放入圆形盖玻片的24孔板预先经过多聚赖氨酸和层粘连蛋白处理。GE6细胞稀释至3 000个/μL，吸取10μL含细胞的培养基接种于24孔板中的盖玻片上，培养箱中放置1 h后，补加500μL的生长培养基。24 h后分别换上500μL含4μmol/L DAPT(实验组)和不含DAPT(对照组)的分化培养基(含有B27、葡萄糖和双抗的DMEM/F12培养基)。培养4 d后，细胞爬片用4%多聚甲醛固定后，换上磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)浸泡保存，待用。6孔板中操作与24孔板操作大致相同。接种细胞密度为10 000个/μL，接种100μL含细胞的培养基。补加的生长培养基和分化培养基分别为2 mL，培养4 d后，细胞用Trizol收集，保存于-20℃，待用。
1.2.3 免疫荧光染色
在实验中使用的抗体分别为神经元特异性Tuj1抗体；星形胶质细胞特异性GFAP抗体；少突胶质细胞特异性O4抗体。取出PBS中保存的细胞爬片，PBS洗3次，加入按比例稀释的一抗(Tuj1 1 :400；GFAP 1 :1 000；O4 1 :50)室温孵育2 h，PBS-Tween 20(PBST)洗3次，加对应的按比例稀释的二抗(1 :500)以及DAPI(1 :1 000)室温孵育1 h后PBST洗3次，封片。本次实验中，Tuj1使用山羊抗鼠二抗(CY5)，GFAP使用山羊抗鸡二抗(CY5)，O4使用山羊抗鼠二抗(CY3)。O4染色时，将所有用到的PBST用PBS代替。片子晾干后，在荧光倒置显微镜下照相。将各个通道得到的图片进行合并，然后计数。每次实验选取3个视野计数，计数结果取平均数。然后计算各个抗体的阳性率(n≥3)。比如，Tuj1阳性率=Tuj1阳性细胞数/细胞总数(即绿色细胞数)。
1.2.4 qRT-PCR
实验选用GAPDH为内参，上游引物5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′；下游引物：5′-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3′。Tuj1上游引物：5′-GGCCTTTGGACACCTATTCAG-3′；下游引物：5′-TCTCACATTCTTTCCTCACG-AC-3′。GFAP上游引物：5′-GACTTTCTCCAAC-CTCCAGATC-3′；下游引物：5′-CTCCTGCTTC-GACTCCTTAATG-3′。O4没有相应的mRNA，故此处不做检测。引物由上海捷瑞生物工程有限公司提供。首先将Trizol收取的细胞样品提取总RNA，进行含量测定。然后用反转录试剂盒进行cDNA反转，反转采用10μL体系，RNA总量为500 ng。反转得到的cDNA用来进行定量检测。qRT-PCR采用10μL体系：预混液5μL，cDNA 50倍稀释后取4.4μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL。反应条件为：变性95℃10 s，退火58℃30 s，延伸72℃30 s，35个循环。重复实验3次，结果采用2△△Ct方法计算相关mRNA相对表达量(n≥3)。
1.3 统计学方法
所有的统计结果采用单因素ANOVA进行分析，其中α=0.05。
2 实验结果
2.1 免疫荧光染色
免疫荧光染色计数以及统计结果显示，实验组Tuj1阳性率(0.201±0.030)明显高于对照组Tuj1阳性率(0.104±0.024)(P＜0.05)(图 1), 实验组中GFAP阳性率(0.091±0.013)明显低于对照组中GFAP阳性率(0.207±0.008)(P＜0.05)(图 2), 实验组O4阳性率(0.028±0.013)明显低于对照组O4阳性率(0.144±0.008)(P＜0.05)(图 3)。
图1
GE6细胞中Tuj1免疫荧光染色结果(40×)
Figure1.
Immunofluorescent staining of Tuj1 in GE6 cells (40×)
图2
GE6细胞中GFAP免疫荧光染色结果(40×)
Figure2.
Immunofluorescent staining of GFAP in GE6 cells (40×)
图3
GE6细胞中O4免疫荧光染色结果(40×)
Figure3.
Immunofluorescent staining of O4 in GE6 cells (40×)
2.2 qRT-PCR
qRT-PCR检测的结果显示，实验组Tuj1 mRNA的表达量(1.348±0.109)高于对照组Tuj1 mRNA的表达量(1.063±0.055)(P＜0.05), 实验组GFAP mRNA的表达量(0.036±0.004)远远低于对照组GFAP mRNA的表达量(0.970±0.040)(P＜0.05)。这种变化趋势和免疫荧光染色以及计数统计的结果一致。
3 讨论
Notch信号通路和神经干细胞的分化有重要联系[11]。DAPT能够通过抑制Notch信号通路γ-分泌酶复合物的活性来抑制Notch信号通路[8]。本实验拟通过观察DAPT作用于GE6细胞以后GE6各种细胞类型比例的变化来研究DAPT对神经元前体细胞系分化的影响。并且我们希望通过使用DAPT处理GE6，得到更多神经元，为GE6用于神经退行性疾病的细胞移植治疗研究做好铺垫。
在我们的实验中，使用含DAPT的培养基培养的GE6可以更多地分化为神经元。与之相对应的是少突胶质细胞和星形胶质细胞分化比例降低。这说明，DAPT可以有效地促进神经元前体细胞向神经元分化，抑制其向胶质细胞分化。这和前人体内试验结果高度一致。接下来我们会进一步的研究这些现象背后的机制。而且考虑体外实验简单可控，接下来，我们便可以用DAPT和GE6为体外模型，更深入地研究神经元发育以及神经退行性疾病发生的相关机制。此外，因为DAPT可以促进神经元的生成，我们甚至可以将DAPT用于神经退行性疾病的治疗。具体的分子药理学机制也可以用GE6为体外模型进行研究。
神经退行性疾病以及癫痫等疾病和大脑相关部位神经元减少高度相关[2, 12]。因为特异性高以及损伤小等优势，神经干细胞移植是治疗这一类疾病一种很有潜力的方法。已经有许多人进行了尝试。但这些尝试都处于实验室阶段，而且这些尝试都是以原代细胞为细胞来源进行的移植[13-15]。显而易见，原代细胞并不是一种稳定的细胞来源。如果应用到临床，稳定的细胞来源是一个亟须解决的问题。体外神经干细胞系能够为这一类移植治疗提供有效的细胞来源，因为细胞系可以长时间传代培养，随时得到大量细胞。但是细胞系都存在一定的干细胞特性，而且神经干细胞可以分化为三大类细胞，神经元只是其中之一。要得到更多的神经元则需要减弱这种干性，并且促使其向神经元分化。用DAPT阻断Notch信号通路是一种很好的思路。我们的实验结果表明，使用DAPT处理可以有效地促进神经干细胞细胞系GE6的分化，使其产生较多的神经元、较少的星形胶质细胞或者少突胶质细胞。这样的细胞系就有可能用于相关疾病的细胞移植治疗，从而有效地解决大量纯净神经元的来源问题，具有较大的临床价值。
综上所述，Notch信号通路抑制剂DAPT对神经元前体细胞系GE6的分化有明显作用，能够有效促进其向神经元分化。希望这个研究能为更深入地研究神经元发育以及神经退行性疾病的具体机制提供一个适当的体外模型，同时为解决细胞移植治疗中细胞来源问题提供一个可能思路。
