本研究旨在建立一种更适合软骨细胞生长的三维培养体系。首先通过酰胺键反应将甲基丙烯酸引入海藻酸盐长链形成甲基丙烯酸海藻酸盐(MA), 然后将MA和混合阳离子Ba2+∶Ca2+=5∶5进行光交联反应, 形成内部结构为贯通式凝胶网络(IPN)的凝胶小球(MA凝胶小球)。将P1代软骨细胞包裹在MA凝胶小球中连续培养三周, 在培养的不同时间点取适量凝胶小球进行倒置显微镜观察, 冰冻切片后HE染色和免疫组化染色, 扫描电镜观察第21 d细胞在支架中的情况; 通过Alamar blue法检测软骨细胞的增殖情况; 二甲基亚甲兰法定量检测糖胺多糖(GAG)的含量。结果显示MA和混合阳离子Ba2+∶Ca2+=5∶5发生光交联反应形成的MA凝胶小球, 与对照组藻酸钙相比, P1代软骨细胞在MA凝胶小球内增殖更明显, 细胞外基质GAG的分泌也更多, 扫描电镜下观察到软骨细胞可以良好地黏附在支架中生长, 免疫组化染色呈阳性。以上结果证实软骨细胞在MA凝胶小球中的增殖和细胞外基质的分泌量优于藻酸钙组, 并且能维持软骨细胞的表型, 是一种更好的软骨细胞三维培养载体。
引用本文： 汪洋, 冯玉霞, 樊星, 任利玲. 混合阳离子交联剂甲基丙烯酸海藻酸盐三维培养软骨细胞. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(3): 599-604. doi: 10.7507/1001-5515.20150109 复制
引言
软骨缺乏血供，损伤后自我修复能力十分有限。采用自体软骨替代修复会对患者造成第二次损伤。利用凝胶作为移植物载体包裹细胞修复软骨缺损已进行了广泛地研究，目前发现凝胶的机械性能和结构显著影响着细胞的生物学性状[1]，从而决定着软骨修复的成功与否。
海藻酸盐已经有20多年的研究历史，它是由α-L-古罗塘醛酸和β-D-甘露糖醛通过1, 4糖苷键连接的天然多糖，生物相容性良好且无毒、无致敏反应，可以和Ca2+等二价阳离子发生交联反应，形成网状结构的水凝胶, 是一种良好地微囊化细胞的支架材料[1]。它作为支架材料包裹软骨细胞可以良好地维持软骨细胞的表型，使软骨细胞表达特异性的蛋白。然而该凝胶材料的强度不能完全匹配软骨修复应力，限制了其应用。Cha等[2]将甲基丙烯酸引入海藻酸盐生成甲基丙烯酸海藻酸盐(methacrylic alginate, MA)，和钙离子交联后通过光交联反应形成贯通式的凝胶网络(interpenetrating network, IPN)，提高了海藻酸盐水凝胶的强度，进一步将酵母细胞包裹在该凝胶中，发现酵母细胞保留了更多的新陈代谢活动，然而不足之处就是凝胶小球的渗透性下降了约10％。我们课题组前期研究发现Ca2+ :Ba2+=5 :5混合阳离子作为交联剂和MA通过热反应生成的凝胶小球强度和渗透性均显示最佳特性[3]，但热反应限制了其作为细胞培养载体的使用。Cha等研究发现通过光反应同样可以达到双键的断裂聚合，使这种材料有望成为理想的组织工程材料。基于此，我们将混合阳离子Ca2+ :Ba2+=5 :5与MA通过光交联反应形成MA凝胶小球，并微囊化软骨细胞，观察软骨细胞在该三维培养体系中的增殖和生长情况，以期为软骨细胞提供更合适的培养载体。
1 材料与方法
1.1 材料
低粘度海藻酸钠(Sigma)；氯化钙(分析纯)；氯化钡(分析纯)；Mes缓冲液(上海生工)；光引发剂VA-086(武汉福德化工有限公司)；Ⅱ型胶原酶(Sigma)；Ⅱ型胶原单克隆抗体、抗山羊二抗(武汉博士德)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司)；鲨鱼硫酸软骨素(Sigma)；木瓜蛋白酶(Sigma)；Alamar blue(Sigma)；1, 9-二甲基亚甲蓝(1, 9-Dimethylmethylene blue，DMB)(Sigma)；16G成胶针；扫描电子显微镜(日立S-3400N)；万能材料测试仪AGS-5Xkn(Japan)。
1.2 材料制备
1.2.1 兔关节软骨细胞的分离和培养
取4周龄日本大耳白兔(中国农业科学院兰州兽类研究所提供)，耳缘静脉栓塞法处死后，无菌条件下解剖分离兔下肢膝关节软骨，暴露呈半透明状的关节软骨，用12号手术刀片切取膝关节软骨。将其剪碎至约1 mm3大小。视软骨的量加入胰蛋白酶消化30 min，吸去胰蛋白酶后，加入Ⅱ型胶原酶，37℃摇床消化6 h，用200目滤网滤过剩余组织，1 000 r/min离心5 min，弃上清。PBS洗两遍，血细胞计数板计数，按1.0×105／mL的密度接种于25 cm2培养皿，加入含10％FBS的DMEM，在37℃、5％CO2孵箱中培养。
1.2.2 MA溶液制备
①配置0.1 mol/L Mes缓冲液。②按樊星等[3]的方法制备MA。③将MA与蒸馏水按质量体积比为1 :100配制MA溶液。
1.2.3 MA凝胶小球复合软骨细胞的制备
当P1代软骨细胞长满至培养皿底80％～90％时，用EDTA-胰蛋白酶将细胞消化下来，然后和含有光引发剂VA-086的1％MA混合均匀，使细胞密度为1×106个／mL，用16 G的针头逐滴滴入Ca2+ :Ba2+=5 :5的混合阳离子中，在去离子水中用波长为365 nm的紫外灯照射5 min[2]，形成直径为2 mm的凝胶小球，PBS反复漂洗，每个小球中约含由细胞1×104个左右。将形成的MA凝胶小球悬浮在DMEM培养液中，在37℃、5% CO2孵箱中连续培养三周，隔天换液。对照组为藻酸钙凝胶复合软骨细胞，将1％藻酸盐溶液与软骨细胞混合同样保持软骨细胞密度为1×106个／mL，然后用16 G针头逐滴滴入102 mmol/L氯化钙溶液中，静置10 min，形成直径约2 mm的凝胶小球。在第1、7、14、21 d对实验组和对照组进行检测，每组分别取10个小球进行实验。
1.3 观察及检测
1.3.1 倒置显微镜下观察
培养至第1、7、14、21 d，倒置相差显微镜下观察复合于MA凝胶小球和藻酸钙凝胶小球中的软骨细胞形态及增殖情况。
1.3.2 组织学及免疫学检测
在培养的1、7、21 d分别取小球包裹的细胞结构，用O.C.T固定，切取冰冻切片，进行HE染色。对21 d的MA组凝胶小球进行Ⅱ型胶原免疫组化染色，鉴定其是否分泌Ⅱ型胶原。
1.3.3 扫描电镜观察
培养至第21 d对两组凝胶小球进行扫描电镜观察，观察细胞黏附和生长情况。
1.3.4 细胞活性及增殖检测
在培养的第1、7、14、21 d将两组小球用PBS漂洗三遍后，以200μL／球加入溶解液(将55 mmol／L EDTA，10 mmol／L Hepes溶于三蒸水中，逐滴加入氢氧化钠调节pH值到7.4，高温蒸汽灭菌备用，4℃冰箱储存)溶解，离心，去上清，200μL完全培养液重悬后接种于96孔板，18 h后换液，采用Alamar blue法评价细胞增殖活性。通过预先测定的吸光度与细胞浓度线性标准曲线，计算活细胞数量。
1.3.5 软骨细胞分泌细胞外基质检测
使用二甲基亚甲兰法[4]测定各时间点样品硫酸化糖胺多糖(glycosaminoglycan, GAG)的含量。具体方法为：两组在不同时间点各取三份完整的凝胶小球(10个/份)，PBS冲洗两遍，在真空干燥箱内低压冻干，加入木瓜蛋白酶缓冲溶液，60℃水浴箱消化过夜。每40μL消化混合液加入200μL DMB(pH 1.5)，于595 nm测吸光度值。以鲨鱼硫酸软骨素作为标准，定量GAG含量。
1.4 统计学分析
采用SPSS 18.0统计软件包进行分析，所得数据以
2 结果
2.1 软骨细胞的原代培养
课题组前期通过同样的方法分离获得兔膝关节软骨，并对其进行Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝染色鉴定，证实该细胞是具备正常功能的软骨细胞[5]。本次分离贴壁的软骨细胞呈多角形或短梭形，原代细胞接种后一周可以长满瓶底的70％~80％，整体看上去呈不规则的“铺路石”样，如图 1所示。
图1
倒置显微镜下原代软骨细胞形态(bar=200μm)
Figure1.
Morphology of primary chondrocytes cells(bar=200μm)
2.2 MA凝胶小球包裹软骨细胞的形成
形成的MA凝胶小球为半透明状的球形，直径在2 mm左右，凝胶小球孵育在含有DMEM培养液的24孔板中，如图 2所示。
图2
MA凝胶小球微囊化软骨细胞
(a)MA凝胶小球的直径为2 mm左右；(b)MA凝胶小球在24孔板中培养的情况
Figure2. Chondrocytes encapsulated in alginate beads(a) the diameter of the MA alginate bead is around 2 mm; (b) chondrocytes encapsulated in the beads were cultured
2.3 倒置显微镜下观察软骨细胞在凝胶小球中的情况
从图 3中可以看出软骨细胞初植入MA凝胶小球和藻酸钙凝胶小球内，细胞分布均匀，随着培养天数的增加，两组细胞增殖明显，到第14 d均可见细胞簇形成，第21 d细胞簇的数量明显增多。两组凝胶内细胞主要集中在小球的边缘部分，可能是因为小球中心部位营养和氧气供应不足，导致了小球中心细胞的增殖缓慢甚至坏死。而单纯凝胶小球组(空白对照组)在培养液中培养第21 d后镜下可见小球内部呈均质状。
图3
软骨细胞在凝胶小球中的培养情况(bar=200μm)
1：第21 d空白对照组；2：第1 d软骨细胞初植入小球，细胞分布均匀；3：第7 d软骨细胞增殖明显；4：第14 d可见细胞簇形成；5：第21 d细胞簇逐渐增多
Figure3. Chondrocytes cultured in gel beads (bar=200μm)1: blank group on Day 21; 2: chondrocytes first culture in beads, cells were uniformly distributed on Day 1; 3: cell proliferation clearly on Day 7; 4: cell clusters could be observed on Day 14; 5: cell clusters gradually increased
2.4 扫描电镜下观察软骨细胞在支架中的情况
第21 d通过扫描电镜发现，MA凝胶小球和藻酸钙凝胶小球内部结构均呈多孔结构，软骨细胞黏附在MA凝胶小球和藻酸钙凝胶小球支架中生长，呈圆形，如图 4所示。
图4
扫描电镜下细胞在支架中的情况(bar=30μm)
(a)软骨细胞在MA凝胶小球中黏附和生长情况；(b)软骨细胞在藻酸钙凝胶小球中黏附和生长情况(白色箭头指示的是软骨细胞)
Figure4. SEM showing the growth of chondrocytes (bar=30μm)(a) the adhesion and growth of chondrocytes in MA gel bead; (b) the adhesion and growth of chondrocytes in alginate gel bead
2.5 微囊化软骨细胞的组织学染色和免疫组化染色结果
HE染色显示最初软骨细胞黏附在支架材料内生长，第7 d细胞增殖明显，出现细胞簇，到第21 d细胞簇数量显著增多, MA凝胶组细胞簇数量较藻酸钙组更多，如图 5所示。免疫组化染色显示第21 d MA组Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性，主要分布在小球周边，如图 6所示。
1：第1 d细胞在凝胶中分布的情况；2：第7 d细胞增殖明显，细胞聚集成簇生长；3：第21 d细胞簇数量显著增多，MA凝胶组细胞簇数量较藻酸钙组更多。白色箭头指示的是细胞簇，星形指示的是支架结构
Figure5. Histological staining of chondrocytes cultured in gel beads (bar=100μm)
图6
第21 d MA组免疫组化染色示胶原分泌情况
40倍镜下观察到Ⅱ型胶原主要分布在小球周边(bar=500μm)
Figure6. Immunohistochemieal staining of collagen typeⅡon cultured in MA beads on Day 21collagen typeⅡwas mainly distributed on the edge of gel beads under the microscope of 40 times (bar=500μm)
2.6 软骨细胞的活性及增殖检测
Alamar blue法测定细胞增殖结果如图 7所示，显示在培养的21 d内，两组小球内软骨细胞不断增殖，MA组细胞增殖比藻酸钙组更加明显，活细胞数量更多。第21 d MA组细胞数达到(4.082±0.166)×104/10个小球，藻酸钙组细胞数达到(3.373±0.088)×104/10个小球，组间单因素方差分析第21 d两组细胞数目之间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。
图7
Alamar blue法测定两组间的细胞数目
Figure7.
Cells numbers in two groups with time using Alamar blue
2.7 细胞外基质GAG含量的测定结果
细胞在小球中培养的GAG定量检测结果如图 8所示，在培养的21 d内，GAG的分泌随时间增长逐渐增多，到第21 d MA组GAG含量达到(10.811±0.337)μg/10个小球，藻酸钙组GAG含量达到(8.242±0.223)μg/10个小球，组间单因素方差分析第21 d两组GAG含量之间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。
图8
两组小球中软骨细胞蛋白聚糖的含量
Figure8.
Glycosaminoglycan content of chondrocyte in beads between two groups
3 讨论
海藻酸盐作为一种细胞外基质的替代材料，机械强度、膨胀率、降解率、渗透性等结构特征显著影响着细胞的生长、增殖、黏附等生物学性状[1]。已有研究表明凝胶的强度影响着细胞的黏附、增殖和表型[6]。Genes等[7]发现凝胶机械强度越大细胞的黏附越好，细胞的表型也最接近生理状态。Kong等[8]将细胞接种在不同强度的藻酸盐表面生长时，发现细胞分泌细胞外基质的量也会受到影响。一些学者发现藻酸钙凝胶的机械强度较差，限制了细胞的长期增殖生长[9-10]，研究发现通过增加海藻酸盐的浓度或阳离子浓度可以增加凝胶的强度，但凝胶的渗透性下降，导致细胞的存活率下降[11]。
藻酸盐微球的制备通常是将海藻酸钠滴入到二价阳离子如Ca2+、Sr2+或Ba2+等溶液中而制备。Cui等[12]发现藻酸盐与Ba2+形成的凝胶小球比Ca2+结构更加稳定。事实上，MØrch等[13]分别用Ba2+与Ca2+作为藻酸盐的阳离子交联剂发现，Ba2+作为交联剂反应形成的凝胶小球强度高，但孔径小，而Ca2+作为交联剂，形成的凝胶小球强度低，但孔径大。其原因在于Ca2+与Ba2+能分别与海藻酸盐M、G、MG片段中的不同片段连接，从而影响着凝胶小球的强度和渗透性。后来有学者将不同比例的Ba2+和Ca2+混合作为阳离子与藻酸盐反应，发现生成的小球在渗透性和强度方面确实有所不同[14]。
本课题组前期研究发现将不同比例的Ba2+、Ca2+混合阳离子通过热反应与MA交联生成的凝胶小球中，Ba2+ :Ca2+=5 :5作为混合阳离子交联剂与甲基丙烯酸交联形成的凝胶小球强度和渗透性显示出最佳特性[3]，但热反应限制其微囊化细胞的应用。本实验将Ba2+ :Ca2+=5 :5作为阳离子交联剂，与MA通过光反应生成MA凝胶小球，提高了凝胶的强度，又维持了凝胶小球的渗透性(数据未显示)。光交联反应中光引发剂VA-086在W/V最大为1.5％时对软骨细胞是无毒性的[16]。利用此改性方法获得的凝胶小球内部支架结构良好，软骨细胞可以在支架中黏附、生长，扫描电镜显示软骨细胞保持了球形的形态。培养21 d后，软骨细胞维持了良好表型。较藻酸钙组而言，MA组软骨细胞的增殖更好，细胞外基质GAG的分泌量也更多，证实了它是一种比藻酸钙更适合的体外培养软骨细胞的载体。然而21 d后MA组细胞增殖也仅为93％左右，离临床应用还有很大差距，下一步我们将在提高细胞增殖方面寻求改性。在本实验中，我们发现小球中心存活细胞较少，这可能由于我们所制备的凝胶小球直径较大，导致营养液渗透性下降，营养和氧气难以供给到小球中心，所以造成小球中心细胞增殖缓慢甚至坏死。有研究发现可以通过气体吹喷制囊法和静电微囊发生法来制备直径较小的凝胶小球[17-18]。
引言
软骨缺乏血供，损伤后自我修复能力十分有限。采用自体软骨替代修复会对患者造成第二次损伤。利用凝胶作为移植物载体包裹细胞修复软骨缺损已进行了广泛地研究，目前发现凝胶的机械性能和结构显著影响着细胞的生物学性状[1]，从而决定着软骨修复的成功与否。
海藻酸盐已经有20多年的研究历史，它是由α-L-古罗塘醛酸和β-D-甘露糖醛通过1, 4糖苷键连接的天然多糖，生物相容性良好且无毒、无致敏反应，可以和Ca2+等二价阳离子发生交联反应，形成网状结构的水凝胶, 是一种良好地微囊化细胞的支架材料[1]。它作为支架材料包裹软骨细胞可以良好地维持软骨细胞的表型，使软骨细胞表达特异性的蛋白。然而该凝胶材料的强度不能完全匹配软骨修复应力，限制了其应用。Cha等[2]将甲基丙烯酸引入海藻酸盐生成甲基丙烯酸海藻酸盐(methacrylic alginate, MA)，和钙离子交联后通过光交联反应形成贯通式的凝胶网络(interpenetrating network, IPN)，提高了海藻酸盐水凝胶的强度，进一步将酵母细胞包裹在该凝胶中，发现酵母细胞保留了更多的新陈代谢活动，然而不足之处就是凝胶小球的渗透性下降了约10％。我们课题组前期研究发现Ca2+ :Ba2+=5 :5混合阳离子作为交联剂和MA通过热反应生成的凝胶小球强度和渗透性均显示最佳特性[3]，但热反应限制了其作为细胞培养载体的使用。Cha等研究发现通过光反应同样可以达到双键的断裂聚合，使这种材料有望成为理想的组织工程材料。基于此，我们将混合阳离子Ca2+ :Ba2+=5 :5与MA通过光交联反应形成MA凝胶小球，并微囊化软骨细胞，观察软骨细胞在该三维培养体系中的增殖和生长情况，以期为软骨细胞提供更合适的培养载体。
1 材料与方法
1.1 材料
低粘度海藻酸钠(Sigma)；氯化钙(分析纯)；氯化钡(分析纯)；Mes缓冲液(上海生工)；光引发剂VA-086(武汉福德化工有限公司)；Ⅱ型胶原酶(Sigma)；Ⅱ型胶原单克隆抗体、抗山羊二抗(武汉博士德)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司)；鲨鱼硫酸软骨素(Sigma)；木瓜蛋白酶(Sigma)；Alamar blue(Sigma)；1, 9-二甲基亚甲蓝(1, 9-Dimethylmethylene blue，DMB)(Sigma)；16G成胶针；扫描电子显微镜(日立S-3400N)；万能材料测试仪AGS-5Xkn(Japan)。
1.2 材料制备
1.2.1 兔关节软骨细胞的分离和培养
取4周龄日本大耳白兔(中国农业科学院兰州兽类研究所提供)，耳缘静脉栓塞法处死后，无菌条件下解剖分离兔下肢膝关节软骨，暴露呈半透明状的关节软骨，用12号手术刀片切取膝关节软骨。将其剪碎至约1 mm3大小。视软骨的量加入胰蛋白酶消化30 min，吸去胰蛋白酶后，加入Ⅱ型胶原酶，37℃摇床消化6 h，用200目滤网滤过剩余组织，1 000 r/min离心5 min，弃上清。PBS洗两遍，血细胞计数板计数，按1.0×105／mL的密度接种于25 cm2培养皿，加入含10％FBS的DMEM，在37℃、5％CO2孵箱中培养。
1.2.2 MA溶液制备
①配置0.1 mol/L Mes缓冲液。②按樊星等[3]的方法制备MA。③将MA与蒸馏水按质量体积比为1 :100配制MA溶液。
1.2.3 MA凝胶小球复合软骨细胞的制备
当P1代软骨细胞长满至培养皿底80％～90％时，用EDTA-胰蛋白酶将细胞消化下来，然后和含有光引发剂VA-086的1％MA混合均匀，使细胞密度为1×106个／mL，用16 G的针头逐滴滴入Ca2+ :Ba2+=5 :5的混合阳离子中，在去离子水中用波长为365 nm的紫外灯照射5 min[2]，形成直径为2 mm的凝胶小球，PBS反复漂洗，每个小球中约含由细胞1×104个左右。将形成的MA凝胶小球悬浮在DMEM培养液中，在37℃、5% CO2孵箱中连续培养三周，隔天换液。对照组为藻酸钙凝胶复合软骨细胞，将1％藻酸盐溶液与软骨细胞混合同样保持软骨细胞密度为1×106个／mL，然后用16 G针头逐滴滴入102 mmol/L氯化钙溶液中，静置10 min，形成直径约2 mm的凝胶小球。在第1、7、14、21 d对实验组和对照组进行检测，每组分别取10个小球进行实验。
1.3 观察及检测
1.3.1 倒置显微镜下观察
培养至第1、7、14、21 d，倒置相差显微镜下观察复合于MA凝胶小球和藻酸钙凝胶小球中的软骨细胞形态及增殖情况。
1.3.2 组织学及免疫学检测
在培养的1、7、21 d分别取小球包裹的细胞结构，用O.C.T固定，切取冰冻切片，进行HE染色。对21 d的MA组凝胶小球进行Ⅱ型胶原免疫组化染色，鉴定其是否分泌Ⅱ型胶原。
1.3.3 扫描电镜观察
培养至第21 d对两组凝胶小球进行扫描电镜观察，观察细胞黏附和生长情况。
1.3.4 细胞活性及增殖检测
在培养的第1、7、14、21 d将两组小球用PBS漂洗三遍后，以200μL／球加入溶解液(将55 mmol／L EDTA，10 mmol／L Hepes溶于三蒸水中，逐滴加入氢氧化钠调节pH值到7.4，高温蒸汽灭菌备用，4℃冰箱储存)溶解，离心，去上清，200μL完全培养液重悬后接种于96孔板，18 h后换液，采用Alamar blue法评价细胞增殖活性。通过预先测定的吸光度与细胞浓度线性标准曲线，计算活细胞数量。
1.3.5 软骨细胞分泌细胞外基质检测
使用二甲基亚甲兰法[4]测定各时间点样品硫酸化糖胺多糖(glycosaminoglycan, GAG)的含量。具体方法为：两组在不同时间点各取三份完整的凝胶小球(10个/份)，PBS冲洗两遍，在真空干燥箱内低压冻干，加入木瓜蛋白酶缓冲溶液，60℃水浴箱消化过夜。每40μL消化混合液加入200μL DMB(pH 1.5)，于595 nm测吸光度值。以鲨鱼硫酸软骨素作为标准，定量GAG含量。
1.4 统计学分析
采用SPSS 18.0统计软件包进行分析，所得数据以
2 结果
2.1 软骨细胞的原代培养
课题组前期通过同样的方法分离获得兔膝关节软骨，并对其进行Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝染色鉴定，证实该细胞是具备正常功能的软骨细胞[5]。本次分离贴壁的软骨细胞呈多角形或短梭形，原代细胞接种后一周可以长满瓶底的70％~80％，整体看上去呈不规则的“铺路石”样，如图 1所示。
图1
倒置显微镜下原代软骨细胞形态(bar=200μm)
Figure1.
Morphology of primary chondrocytes cells(bar=200μm)
2.2 MA凝胶小球包裹软骨细胞的形成
形成的MA凝胶小球为半透明状的球形，直径在2 mm左右，凝胶小球孵育在含有DMEM培养液的24孔板中，如图 2所示。
图2
MA凝胶小球微囊化软骨细胞
(a)MA凝胶小球的直径为2 mm左右；(b)MA凝胶小球在24孔板中培养的情况
Figure2. Chondrocytes encapsulated in alginate beads(a) the diameter of the MA alginate bead is around 2 mm; (b) chondrocytes encapsulated in the beads were cultured
2.3 倒置显微镜下观察软骨细胞在凝胶小球中的情况
从图 3中可以看出软骨细胞初植入MA凝胶小球和藻酸钙凝胶小球内，细胞分布均匀，随着培养天数的增加，两组细胞增殖明显，到第14 d均可见细胞簇形成，第21 d细胞簇的数量明显增多。两组凝胶内细胞主要集中在小球的边缘部分，可能是因为小球中心部位营养和氧气供应不足，导致了小球中心细胞的增殖缓慢甚至坏死。而单纯凝胶小球组(空白对照组)在培养液中培养第21 d后镜下可见小球内部呈均质状。
图3
软骨细胞在凝胶小球中的培养情况(bar=200μm)
1：第21 d空白对照组；2：第1 d软骨细胞初植入小球，细胞分布均匀；3：第7 d软骨细胞增殖明显；4：第14 d可见细胞簇形成；5：第21 d细胞簇逐渐增多
Figure3. Chondrocytes cultured in gel beads (bar=200μm)1: blank group on Day 21; 2: chondrocytes first culture in beads, cells were uniformly distributed on Day 1; 3: cell proliferation clearly on Day 7; 4: cell clusters could be observed on Day 14; 5: cell clusters gradually increased
2.4 扫描电镜下观察软骨细胞在支架中的情况
第21 d通过扫描电镜发现，MA凝胶小球和藻酸钙凝胶小球内部结构均呈多孔结构，软骨细胞黏附在MA凝胶小球和藻酸钙凝胶小球支架中生长，呈圆形，如图 4所示。
图4
扫描电镜下细胞在支架中的情况(bar=30μm)
(a)软骨细胞在MA凝胶小球中黏附和生长情况；(b)软骨细胞在藻酸钙凝胶小球中黏附和生长情况(白色箭头指示的是软骨细胞)
Figure4. SEM showing the growth of chondrocytes (bar=30μm)(a) the adhesion and growth of chondrocytes in MA gel bead; (b) the adhesion and growth of chondrocytes in alginate gel bead
2.5 微囊化软骨细胞的组织学染色和免疫组化染色结果
HE染色显示最初软骨细胞黏附在支架材料内生长，第7 d细胞增殖明显，出现细胞簇，到第21 d细胞簇数量显著增多, MA凝胶组细胞簇数量较藻酸钙组更多，如图 5所示。免疫组化染色显示第21 d MA组Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性，主要分布在小球周边，如图 6所示。
1：第1 d细胞在凝胶中分布的情况；2：第7 d细胞增殖明显，细胞聚集成簇生长；3：第21 d细胞簇数量显著增多，MA凝胶组细胞簇数量较藻酸钙组更多。白色箭头指示的是细胞簇，星形指示的是支架结构
Figure5. Histological staining of chondrocytes cultured in gel beads (bar=100μm)
图6
第21 d MA组免疫组化染色示胶原分泌情况
40倍镜下观察到Ⅱ型胶原主要分布在小球周边(bar=500μm)
Figure6. Immunohistochemieal staining of collagen typeⅡon cultured in MA beads on Day 21collagen typeⅡwas mainly distributed on the edge of gel beads under the microscope of 40 times (bar=500μm)
2.6 软骨细胞的活性及增殖检测
Alamar blue法测定细胞增殖结果如图 7所示，显示在培养的21 d内，两组小球内软骨细胞不断增殖，MA组细胞增殖比藻酸钙组更加明显，活细胞数量更多。第21 d MA组细胞数达到(4.082±0.166)×104/10个小球，藻酸钙组细胞数达到(3.373±0.088)×104/10个小球，组间单因素方差分析第21 d两组细胞数目之间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。
图7
Alamar blue法测定两组间的细胞数目
Figure7.
Cells numbers in two groups with time using Alamar blue
2.7 细胞外基质GAG含量的测定结果
细胞在小球中培养的GAG定量检测结果如图 8所示，在培养的21 d内，GAG的分泌随时间增长逐渐增多，到第21 d MA组GAG含量达到(10.811±0.337)μg/10个小球，藻酸钙组GAG含量达到(8.242±0.223)μg/10个小球，组间单因素方差分析第21 d两组GAG含量之间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。
图8
两组小球中软骨细胞蛋白聚糖的含量
Figure8.
Glycosaminoglycan content of chondrocyte in beads between two groups
3 讨论
海藻酸盐作为一种细胞外基质的替代材料，机械强度、膨胀率、降解率、渗透性等结构特征显著影响着细胞的生长、增殖、黏附等生物学性状[1]。已有研究表明凝胶的强度影响着细胞的黏附、增殖和表型[6]。Genes等[7]发现凝胶机械强度越大细胞的黏附越好，细胞的表型也最接近生理状态。Kong等[8]将细胞接种在不同强度的藻酸盐表面生长时，发现细胞分泌细胞外基质的量也会受到影响。一些学者发现藻酸钙凝胶的机械强度较差，限制了细胞的长期增殖生长[9-10]，研究发现通过增加海藻酸盐的浓度或阳离子浓度可以增加凝胶的强度，但凝胶的渗透性下降，导致细胞的存活率下降[11]。
藻酸盐微球的制备通常是将海藻酸钠滴入到二价阳离子如Ca2+、Sr2+或Ba2+等溶液中而制备。Cui等[12]发现藻酸盐与Ba2+形成的凝胶小球比Ca2+结构更加稳定。事实上，MØrch等[13]分别用Ba2+与Ca2+作为藻酸盐的阳离子交联剂发现，Ba2+作为交联剂反应形成的凝胶小球强度高，但孔径小，而Ca2+作为交联剂，形成的凝胶小球强度低，但孔径大。其原因在于Ca2+与Ba2+能分别与海藻酸盐M、G、MG片段中的不同片段连接，从而影响着凝胶小球的强度和渗透性。后来有学者将不同比例的Ba2+和Ca2+混合作为阳离子与藻酸盐反应，发现生成的小球在渗透性和强度方面确实有所不同[14]。
本课题组前期研究发现将不同比例的Ba2+、Ca2+混合阳离子通过热反应与MA交联生成的凝胶小球中，Ba2+ :Ca2+=5 :5作为混合阳离子交联剂与甲基丙烯酸交联形成的凝胶小球强度和渗透性显示出最佳特性[3]，但热反应限制其微囊化细胞的应用。本实验将Ba2+ :Ca2+=5 :5作为阳离子交联剂，与MA通过光反应生成MA凝胶小球，提高了凝胶的强度，又维持了凝胶小球的渗透性(数据未显示)。光交联反应中光引发剂VA-086在W/V最大为1.5％时对软骨细胞是无毒性的[16]。利用此改性方法获得的凝胶小球内部支架结构良好，软骨细胞可以在支架中黏附、生长，扫描电镜显示软骨细胞保持了球形的形态。培养21 d后，软骨细胞维持了良好表型。较藻酸钙组而言，MA组软骨细胞的增殖更好，细胞外基质GAG的分泌量也更多，证实了它是一种比藻酸钙更适合的体外培养软骨细胞的载体。然而21 d后MA组细胞增殖也仅为93％左右，离临床应用还有很大差距，下一步我们将在提高细胞增殖方面寻求改性。在本实验中，我们发现小球中心存活细胞较少，这可能由于我们所制备的凝胶小球直径较大，导致营养液渗透性下降，营养和氧气难以供给到小球中心，所以造成小球中心细胞增殖缓慢甚至坏死。有研究发现可以通过气体吹喷制囊法和静电微囊发生法来制备直径较小的凝胶小球[17-18]。
