研究不同粒径的羟基磷灰石(HA)粒子对恶性黑色素瘤A375细胞的抑制效应。湿法合成4种短棒状HA粒子,平均直径分别为998.0 nm (HA1)、511.0 nm (HA2)、244.0 nm (HA3)和71.6 nm (HA4),体外干预恶性黑色素瘤A375细胞。结果显示:平均直径小于511.0 nm的HA粒子均可抑制A375细胞的增殖,其中纳米级HA4粒子对A375细胞的增殖抑制和诱导凋亡能力最强;HA粒子分布于A375细胞胞质内;HA4组A375细胞超微结构的改变最为显著。研究表明,粒径是HA粒子抗肿瘤效应极为重要的影响因素,纳米级HA4粒子抑制A375细胞增殖的能力最强;纳米HA通过诱导细胞凋亡抑制A375细胞增殖。
引用本文： 郭波, 李波, 王滟, 洪友良, 张伶俐, 张兴栋. 不同粒径羟基磷灰石粒子对恶性黑色素瘤A375细胞抑制效应的初步研究. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(4): 832-837. doi: 10.7507/1001-5515.20150150 复制
引言
羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)[Ca10(PO4)6(OH)2]是人体骨组织重要的无机组成部分，在生物体内主要以纳米晶体的形式存在，以其为主要成分的无机陶瓷材料也是重要的生物修复材料。1992年，Aoki在使用HA粒子载抗肿瘤药物进行体外抗肿瘤研究时意外发现，作为空白对照的HA粒子同样可以抑制肿瘤细胞Ca-9的增殖，提示HA粒子可能具有抗肿瘤效应[1]。将HA粒子吸附氟尿嘧啶和丝裂霉素C等抗肿瘤药物，并与肿瘤细胞HSC23共同培养，发现与单纯使用氟尿嘧啶、丝裂霉素C或HA粒子相比较，载有抗肿瘤药物的HA粒子能显著地抑制肿瘤细胞增殖，进一步证明了HA粒子对肿瘤细胞增殖具有抑制作用[2-3]。近年来一些研究显示：HA粒子与肝癌、肺癌、宫颈癌等恶性肿瘤细胞共同培养时，均可产生细胞毒性，从而导致肿瘤细胞死亡。
研究表明，除了化学组成，HA粒子的大小、形状、表面特征等也对其生物学效应具有明显的影响[4]。而不同粒径的HA是否存在抗肿瘤效应方面的差异，目前尚无系统研究。因此，本研究合成不同粒径的HA粒子，干预恶性黑色素瘤细胞A375的增殖，以研究羟基磷灰石的粒径对其抗肿瘤效应的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
恶性黑色素瘤细胞A375：美国ATCC中心，由四川大学华西医院病理实验室提供。鼠抗人CD147TTIC单克隆荧光抗体，美国Ancell公司；DMEM培养基、胰蛋白酶，美国GIBCO公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)，美国SIGMA公司；MRC-1024ES激光扫描共聚焦显微镜，英国Bio-Rad公司；TE2000-U荧光相差倒置显微镜及显微操作系统，日本Nikon公司。
1.2 HA粒子制备和表征
1.2.1 HA粒子制备
通过湿法合成4种HA粒子，均为短棒状，由反应条件不同分别合成微米级粒子HA1、HA2、HA3以及纳米级粒子HA4。粒子平均直径：HA1为998.0 nm，HA2为511.0 nm，HA3为244.0 nm，HA4为71.6 nm。
(1) HA1的制备：CaCl2和Na3PO4的Ca/P比为1.67，于室温下反应，将磷酸盐滴加入钙盐同时搅拌，控制pH值在10，继续搅拌1 h，陈化24 h，将生成的沉淀去离子水水洗至中性，120 ℃干燥24 h。使用时称取一定量的粉末分散于水中，超声分散后待用。
(2)HA2的制备：CaCl2和Na3PO4的Ca/P比为1.67，于室温下反应，将磷酸盐滴加入钙盐同时搅拌，控制pH值在10，继续搅拌1 h，陈化24 h，将生成的沉淀去离子水水洗至中性，60 ℃干燥24 h。使用时称取一定量的粉末分散于水中，超声分散后待用。
(3)HA3的制备：CaCl2和Na3PO4按Ca/P比为1.67，65℃反应1 h，加入少量的柠檬酸作为分散剂(按生成固含量的3%加入)，将磷酸盐滴加入钙盐同时搅拌，控制pH值在10，继续搅拌1 h，陈化24 h，将生成的沉淀去离子水水洗至中性，冷冻干燥。使用时称取一定量的粉末分散于水中，超声分散后待用。
(4)HA4的制备：CaCl2和Na3PO4的Ca/P比为1.67，于室温下反应，加入少量的柠檬酸作为分散剂(按生成固含量的3%加入)，将磷酸盐滴加入钙盐同时搅拌，控制pH值在10，继续搅拌1 h，陈化24 h，将生成的沉淀去离子水水洗至中性，冷冻干燥。使用时称取一定量的粉末分散于水中，超声分散后待用。
1.2.2 HA粒子表征
(1)HA粒子直径分析：将制备的HA粒子以去离子水分散到一定浓度，加少量的分散剂和稳定剂(聚丙烯酸胺或者六偏磷酸钠)，每隔半小时超声5 min，以激光散射纳米粒度仪进行粒子直径分析，测量3次取其平均值。
(2)纳米HA粒子相成分分析：将制备的纳米HA粒子(nano-HA)(HA4)进行X-射线衍射(X-ray diffraction，XRD)，进行相成分分析。
(4)纳米HA粒子透射电镜观察：将制备的纳米HA粒子(nano-HA)(HA4)以去离子水分散到一定浓度，加少量的分散剂和稳定剂(聚丙烯酸胺或者六偏磷酸钠)，每隔半小时超声5 min，将一滴或数滴溶胶涂抹于Cu网上，以透射电镜(transmission electron microscope，TEM)观察。
1.3 实验方法
1.3.1 MTT比色法测试
取对数生长期的细胞,胰蛋白酶消化后吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×104个/mL，接种于96孔培养板中，每孔总体积0.2 mL。24 h后细胞贴壁，弃原培养液，加入含有4种HA粒子的培养液(粒子终浓度为150 g/mL)，每种粒子设5个复孔。作用24、48、72、96 h后,加入MTT液(浓度为5 mg/mL),每孔20 μL，37 ℃孵育4 h。弃上清液，加入二甲亚砜(DMSO)150 μL，振荡10 min，使结晶充分溶解。选择波长570 nm，在酶标仪上测定各孔光吸收度值(OD值)。以PBS代替HA粒子作为空白对照。
1.3.2 TEM观察
空白组以及微米粒子HA1、纳米粒子HA4粒子作用48 h后，收集培养瓶内A375细胞，细胞总数分别为1×106个/mL，置于2 mL的离心管中，2 000 r/min离心15 min，弃上清。吸管沿管壁加入0.5%的戊二醛固定，4 ℃静置15 min；12 000 r/min离心15 min，弃上清。吸管沿管壁加入0.5%的戊二醛固定15 min。1%四氧化锇固定15 min。丙酮逐级脱水。Epon812包埋，半薄切片光学定位。超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，TEM观察。
1.3.3 免疫荧光观察
取对数生长期的A375细胞，浓度为2×105个/mL，接种于6孔培养板中，每孔总体积2 mL。24 h 后细胞贴壁,弃原培养液,加入含4种HA粒子的新培养液(粒子终浓度为150 g/mL)。48 h后弃培养液，于4%的多聚甲醛固定15 min。PBS洗3次(5 min/次)。再加入200 μL细胞核特异荧光染色剂4，6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride (molecular probes，USA)，于37 ℃、5% CO2孵箱中培养5 min。PBS洗3次(5 min/次)； 以PBS代替HA粒子作为空白对照，置于免疫荧光显微镜下观察。
1.3.4 流式细胞术测试
4种HA粒子作用细胞48 h后，收集培养瓶内A375细胞，细胞总数为1×106 个，用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，离心(12 000 r/min)。弃上清液，沿管壁缓慢加入1 mL、70%乙醇(－20 ℃预冷)固定，过夜(4 ℃)。PBS洗2次(5 min/次)，100 μl RNA酶消化30 min(37 ℃)，再加入100 μL PI 染色液(4 ℃)，避光30 min。用Epics Elite Esp流式细胞仪对标本进行检则。每次计细胞数5 000个。用分析软件CellQuest计算凋亡率。
1.4 统计学分析
采用统计学分析软件SPSS 13.0进行数据处理。实验数据以均数±标准差(
2 结果
2.1 HA粒子表征
2.1.1 HA粒子分布
通过控制反应温度以及使用不同的分散剂，共合成4种HA粒子，均为短棒状，分别为微米级粒子HA1、HA2和HA3，以及纳米级粒子HA4，具体分布如表 1所示。
表1
HA粒子的粒径和粒径分布(nm)
Table1.
HA particle size and size distribution (nm)
2.1.2 纳米HA粒子(HA4)的XRD结果
对HA4粒子采用DX-1000型X-射线衍射仪进行测试，XRD结果表明，在2θ=26°、32°、40°、46°、50°附近，都有羟基磷灰石(002)、(211)、(310)、(222)和(213)晶面衍射的特征峰，均无杂质峰出现。
2.1.3 纳米HA粒子(HA4)的TEM观察结果
图 1为HA4粒子的TEM照片，从测试照片中可以看出，所制备的纳米HA粒子呈短棒状，分散良好，粒度分析表明其直径分布于63.5～201.0 nm，平均直径约为71.6 nm。
图1
纳米HA粒子(HA4)TEM图像
Figure1.
TEM image of nano HA particle (HA4)
2.2 不同粒径HA粒子对恶性黑色素瘤A375的生物活性影响
2.2.1 细胞增殖
由表 2的结果可见，不同直径的HA粒子与肿瘤细胞共同培养24 h，各实验组间的吸光度值差异无统计学意义。延长培养培养时间至48 h后，纳米HA粒子明显抑制了A375细胞的增殖(P<0.05)。培养72 h后，所有HA实验组均抑制了A375细胞的增殖，与空白组比较，吸光度值差异有统计学意义(P<0.05)。培养96 h后，HA1粒子与空白对照组相比较，吸光度值差异无统计学意义，而HA2、HA3、HA4仍可明显抑制A375细胞增殖(P<0.05)。
表2
不同粒径HA粒子作用下A375细胞吸光度值(A570 nm)
Table2.
Effects of HA particles with different size on the absorbance value of A375 cells (A570 nm)
2.2.2 细胞免疫荧光观察
图 2为HA粒子干预恶性黑色素瘤细胞前后的免疫荧光图。图中空白组细胞核膜完整,染色质均匀一致,可见细胞核分裂像。HA粒子与细胞作用48 h后，HA1、HA2组未发现肿瘤细胞核形态和染色质变化；而HA3、HA4处理后，细胞核缩小、染色质不均匀，部分可见染色质积聚，且HA4作用后细胞核改变较明显。
图2
A375细胞与HA粒子培养48 h免疫荧光染色(200×)
Figure2.
Immunofluorescence micrograph of A375 cells co-cultured with HA particles for 48 h (200×)
2.2.3 流式细胞术检测
HA粒子与肿瘤细胞A375培养48 h后，细胞的凋亡率分别为:空白组29.00%±2.77%，HA1组29.72%±2.33%，HA2组31.12%±1.70%，HA3组32.80%±3.22%，HA4组42.12%±1.76%。与空白组比较，HA4组的细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)，而HA1、HA2、HA3组的细胞凋亡率差异无统计学意义,表明纳米HA粒子对恶性黑色素瘤细胞A375具有最强的凋亡诱导作用。
2.2.4 TEM观察
图 3为恶性黑色素瘤细胞与HA粒子培养48 h后的TEM图像。空白对照组细胞核呈椭圆形，核内染色质分布均匀，核仁明显，细胞器丰富，细胞质内粗面内质网、高尔基体、核糖体等细胞器均清晰可见，细胞膜完整，高倍镜下核膜可见。HA1粒子作用A375细胞后，可见HA粒子进入细胞质内，细胞染色质聚集，细胞体积缩小，胞质内出现少量空泡，呈现凋亡前改变。HA4作用后，可见大量HA粒子进入细胞质内，细胞核固缩，染色质聚集于核膜周边形成数个团块，胞质内出现大量空泡，细胞呈凋亡改变。
图3
恶性黑色素瘤细胞A375与HA粒子培养48H透射电镜(10 000×)
Figure3.
TEM images of malignant melanoma A375 cells co-cultured with HA particles for 48 h (10 000×)
3 讨论
随着材料科学的进展，目前对HA粒子抗肿瘤特性的研究已逐步向纳米尺度深入。近年来的研究表明，恶性肿瘤细胞与纳米HA在体外共同培养时，纳米HA可以抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞、G2肝癌细胞和MG63骨肉瘤细胞等恶性肿瘤细胞的增殖[5-7]。肿瘤细胞的增殖过程中，多种因素可影响肿瘤细胞最终的生物结局。除了HA的化学组成，HA粒子的粒径也可能影响肿瘤细胞的增殖。因此，本研究使用了平均粒径为998.0、511.0、244.0 nm的三种短棒状微米HA粒子，以及平均粒径为71.6 nm的短棒状纳米HA粒子，与恶性黑色素瘤细胞A375体外共同培养。研究结果表明，随着HA颗粒尺寸的减小，HA粒子对肿瘤细胞的增殖抑制效应逐渐增强，平均直径为71.6 nm的短棒状纳米HA粒子对恶性黑色素瘤细胞的抑制作用最强。
HA4在与肿瘤细胞共培养48、72、96 h期间，对肿瘤细胞的增殖均有显著的抑制作用。HA2和HA3与肿瘤细胞共培养72 h后，出现对细胞的增殖抑制。虽然HA1粒子在末期未对恶性黑色素瘤细胞增殖产生明显的抑制作用，但与空白对照组相比较，肿瘤细胞增殖仍呈下降的趋势，而且在第3天细胞吸光度值与空白组比较具有统计学差异。这可能是由于粒子大小并非均匀分布所致。由表 1可知，HA1粒子分布于80～1 000 nm之间，平均粒径为998 nm，但仍有少部分较小尺寸的HA粒子。我们认为，由于肿瘤细胞不断增殖，小颗粒HA粒子不断消耗，并最终耗尽。这从另一方面也验证了小尺寸HA尤其是纳米HA粒子对肿瘤细胞增殖有明显的抑制作用。
早期研究认为，HA粒子在杀伤肿瘤细胞的同时不损伤正常细胞，必须具备两个条件：①HA的粒径分布于20～100 nm之间；②纳米粒子需要分布均匀[8]。我们的研究表明：平均粒径为511.0 nm的HA粒子仍然具有肿瘤抑制作用，两者结论似乎并不完全一致。这可能是由于肿瘤细胞类型和恶性程度的差异所造成的。Yeh等[9]通过扫描电镜和TEM研究纳米粒子对恶性肿瘤的影响，发现肿瘤细胞的非特异性吞噬能力和肿瘤细胞与材料的相互黏附密切相关。高恶性的肿瘤细胞能摄取更多的纳米颗粒，而分裂相对较慢的正常细胞几乎不能摄取纳米颗粒。这也说明了在研究HA粒子与肿瘤细胞的相互作用时，应该考虑肿瘤细胞类型和恶性程度。
近年来研究认为：HA粒子抑制肿瘤的机制可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡的途径实现的。当恶性肿瘤细胞与HA粒子共同培养时，细胞外存在高浓度的HA粒子或钙离子，肿瘤细胞较高的钙摄入能力可能导致过多钙离子或HA粒子的摄入，产生细胞毒性，从而诱导肿瘤细胞凋亡[10-13]。关于肿瘤发生、发展的原因，现在倾向的观点是由于细胞的异常增殖和死亡动态失衡所致。目前很多抗癌药物如拓朴异构酶抑制剂、烷化剂和抗代谢药物等，主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡来治疗肿瘤，因此治疗效果不仅取决于药物对肿瘤细胞的直接作用，也依赖于其诱导肿瘤凋亡的能力。因此，研究HA粒子诱导肿瘤细胞凋亡的能力，将为HA粒子抗肿瘤的临床应用提供依据。
细胞凋亡的特征性形态学变化包括细胞染色质的固缩、裂解，核仁的分裂，凋亡小体的形成等。在本研究中，从免疫荧光照片，我们可以看到细胞凋亡的特征性变化，如细胞体积缩小，胞膜皱缩，核固缩，核质沿核膜浓缩集中，形成数个团块或境界分明的新月形小体。在TEM照片中，空白对照组细胞核呈椭圆形，核内染色质分布均匀，核仁明显，细胞器丰富，胞质内粗面内质网、高尔基体、核糖体等细胞器均清晰可见，细胞膜完整，高倍镜下核膜可见。HA1粒子作用于恶性黑色素瘤细胞后，染色质聚集，细胞体积缩小，胞质内出现空泡，呈现凋亡前改变。HA4作用于恶性黑色素瘤细胞后，细胞出现核固缩，染色质凝集并聚集于核膜周边形成数个团块，胞质内出现大量空泡，细胞呈凋亡改变。HA粒子与A375细胞培养48 h后，采用流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡率，结果表明细胞的凋亡率随HA粒径的减小而增加，HA4作用后的细胞凋亡率与空白组比较差异有统计学意义。因此，本研究进一步验证了HA粒子可通过诱导细胞凋亡的方式抑制肿瘤细胞的增殖。
综上所述，本研究合成了不同大小(直径)的HA粒子与恶性黑色素瘤细胞A375体外共同培养，结果表明平均直径小于511.0 nm的HA粒子均可抑制A375细胞的增殖，其中纳米HA粒子抑制细胞增殖和凋亡诱导的能力最强。同时，纳米粒子组(HA4)A375细胞超微结构改变最为显著。因此，本研究显示HA粒子的大小(粒径)是其抗肿瘤效应的重要影响因素。但肿瘤细胞是通过细胞膜表面的何种结构识别和转运纳米HA粒子的，则需要进一步研究。
引言
羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)[Ca10(PO4)6(OH)2]是人体骨组织重要的无机组成部分，在生物体内主要以纳米晶体的形式存在，以其为主要成分的无机陶瓷材料也是重要的生物修复材料。1992年，Aoki在使用HA粒子载抗肿瘤药物进行体外抗肿瘤研究时意外发现，作为空白对照的HA粒子同样可以抑制肿瘤细胞Ca-9的增殖，提示HA粒子可能具有抗肿瘤效应[1]。将HA粒子吸附氟尿嘧啶和丝裂霉素C等抗肿瘤药物，并与肿瘤细胞HSC23共同培养，发现与单纯使用氟尿嘧啶、丝裂霉素C或HA粒子相比较，载有抗肿瘤药物的HA粒子能显著地抑制肿瘤细胞增殖，进一步证明了HA粒子对肿瘤细胞增殖具有抑制作用[2-3]。近年来一些研究显示：HA粒子与肝癌、肺癌、宫颈癌等恶性肿瘤细胞共同培养时，均可产生细胞毒性，从而导致肿瘤细胞死亡。
研究表明，除了化学组成，HA粒子的大小、形状、表面特征等也对其生物学效应具有明显的影响[4]。而不同粒径的HA是否存在抗肿瘤效应方面的差异，目前尚无系统研究。因此，本研究合成不同粒径的HA粒子，干预恶性黑色素瘤细胞A375的增殖，以研究羟基磷灰石的粒径对其抗肿瘤效应的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
恶性黑色素瘤细胞A375：美国ATCC中心，由四川大学华西医院病理实验室提供。鼠抗人CD147TTIC单克隆荧光抗体，美国Ancell公司；DMEM培养基、胰蛋白酶，美国GIBCO公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)，美国SIGMA公司；MRC-1024ES激光扫描共聚焦显微镜，英国Bio-Rad公司；TE2000-U荧光相差倒置显微镜及显微操作系统，日本Nikon公司。
1.2 HA粒子制备和表征
1.2.1 HA粒子制备
通过湿法合成4种HA粒子，均为短棒状，由反应条件不同分别合成微米级粒子HA1、HA2、HA3以及纳米级粒子HA4。粒子平均直径：HA1为998.0 nm，HA2为511.0 nm，HA3为244.0 nm，HA4为71.6 nm。
(1) HA1的制备：CaCl2和Na3PO4的Ca/P比为1.67，于室温下反应，将磷酸盐滴加入钙盐同时搅拌，控制pH值在10，继续搅拌1 h，陈化24 h，将生成的沉淀去离子水水洗至中性，120 ℃干燥24 h。使用时称取一定量的粉末分散于水中，超声分散后待用。
(2)HA2的制备：CaCl2和Na3PO4的Ca/P比为1.67，于室温下反应，将磷酸盐滴加入钙盐同时搅拌，控制pH值在10，继续搅拌1 h，陈化24 h，将生成的沉淀去离子水水洗至中性，60 ℃干燥24 h。使用时称取一定量的粉末分散于水中，超声分散后待用。
(3)HA3的制备：CaCl2和Na3PO4按Ca/P比为1.67，65℃反应1 h，加入少量的柠檬酸作为分散剂(按生成固含量的3%加入)，将磷酸盐滴加入钙盐同时搅拌，控制pH值在10，继续搅拌1 h，陈化24 h，将生成的沉淀去离子水水洗至中性，冷冻干燥。使用时称取一定量的粉末分散于水中，超声分散后待用。
(4)HA4的制备：CaCl2和Na3PO4的Ca/P比为1.67，于室温下反应，加入少量的柠檬酸作为分散剂(按生成固含量的3%加入)，将磷酸盐滴加入钙盐同时搅拌，控制pH值在10，继续搅拌1 h，陈化24 h，将生成的沉淀去离子水水洗至中性，冷冻干燥。使用时称取一定量的粉末分散于水中，超声分散后待用。
1.2.2 HA粒子表征
(1)HA粒子直径分析：将制备的HA粒子以去离子水分散到一定浓度，加少量的分散剂和稳定剂(聚丙烯酸胺或者六偏磷酸钠)，每隔半小时超声5 min，以激光散射纳米粒度仪进行粒子直径分析，测量3次取其平均值。
(2)纳米HA粒子相成分分析：将制备的纳米HA粒子(nano-HA)(HA4)进行X-射线衍射(X-ray diffraction，XRD)，进行相成分分析。
(4)纳米HA粒子透射电镜观察：将制备的纳米HA粒子(nano-HA)(HA4)以去离子水分散到一定浓度，加少量的分散剂和稳定剂(聚丙烯酸胺或者六偏磷酸钠)，每隔半小时超声5 min，将一滴或数滴溶胶涂抹于Cu网上，以透射电镜(transmission electron microscope，TEM)观察。
1.3 实验方法
1.3.1 MTT比色法测试
取对数生长期的细胞,胰蛋白酶消化后吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×104个/mL，接种于96孔培养板中，每孔总体积0.2 mL。24 h后细胞贴壁，弃原培养液，加入含有4种HA粒子的培养液(粒子终浓度为150 g/mL)，每种粒子设5个复孔。作用24、48、72、96 h后,加入MTT液(浓度为5 mg/mL),每孔20 μL，37 ℃孵育4 h。弃上清液，加入二甲亚砜(DMSO)150 μL，振荡10 min，使结晶充分溶解。选择波长570 nm，在酶标仪上测定各孔光吸收度值(OD值)。以PBS代替HA粒子作为空白对照。
1.3.2 TEM观察
空白组以及微米粒子HA1、纳米粒子HA4粒子作用48 h后，收集培养瓶内A375细胞，细胞总数分别为1×106个/mL，置于2 mL的离心管中，2 000 r/min离心15 min，弃上清。吸管沿管壁加入0.5%的戊二醛固定，4 ℃静置15 min；12 000 r/min离心15 min，弃上清。吸管沿管壁加入0.5%的戊二醛固定15 min。1%四氧化锇固定15 min。丙酮逐级脱水。Epon812包埋，半薄切片光学定位。超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，TEM观察。
1.3.3 免疫荧光观察
取对数生长期的A375细胞，浓度为2×105个/mL，接种于6孔培养板中，每孔总体积2 mL。24 h 后细胞贴壁,弃原培养液,加入含4种HA粒子的新培养液(粒子终浓度为150 g/mL)。48 h后弃培养液，于4%的多聚甲醛固定15 min。PBS洗3次(5 min/次)。再加入200 μL细胞核特异荧光染色剂4，6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride (molecular probes，USA)，于37 ℃、5% CO2孵箱中培养5 min。PBS洗3次(5 min/次)； 以PBS代替HA粒子作为空白对照，置于免疫荧光显微镜下观察。
1.3.4 流式细胞术测试
4种HA粒子作用细胞48 h后，收集培养瓶内A375细胞，细胞总数为1×106 个，用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，离心(12 000 r/min)。弃上清液，沿管壁缓慢加入1 mL、70%乙醇(－20 ℃预冷)固定，过夜(4 ℃)。PBS洗2次(5 min/次)，100 μl RNA酶消化30 min(37 ℃)，再加入100 μL PI 染色液(4 ℃)，避光30 min。用Epics Elite Esp流式细胞仪对标本进行检则。每次计细胞数5 000个。用分析软件CellQuest计算凋亡率。
1.4 统计学分析
采用统计学分析软件SPSS 13.0进行数据处理。实验数据以均数±标准差(
2 结果
2.1 HA粒子表征
2.1.1 HA粒子分布
通过控制反应温度以及使用不同的分散剂，共合成4种HA粒子，均为短棒状，分别为微米级粒子HA1、HA2和HA3，以及纳米级粒子HA4，具体分布如表 1所示。
表1
HA粒子的粒径和粒径分布(nm)
Table1.
HA particle size and size distribution (nm)
2.1.2 纳米HA粒子(HA4)的XRD结果
对HA4粒子采用DX-1000型X-射线衍射仪进行测试，XRD结果表明，在2θ=26°、32°、40°、46°、50°附近，都有羟基磷灰石(002)、(211)、(310)、(222)和(213)晶面衍射的特征峰，均无杂质峰出现。
2.1.3 纳米HA粒子(HA4)的TEM观察结果
图 1为HA4粒子的TEM照片，从测试照片中可以看出，所制备的纳米HA粒子呈短棒状，分散良好，粒度分析表明其直径分布于63.5～201.0 nm，平均直径约为71.6 nm。
图1
纳米HA粒子(HA4)TEM图像
Figure1.
TEM image of nano HA particle (HA4)
2.2 不同粒径HA粒子对恶性黑色素瘤A375的生物活性影响
2.2.1 细胞增殖
由表 2的结果可见，不同直径的HA粒子与肿瘤细胞共同培养24 h，各实验组间的吸光度值差异无统计学意义。延长培养培养时间至48 h后，纳米HA粒子明显抑制了A375细胞的增殖(P<0.05)。培养72 h后，所有HA实验组均抑制了A375细胞的增殖，与空白组比较，吸光度值差异有统计学意义(P<0.05)。培养96 h后，HA1粒子与空白对照组相比较，吸光度值差异无统计学意义，而HA2、HA3、HA4仍可明显抑制A375细胞增殖(P<0.05)。
表2
不同粒径HA粒子作用下A375细胞吸光度值(A570 nm)
Table2.
Effects of HA particles with different size on the absorbance value of A375 cells (A570 nm)
2.2.2 细胞免疫荧光观察
图 2为HA粒子干预恶性黑色素瘤细胞前后的免疫荧光图。图中空白组细胞核膜完整,染色质均匀一致,可见细胞核分裂像。HA粒子与细胞作用48 h后，HA1、HA2组未发现肿瘤细胞核形态和染色质变化；而HA3、HA4处理后，细胞核缩小、染色质不均匀，部分可见染色质积聚，且HA4作用后细胞核改变较明显。
图2
A375细胞与HA粒子培养48 h免疫荧光染色(200×)
Figure2.
Immunofluorescence micrograph of A375 cells co-cultured with HA particles for 48 h (200×)
2.2.3 流式细胞术检测
HA粒子与肿瘤细胞A375培养48 h后，细胞的凋亡率分别为:空白组29.00%±2.77%，HA1组29.72%±2.33%，HA2组31.12%±1.70%，HA3组32.80%±3.22%，HA4组42.12%±1.76%。与空白组比较，HA4组的细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)，而HA1、HA2、HA3组的细胞凋亡率差异无统计学意义,表明纳米HA粒子对恶性黑色素瘤细胞A375具有最强的凋亡诱导作用。
2.2.4 TEM观察
图 3为恶性黑色素瘤细胞与HA粒子培养48 h后的TEM图像。空白对照组细胞核呈椭圆形，核内染色质分布均匀，核仁明显，细胞器丰富，细胞质内粗面内质网、高尔基体、核糖体等细胞器均清晰可见，细胞膜完整，高倍镜下核膜可见。HA1粒子作用A375细胞后，可见HA粒子进入细胞质内，细胞染色质聚集，细胞体积缩小，胞质内出现少量空泡，呈现凋亡前改变。HA4作用后，可见大量HA粒子进入细胞质内，细胞核固缩，染色质聚集于核膜周边形成数个团块，胞质内出现大量空泡，细胞呈凋亡改变。
图3
恶性黑色素瘤细胞A375与HA粒子培养48H透射电镜(10 000×)
Figure3.
TEM images of malignant melanoma A375 cells co-cultured with HA particles for 48 h (10 000×)
3 讨论
随着材料科学的进展，目前对HA粒子抗肿瘤特性的研究已逐步向纳米尺度深入。近年来的研究表明，恶性肿瘤细胞与纳米HA在体外共同培养时，纳米HA可以抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞、G2肝癌细胞和MG63骨肉瘤细胞等恶性肿瘤细胞的增殖[5-7]。肿瘤细胞的增殖过程中，多种因素可影响肿瘤细胞最终的生物结局。除了HA的化学组成，HA粒子的粒径也可能影响肿瘤细胞的增殖。因此，本研究使用了平均粒径为998.0、511.0、244.0 nm的三种短棒状微米HA粒子，以及平均粒径为71.6 nm的短棒状纳米HA粒子，与恶性黑色素瘤细胞A375体外共同培养。研究结果表明，随着HA颗粒尺寸的减小，HA粒子对肿瘤细胞的增殖抑制效应逐渐增强，平均直径为71.6 nm的短棒状纳米HA粒子对恶性黑色素瘤细胞的抑制作用最强。
HA4在与肿瘤细胞共培养48、72、96 h期间，对肿瘤细胞的增殖均有显著的抑制作用。HA2和HA3与肿瘤细胞共培养72 h后，出现对细胞的增殖抑制。虽然HA1粒子在末期未对恶性黑色素瘤细胞增殖产生明显的抑制作用，但与空白对照组相比较，肿瘤细胞增殖仍呈下降的趋势，而且在第3天细胞吸光度值与空白组比较具有统计学差异。这可能是由于粒子大小并非均匀分布所致。由表 1可知，HA1粒子分布于80～1 000 nm之间，平均粒径为998 nm，但仍有少部分较小尺寸的HA粒子。我们认为，由于肿瘤细胞不断增殖，小颗粒HA粒子不断消耗，并最终耗尽。这从另一方面也验证了小尺寸HA尤其是纳米HA粒子对肿瘤细胞增殖有明显的抑制作用。
早期研究认为，HA粒子在杀伤肿瘤细胞的同时不损伤正常细胞，必须具备两个条件：①HA的粒径分布于20～100 nm之间；②纳米粒子需要分布均匀[8]。我们的研究表明：平均粒径为511.0 nm的HA粒子仍然具有肿瘤抑制作用，两者结论似乎并不完全一致。这可能是由于肿瘤细胞类型和恶性程度的差异所造成的。Yeh等[9]通过扫描电镜和TEM研究纳米粒子对恶性肿瘤的影响，发现肿瘤细胞的非特异性吞噬能力和肿瘤细胞与材料的相互黏附密切相关。高恶性的肿瘤细胞能摄取更多的纳米颗粒，而分裂相对较慢的正常细胞几乎不能摄取纳米颗粒。这也说明了在研究HA粒子与肿瘤细胞的相互作用时，应该考虑肿瘤细胞类型和恶性程度。
近年来研究认为：HA粒子抑制肿瘤的机制可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡的途径实现的。当恶性肿瘤细胞与HA粒子共同培养时，细胞外存在高浓度的HA粒子或钙离子，肿瘤细胞较高的钙摄入能力可能导致过多钙离子或HA粒子的摄入，产生细胞毒性，从而诱导肿瘤细胞凋亡[10-13]。关于肿瘤发生、发展的原因，现在倾向的观点是由于细胞的异常增殖和死亡动态失衡所致。目前很多抗癌药物如拓朴异构酶抑制剂、烷化剂和抗代谢药物等，主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡来治疗肿瘤，因此治疗效果不仅取决于药物对肿瘤细胞的直接作用，也依赖于其诱导肿瘤凋亡的能力。因此，研究HA粒子诱导肿瘤细胞凋亡的能力，将为HA粒子抗肿瘤的临床应用提供依据。
细胞凋亡的特征性形态学变化包括细胞染色质的固缩、裂解，核仁的分裂，凋亡小体的形成等。在本研究中，从免疫荧光照片，我们可以看到细胞凋亡的特征性变化，如细胞体积缩小，胞膜皱缩，核固缩，核质沿核膜浓缩集中，形成数个团块或境界分明的新月形小体。在TEM照片中，空白对照组细胞核呈椭圆形，核内染色质分布均匀，核仁明显，细胞器丰富，胞质内粗面内质网、高尔基体、核糖体等细胞器均清晰可见，细胞膜完整，高倍镜下核膜可见。HA1粒子作用于恶性黑色素瘤细胞后，染色质聚集，细胞体积缩小，胞质内出现空泡，呈现凋亡前改变。HA4作用于恶性黑色素瘤细胞后，细胞出现核固缩，染色质凝集并聚集于核膜周边形成数个团块，胞质内出现大量空泡，细胞呈凋亡改变。HA粒子与A375细胞培养48 h后，采用流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡率，结果表明细胞的凋亡率随HA粒径的减小而增加，HA4作用后的细胞凋亡率与空白组比较差异有统计学意义。因此，本研究进一步验证了HA粒子可通过诱导细胞凋亡的方式抑制肿瘤细胞的增殖。
综上所述，本研究合成了不同大小(直径)的HA粒子与恶性黑色素瘤细胞A375体外共同培养，结果表明平均直径小于511.0 nm的HA粒子均可抑制A375细胞的增殖，其中纳米HA粒子抑制细胞增殖和凋亡诱导的能力最强。同时，纳米粒子组(HA4)A375细胞超微结构改变最为显著。因此，本研究显示HA粒子的大小(粒径)是其抗肿瘤效应的重要影响因素。但肿瘤细胞是通过细胞膜表面的何种结构识别和转运纳米HA粒子的，则需要进一步研究。
