Wnt信号通路的异常激活与肿瘤的发生密切相关,T细胞因子4(Tcf4)和β连环蛋白(β-catenin)是该通路中重要的信号传递因子。本文应用免疫组织化学染色检测97例结直肠癌组织和40例正常黏膜组织中Tcf4、β-catenin和Wnt信号通路抑制因子分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)的表达关系,探讨其临床意义及与预后的关系。结果显示:在结直肠癌中,Tcf4及β-catenin异位表达显著高于正常黏膜组织(P<0.01),SFRP1表达显著低于正常黏膜组织(P<0.01);结直肠癌中SFRP1的表达与Tcf4和β-catenin异位表达呈负相关(r=－0.599,P<0.01;r=－0.250,P<0.05);Tcf4和β-catenin异位表达均与淋巴结转移和Dukes分期有关(P<0.05),SFRP1表达与与肿瘤浸润深度有关(P<0.05);Kaplan-Meier生存分析表明,Tcf4和β-catenin异位表达的患者生存率明显低于阴性者(P<0.01),而SFRP1阳性表达的患者生存率明显高于阴性者(P<0.01);多因素分析表明β-catenin异位表达和SFRP1的表达及Dukes分期是影响结直肠癌患者预后的独立因素(P<0.05)。结果提示在结直肠癌中Wnt信号通路因子Tcf4和β-catenin异位表达,可能与SFRP1的表达下调或缺失有关;β-catenin在细胞核内积聚与Tcf4形成复合体是维持结直肠癌恶性表型的重要分子开关;三者联合检测可能对结直肠癌的进展及预后判断有着重要意义,并为结直肠癌的基因治疗提供新的分子靶点。
引用本文： 欧玉荣, 景桂英, 刘娟, 高杉, 承泽农, 董修芹. Wnt信号通路T细胞因子4、β-catenin与SFRP1在结直肠癌中表达及预后关系. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(4): 854-861. doi: 10.7507/1001-5515.20150153 复制
引言
目前结直肠癌已成为世界第三大常见的恶性肿瘤，近年来由于饮食结构、生活习惯和环境的改变，加上缺乏运动，在我国大肠癌的发病率也逐年上升。通过对散发性和遗传性结直肠癌的研究显示，Wnt信号传导通路在其中扮演着核心的角色。β-catenin是此通路中重要的信号传递因子，也是重要的枢纽因子。Wnt信号通路可以通过发挥抑制细胞质内GSK-3β、Axin和APC的相互作用，防止细胞质内的β-catenin被降解，使稳定的β-catenin能够转移到细胞核内，与核内转录因子T细胞因子/淋巴细胞增强因子(T cell transcriptional factor/ lymphid enhancer factor,Tcf/Lef)结合，诱导多种相关靶基因的转录，从而控制胚胎发育及细胞生长、分化及凋亡等。目前研究认为，该Wnt信号通路的异常与结肠癌发生发展密切相关[1-2]，大约90%以上的结直肠癌存在Wnt/β-catenin信号转导通路的异常激活[3]。T细胞因子4(T cell factor 4,Tcf4)是Tcf家族在人正常结肠上皮唯一表达的重要成员，Tcf4 mRNA也是在所有结肠癌细胞系中表达最强烈的，说明Tcf4基因在结肠癌的发生发展中起重要作用[4]。Tcf4/β-catenin复合体及下游靶基因的激活转录是结直肠癌细胞恶性转化的一个标志[5]。作为Wnt信号通路中的分子开关[6-7],在调控细胞癌变过程中有双重效应,Tcf4既能通过抑制细胞过度生长、防止肿瘤发生,又可促进细胞增殖分化。因而Wnt信号通过Tcf4的开关状态不仅调控机体的生长、发育、分化等基本生理功能，还可对肿瘤的发生进行调控。
分泌型卷曲相关蛋白1(secreted frizzled related protein 1,SFRP1)是新近发现的与肿瘤发生相关的一个重要基因，被认为是一种抑癌基因[8]，它通过干扰Wnt糖蛋白(配体)与Frizzled受体间的相互作用而阻断Wnt信号通路，是Wnt信号通路的负调控因子。研究发现[9]，SFRP1在结直肠肿瘤中mRNA表达水平下调，且由正常肠黏膜→腺瘤→结直肠癌下调水平呈上升趋势，提示SFRP1作为Wnt通路的拮抗剂对防止结直肠肿瘤的发生、发展起一定作用。目前国内外关于SFRP1与Tcf4/β-catenin复合体在恶性肿瘤中的研究报道均较少，本实验检测97例结直肠癌及相应40例正常组织中Tcf4、β-catenin及SFRP1的表达情况，并分析其与结直肠癌患者临床病理因素的关系，探讨其在结直肠癌发生、发展中的作用及其预后关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象和标本来源
收集蚌埠医学院第一附属医院2005年1月－2006年12月，经手术切除的存档石蜡包埋结直肠癌组织标本97例和及相对应正常结直肠黏膜组织40例(所有患者术前均未给予放疗、化疗及免疫治疗，术后均经常规组织病理证实)，所有病例均有完整的临床、病理及随访资料。所选病例随访至患者死亡或截止至2012年12月，随访时间为8～96个月。所有病例均无遗传性结直肠肿瘤病史。97例患者年龄23~80岁，中位年龄60岁。其中男56例,女41例；结肠癌38例，直肠癌59例；按全国结直肠癌病理研究规范分类Dukes分期：A+B期58例、C+D期39例。组织分化程度：高分化腺癌24例、中分化腺癌48例、低分化腺癌25例。本研究信息采集得到了患者的知情同意，同时获得了蚌埠医学院附属第一医院伦理委员会批准。
1.2 主要试剂
兔抗人Tcf4单克隆抗体(克隆号：EP2033Y，浓缩型，工作浓度为1∶100)及兔抗人SFRP1多克隆抗体(浓缩型，工作浓度为1∶50)购自abcam公司(美国)；鼠抗人β-catenin单克隆抗体(即用型)及ElivisionTM plus KIT-9903(A、B)检测试剂盒、DAB(二氨基联本胺)显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.3 免疫组化染色方法
免疫组化ElivisionTM plus两步法按试剂盒说明书操作,高压锅煮沸抗原修复。PBS代替一抗作阴性对照,用已知相应蛋白阳性切片作阳性对照。
1.4 结果判断
1.4.1 Tcf4染色结果判定
Tcf4阳性物质定位于细胞核，呈黄色或棕黄色反应。染色结果判断标准参照Zhang等[10]方法，按阳性细胞数所占百分率和肿瘤细胞着色强度综合判定，两者相乘，0～1分为阴性(－)；≥2分为阳性(+)。
1.4.2 β-catenin
以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性标志，阳性物质定位于细胞膜、细胞质和(或)细胞核，染色结果判断标准参照Maruyama等[11]的方法。①细胞膜染色结果判定：>70%的细胞膜出现阳性表达为正常表达，反之为膜表达缺失；②细胞质和(或)细胞核染色结果判定：>10%的细胞出现阳性表达。细胞膜表达缺失及>10%细胞质和(或)细胞核阳性表达均为异位表达。
1.4.3 SFRP1
阳性反应定位于细胞膜和细胞质，呈棕黄色颗粒。染色结果判断标准参照Lee等[12]综合计分法,按阳性着色细胞所占百分数与细胞着色强度两者结合起来计算，两者相加，≤2分为阴性(－)，≥3为阳性(+)。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件，分析Tcf4、β-catenin和SFRP1在各组间表达率的比较及临床病理预后因素的关系采用χ2检验，等级资料两变量相关关系采用Spearman相关分析。Kaplan-Meier和log-rank法分析三者表达阳性组与阴性组生存率差异，Cox多因素分析三者与临床病理因素及预后之间的关系，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Tcf4、β-catenin和SFRP1在结直肠癌及癌旁正常黏膜组织中的表达
Tcf4主要表达于正常肠隐窝的顶端，位于细胞核，如图 1(a)所示，结直肠癌中Tcf4主要在细胞核表达，如图 1(b)所示，细胞膜及细胞质未见表达。Tcf4在结直肠癌及癌旁正常黏膜组织中的阳性表达率分别为81.44%(79/97)和30.00%(12/40)，两组间差异有统计学意义(P<0.01)；SFRP1如图 1(c)、(d)所示在结直肠癌及癌旁正常黏膜组织中的阳性表达率分别为30.93%(30/97)和75.00%(30/40)，两组间差异有统计学意义(P<0.01)；β-catenin在正常结直肠黏膜中几乎全部定位于细胞膜，如图 2(a)所示，极少数有细胞质表达，未见细胞核表达，而在结直肠癌中出现不同程度的细胞膜表达缺失及细胞质和(或)细胞核异位表达，如图 2(b)、(c)、(d)所示，β-catenin在结直肠癌和癌旁正常黏膜组织中的异位表达率分别为73.20%(71/97)和2.50%(1/40)，两组间差异有统计学意义(P<0.01)。
图1
Tcf4和SFRP1在正常肠黏膜及结直肠癌中的表达(ElivisionTM×400)
(a)正常黏膜中Tcf4蛋白表达；(b)结直肠癌组织中Tcf4蛋白表达；(c)正常黏膜中SFRP1表达；(d)结直肠癌组织中SFRP1表达
Figure1. Expression of Tcf4 and SFRP1 in normal mucosa and colorectal carcinoma (ElivisionTM)(a) Tcf4 positive expression in normal mucosa; (b) Tcf4 positive expression in colorectal carcinoma; (c) SFRP1 positive expression in normal mucosa; (d) SFRP1 positive expression in colorectal carcinoma
图2
正常黏膜及结直肠癌组织中β-catenin表达(ElivisionTM×400)
(a)正常黏膜细胞膜表达；(b)癌组织细胞膜表达；(c)癌组织细胞膜表达缺失；(d)癌组织胞质及胞核表达
Figure2. Expression of β-catenin in normal mucosa and colorectal carcinoma(ElivisionTM×400)(a) membranous expression in normal mucosa; (b) membranous expression in colorectal carcinoma; (c) reduced membranous expression in colorectal carcinoma; (d) cytoplasmic and nuclear expression in colorectal carcinoma
2.2 Tcf4、β-catenin和SFRP1在结直肠癌中表达的关系
在97例结直肠癌中，应用Spearman相关分析发现：79例Tcf4阳性表达中，出现63例β-catenin异位表达，经Spearman相关分析发现Tcf4与β-catenin异位表达之间呈正相关关系，而SFRP1与Tcf4和β-catenin异位表达间均存在负相关关系，如表 1所示。
表1
结直肠癌中Tcf4、β-catenin和SFRP1表达的关系
Table1.
The relationship between Tcf4,β-catenin and SFRP1 expression in colorectal carcinoma
2.3 Tcf4、β-catenin和SFRP1表达与结直肠癌临床病理特征的关系
Tcf4表达与肿瘤的浸润深度、组织分化程度、淋巴结转移和Dukes分期有关(P<0.05)，与其它临床病理因素无关。β-catenin异位表达与肿瘤的淋巴结转移、远处转移和Dukes分期有关(P<0.05)。SFRP1表达与肿瘤的浸润深度有关，而与其它临床病理因素均无关(P>0.05)，如表 2所示。
表2
Tcf4、β-catenin和SFRP1表达与结直肠癌临床病理特征的关系
Table2.
The relationship between Tcf4,β-catenin and SFRP1 expression and clinicopathological factors
2.4 多因素预后分析
将患者性别(男与女)、年龄(>60岁组与≤60岁组)、肿瘤大小(>5.0 cm组与≤5.0 cm组)、浸润深度(浆/外膜内浸润组与浆/外膜外浸润组)、分化程度(高分化组与中低分化组)、淋巴结转移(转移组与无转移组)、远处转移(转移组与无转移组)、Dukes分期(A+B组与C+D组)、Tcf4表达(阴性组与阳性组)、β-catenin异位表达(阴性组与阳性组)和SFRP1表达(阴性组与阳性组)等因素引入Cox模型进行多因素预后分析，结果显示SFRP1和β-catenin异位表达水平及Dukes分期是影响结直肠癌患者预后的独立因素(P<0.05，如表 3所示)。
表3
97例结直肠癌患者Cox多因素分析
Table3.
Multivariate survival analysis of 97 patients with colorectal carcinoma
2.5 患者生存分析
在随访的97例结直肠癌患者中,5年总体生存率为46.39%(45/97)。Kaplan-Meier分析显示Tcf4蛋白表达阴性组与阳性组患者生存率存在差异(Log-rank=12.114，P=0.001)，Tcf4阴性组中位生存时间78.6月，5年生存率为83.33%(15/18)；Tcf4表达阳性组中位生存时间49.9月，5年生存率为37.97%(30/79)。Log-rank分析β-catenin异位表达阴性组与阳性组患者生存率存在差异(Log-rank=10.235，P=0.001)，β-catenin异位表达阴性组中位生存时间70.6月，5年生存率为69.23%(18/26)，β-catenin异位表达阳性组中位生存时间49.6月，5年生存率为38.03%(27/71)。SFRP1表达阳性组与阴性组患者生存率存在差异(Log-rank=21.477，P<0.001)，SFRP1表达阴性组中位生存时间为46.1月，5年生存率为29.85%(20/67)；阳性组中位生存时间为76.5月,5年生存率为83.33%(25/30)。各组患者生存曲线如图 3所示。
图3
各组结直肠癌患者生存曲线
Figure3.
Survival curves of colorectal carcinoma patients in different groups
3 讨论
Wnt信号通路是一个复杂的调控网络，一般提到Wnt信号通路主要指的是由β-catenin介导的经典Wnt信号通路，该通路中β-catenin是重要信号传递子和枢纽因子。正常细胞内大量的β-catenin与细胞膜黏附蛋白E-cadherin及α-catenin结合形成复合体，参与细胞间的黏附调控，防止细胞发生转移；少部分游离的β-catenin在胞浆内被其降解复合体磷酸化后由泛素蛋白酶体识别并使之降解，以维持细胞内β-catenin的低水平状态，使核内转录因子处于阻抑状态[13]。激活后的Wnt途径可使GSK-3β/Axin/APC复合体磷酸化而防止β-catenin被降解，稳定的β-catenin能够转移到细胞核内，与核内转录因子Tcf/Lef靶基因结合，诱导多种Tcf/Lef因子相关基因的转录，如细胞周期和凋亡相关基因c-myc和细胞周期蛋白D1(cyclinD1)，血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)，参与肿瘤进展的基因基质金属蛋白酶7(matrix metalloprotease7,MMP7)、MMP26和黏附因子CD44等，进而对人体正常细胞增殖起到调整促进作用[14]。异常Wnt信号通路致癌的关键就在于游离型β-catenin在细胞内的异位表达及Tcf/Lef依赖性靶基因的激活。显然β-catenin在这条信号通路中扮演着极其重要的角色，是整条通路的关键枢纽分子。因此，β-catenin由胞浆向胞核的转移被认为是该信号通路被激活后行使其功能的重要特征[15]，该信号通路的异常与结肠癌发生发展密切相关。
Tcf最初被确定为T和B淋巴细胞特异性转录因子，近年来研究证实其在肿瘤的发生、发展中发挥重要的作用[16]。Tcf家族包括Tcf1、Lef-1、Tcf3及Tcf4，研究认为Tcf4在结肠癌中呈高表达[4, 17]。Tcf4蛋白结构域的N端具有β-catenin结合结构域(β-catenin binding domain,CBD),研究表明Tcf4是具有双向调节功能的转录因子[18]，当Wnt信号通路激活时，游离的β-catenin在细胞质内稳定、积累及进入细胞核，与Tcf4形成复合体激活下游靶癌基因；而在无Wnt信号时，Tcf4通过与多种抑制蛋白相互作用，特异性结合Wnt信号通路下游靶基因，保持靶基因关闭，发挥阻碍作用。因此，Tcf4/β-catenin复合体及下游靶基因的激活转录是结直肠癌细胞恶性转化的重要标志，也是Wnt信号传递的重要步骤[5, 17]。本实验研究发现，在正常大肠黏膜上皮细胞中β-catenin呈膜完整性表达，而在结直肠癌中出现不同程度细胞膜表达缺失或细胞质和细胞核的异位表达，经统计两者的表达差异均有统计学意义(P<0.01)，可以推测在结直肠癌的发生发展中Wnt信号通路可能处于激活状态。本研究观察在正常大肠黏膜上皮中，Tcf4在肠隐窝顶端上皮细胞核中表达最高，到肠绒毛表达逐步下降，在结直肠癌细胞中呈现细胞核高表达。分析Tcf4表达与β-catenin异位表达的关系，发现79例Tcf4表达的结直肠癌组织中，63例呈现β-catenin的异位表达，提示Tcf4表达与β-catenin异位表达存在显著的相关性(r=0.310,P=0.002)。本研究发现，Tcf4表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及Dukes分期相关，与Wang等[19]研究具有一致性；β-catenin异位表达与淋巴结转移、远处转移及Dukes分期相关。本实验研究提示Tcf4蛋白表达与β-catenin异位表达参与了结直肠癌的侵袭、转移过程，是结直肠癌高侵袭性、高增殖活性及转移潜能的因素之一。
在Wnt信号通路中，Frz胞外的N端有一个富含半胱氨酸的结构域(cysteine rich domain,CRD)，能与Wnt糖蛋白结合。SFRP结构上与Frz受体具有30%~50%相同序列的CRD，可与Frz结合或形成无功能复合物抑制Frz受体而抑制Wnt信号通路的活动。SFRP是Wnt信号上游抑制基因，而SFRP基因启动子的甲基化或缺失导致基因表达下调或沉默后，对Wnt信号通路的抑制作用减弱，使Wnt信号通路持续存在，从而促进肿瘤的形成与发展，可见SFRP是Wnt途径的负性调节因子。SFRP1是一种分泌性糖蛋白，是SFRPs家族重要成员之一。近年的研究表明，SFRP1通过启动子的甲基化而失活[8, 20-21]，是一种新的肿瘤抑制基因。研究认为，当结直肠癌细胞中SFRP1功能重新恢复时，SFRP1不仅能减少Wnt信号通路的活动，且能减少Wnt信号通路下游突变的发生，从而抑制肿瘤进展。本实验检测97例结直肠癌及40例相应的癌旁组织中SFRP1的表达情况，结果显示SFRP1在结直肠癌组织中的表达显著低于正常大肠黏膜组织(P<0.01)，提示SFRP1可能在抑制大肠细胞恶性转化和异常增生中发挥着重要作用。SFRP1在结直肠癌中表达降低，可能与其启动子甲基化导致SFRP1基因的转录表达受到抑制有关，关于SFRP1基因启动子甲基化水平情况，将在我们后续实验中继续研究。本研究观察SFRP1表达与Tcf4和β-catenin异位表达的关系，发现SFRP1表达下调的结直肠癌组织中，Tcf4和β-catenin异位表达明显增高，经Spearman相关分析发现SFRP1与Tcf4和β-catenin异位表达间均存在负相关关系(r=－0.60,P<0.01；r=－0.57，P<0.01)，提示SFRP1表达缺失可能是引起β-catenin异位表达，形成β-Catenin/Tcf4蛋白复合体的机制之一，并可能通过Wnt/β-catenin信号通路的活化参与结直肠癌的发生。通过多因素分析显示，SFRP1和β-catenin异位表达及Dukes分期是结直肠癌根治后患者的独立预后因素。进一步生存分析显示，Tcf4和β-catenin异位表达与患者低生存率有关，而SFRP1阳性组5年生存率则显著高于阴性组，提示SFRP1作为Wnt通路抑制基因在结直肠癌组织中表达下调，可能引起Wnt通路激活，导致在结直肠癌组织中β-catenin异位表达、Tcf4出现高表达，促进了结直肠癌的发生、发展。如果能够恢复SFRP1的表达，来拮抗Wnt/β-catenin信号通路，或开发针对β-catenin结合位点的生物小肽，竞争性抑制Tcf4/β-catenin复合体形成，从而阻断Wnt下游靶基因的传导，将会为结直肠癌的治疗开辟新的途径。
引言
目前结直肠癌已成为世界第三大常见的恶性肿瘤，近年来由于饮食结构、生活习惯和环境的改变，加上缺乏运动，在我国大肠癌的发病率也逐年上升。通过对散发性和遗传性结直肠癌的研究显示，Wnt信号传导通路在其中扮演着核心的角色。β-catenin是此通路中重要的信号传递因子，也是重要的枢纽因子。Wnt信号通路可以通过发挥抑制细胞质内GSK-3β、Axin和APC的相互作用，防止细胞质内的β-catenin被降解，使稳定的β-catenin能够转移到细胞核内，与核内转录因子T细胞因子/淋巴细胞增强因子(T cell transcriptional factor/ lymphid enhancer factor,Tcf/Lef)结合，诱导多种相关靶基因的转录，从而控制胚胎发育及细胞生长、分化及凋亡等。目前研究认为，该Wnt信号通路的异常与结肠癌发生发展密切相关[1-2]，大约90%以上的结直肠癌存在Wnt/β-catenin信号转导通路的异常激活[3]。T细胞因子4(T cell factor 4,Tcf4)是Tcf家族在人正常结肠上皮唯一表达的重要成员，Tcf4 mRNA也是在所有结肠癌细胞系中表达最强烈的，说明Tcf4基因在结肠癌的发生发展中起重要作用[4]。Tcf4/β-catenin复合体及下游靶基因的激活转录是结直肠癌细胞恶性转化的一个标志[5]。作为Wnt信号通路中的分子开关[6-7],在调控细胞癌变过程中有双重效应,Tcf4既能通过抑制细胞过度生长、防止肿瘤发生,又可促进细胞增殖分化。因而Wnt信号通过Tcf4的开关状态不仅调控机体的生长、发育、分化等基本生理功能，还可对肿瘤的发生进行调控。
分泌型卷曲相关蛋白1(secreted frizzled related protein 1,SFRP1)是新近发现的与肿瘤发生相关的一个重要基因，被认为是一种抑癌基因[8]，它通过干扰Wnt糖蛋白(配体)与Frizzled受体间的相互作用而阻断Wnt信号通路，是Wnt信号通路的负调控因子。研究发现[9]，SFRP1在结直肠肿瘤中mRNA表达水平下调，且由正常肠黏膜→腺瘤→结直肠癌下调水平呈上升趋势，提示SFRP1作为Wnt通路的拮抗剂对防止结直肠肿瘤的发生、发展起一定作用。目前国内外关于SFRP1与Tcf4/β-catenin复合体在恶性肿瘤中的研究报道均较少，本实验检测97例结直肠癌及相应40例正常组织中Tcf4、β-catenin及SFRP1的表达情况，并分析其与结直肠癌患者临床病理因素的关系，探讨其在结直肠癌发生、发展中的作用及其预后关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象和标本来源
收集蚌埠医学院第一附属医院2005年1月－2006年12月，经手术切除的存档石蜡包埋结直肠癌组织标本97例和及相对应正常结直肠黏膜组织40例(所有患者术前均未给予放疗、化疗及免疫治疗，术后均经常规组织病理证实)，所有病例均有完整的临床、病理及随访资料。所选病例随访至患者死亡或截止至2012年12月，随访时间为8～96个月。所有病例均无遗传性结直肠肿瘤病史。97例患者年龄23~80岁，中位年龄60岁。其中男56例,女41例；结肠癌38例，直肠癌59例；按全国结直肠癌病理研究规范分类Dukes分期：A+B期58例、C+D期39例。组织分化程度：高分化腺癌24例、中分化腺癌48例、低分化腺癌25例。本研究信息采集得到了患者的知情同意，同时获得了蚌埠医学院附属第一医院伦理委员会批准。
1.2 主要试剂
兔抗人Tcf4单克隆抗体(克隆号：EP2033Y，浓缩型，工作浓度为1∶100)及兔抗人SFRP1多克隆抗体(浓缩型，工作浓度为1∶50)购自abcam公司(美国)；鼠抗人β-catenin单克隆抗体(即用型)及ElivisionTM plus KIT-9903(A、B)检测试剂盒、DAB(二氨基联本胺)显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.3 免疫组化染色方法
免疫组化ElivisionTM plus两步法按试剂盒说明书操作,高压锅煮沸抗原修复。PBS代替一抗作阴性对照,用已知相应蛋白阳性切片作阳性对照。
1.4 结果判断
1.4.1 Tcf4染色结果判定
Tcf4阳性物质定位于细胞核，呈黄色或棕黄色反应。染色结果判断标准参照Zhang等[10]方法，按阳性细胞数所占百分率和肿瘤细胞着色强度综合判定，两者相乘，0～1分为阴性(－)；≥2分为阳性(+)。
1.4.2 β-catenin
以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性标志，阳性物质定位于细胞膜、细胞质和(或)细胞核，染色结果判断标准参照Maruyama等[11]的方法。①细胞膜染色结果判定：>70%的细胞膜出现阳性表达为正常表达，反之为膜表达缺失；②细胞质和(或)细胞核染色结果判定：>10%的细胞出现阳性表达。细胞膜表达缺失及>10%细胞质和(或)细胞核阳性表达均为异位表达。
1.4.3 SFRP1
阳性反应定位于细胞膜和细胞质，呈棕黄色颗粒。染色结果判断标准参照Lee等[12]综合计分法,按阳性着色细胞所占百分数与细胞着色强度两者结合起来计算，两者相加，≤2分为阴性(－)，≥3为阳性(+)。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件，分析Tcf4、β-catenin和SFRP1在各组间表达率的比较及临床病理预后因素的关系采用χ2检验，等级资料两变量相关关系采用Spearman相关分析。Kaplan-Meier和log-rank法分析三者表达阳性组与阴性组生存率差异，Cox多因素分析三者与临床病理因素及预后之间的关系，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Tcf4、β-catenin和SFRP1在结直肠癌及癌旁正常黏膜组织中的表达
Tcf4主要表达于正常肠隐窝的顶端，位于细胞核，如图 1(a)所示，结直肠癌中Tcf4主要在细胞核表达，如图 1(b)所示，细胞膜及细胞质未见表达。Tcf4在结直肠癌及癌旁正常黏膜组织中的阳性表达率分别为81.44%(79/97)和30.00%(12/40)，两组间差异有统计学意义(P<0.01)；SFRP1如图 1(c)、(d)所示在结直肠癌及癌旁正常黏膜组织中的阳性表达率分别为30.93%(30/97)和75.00%(30/40)，两组间差异有统计学意义(P<0.01)；β-catenin在正常结直肠黏膜中几乎全部定位于细胞膜，如图 2(a)所示，极少数有细胞质表达，未见细胞核表达，而在结直肠癌中出现不同程度的细胞膜表达缺失及细胞质和(或)细胞核异位表达，如图 2(b)、(c)、(d)所示，β-catenin在结直肠癌和癌旁正常黏膜组织中的异位表达率分别为73.20%(71/97)和2.50%(1/40)，两组间差异有统计学意义(P<0.01)。
图1
Tcf4和SFRP1在正常肠黏膜及结直肠癌中的表达(ElivisionTM×400)
(a)正常黏膜中Tcf4蛋白表达；(b)结直肠癌组织中Tcf4蛋白表达；(c)正常黏膜中SFRP1表达；(d)结直肠癌组织中SFRP1表达
Figure1. Expression of Tcf4 and SFRP1 in normal mucosa and colorectal carcinoma (ElivisionTM)(a) Tcf4 positive expression in normal mucosa; (b) Tcf4 positive expression in colorectal carcinoma; (c) SFRP1 positive expression in normal mucosa; (d) SFRP1 positive expression in colorectal carcinoma
图2
正常黏膜及结直肠癌组织中β-catenin表达(ElivisionTM×400)
(a)正常黏膜细胞膜表达；(b)癌组织细胞膜表达；(c)癌组织细胞膜表达缺失；(d)癌组织胞质及胞核表达
Figure2. Expression of β-catenin in normal mucosa and colorectal carcinoma(ElivisionTM×400)(a) membranous expression in normal mucosa; (b) membranous expression in colorectal carcinoma; (c) reduced membranous expression in colorectal carcinoma; (d) cytoplasmic and nuclear expression in colorectal carcinoma
2.2 Tcf4、β-catenin和SFRP1在结直肠癌中表达的关系
在97例结直肠癌中，应用Spearman相关分析发现：79例Tcf4阳性表达中，出现63例β-catenin异位表达，经Spearman相关分析发现Tcf4与β-catenin异位表达之间呈正相关关系，而SFRP1与Tcf4和β-catenin异位表达间均存在负相关关系，如表 1所示。
表1
结直肠癌中Tcf4、β-catenin和SFRP1表达的关系
Table1.
The relationship between Tcf4,β-catenin and SFRP1 expression in colorectal carcinoma
2.3 Tcf4、β-catenin和SFRP1表达与结直肠癌临床病理特征的关系
Tcf4表达与肿瘤的浸润深度、组织分化程度、淋巴结转移和Dukes分期有关(P<0.05)，与其它临床病理因素无关。β-catenin异位表达与肿瘤的淋巴结转移、远处转移和Dukes分期有关(P<0.05)。SFRP1表达与肿瘤的浸润深度有关，而与其它临床病理因素均无关(P>0.05)，如表 2所示。
表2
Tcf4、β-catenin和SFRP1表达与结直肠癌临床病理特征的关系
Table2.
The relationship between Tcf4,β-catenin and SFRP1 expression and clinicopathological factors
2.4 多因素预后分析
将患者性别(男与女)、年龄(>60岁组与≤60岁组)、肿瘤大小(>5.0 cm组与≤5.0 cm组)、浸润深度(浆/外膜内浸润组与浆/外膜外浸润组)、分化程度(高分化组与中低分化组)、淋巴结转移(转移组与无转移组)、远处转移(转移组与无转移组)、Dukes分期(A+B组与C+D组)、Tcf4表达(阴性组与阳性组)、β-catenin异位表达(阴性组与阳性组)和SFRP1表达(阴性组与阳性组)等因素引入Cox模型进行多因素预后分析，结果显示SFRP1和β-catenin异位表达水平及Dukes分期是影响结直肠癌患者预后的独立因素(P<0.05，如表 3所示)。
表3
97例结直肠癌患者Cox多因素分析
Table3.
Multivariate survival analysis of 97 patients with colorectal carcinoma
2.5 患者生存分析
在随访的97例结直肠癌患者中,5年总体生存率为46.39%(45/97)。Kaplan-Meier分析显示Tcf4蛋白表达阴性组与阳性组患者生存率存在差异(Log-rank=12.114，P=0.001)，Tcf4阴性组中位生存时间78.6月，5年生存率为83.33%(15/18)；Tcf4表达阳性组中位生存时间49.9月，5年生存率为37.97%(30/79)。Log-rank分析β-catenin异位表达阴性组与阳性组患者生存率存在差异(Log-rank=10.235，P=0.001)，β-catenin异位表达阴性组中位生存时间70.6月，5年生存率为69.23%(18/26)，β-catenin异位表达阳性组中位生存时间49.6月，5年生存率为38.03%(27/71)。SFRP1表达阳性组与阴性组患者生存率存在差异(Log-rank=21.477，P<0.001)，SFRP1表达阴性组中位生存时间为46.1月，5年生存率为29.85%(20/67)；阳性组中位生存时间为76.5月,5年生存率为83.33%(25/30)。各组患者生存曲线如图 3所示。
图3
各组结直肠癌患者生存曲线
Figure3.
Survival curves of colorectal carcinoma patients in different groups
3 讨论
Wnt信号通路是一个复杂的调控网络，一般提到Wnt信号通路主要指的是由β-catenin介导的经典Wnt信号通路，该通路中β-catenin是重要信号传递子和枢纽因子。正常细胞内大量的β-catenin与细胞膜黏附蛋白E-cadherin及α-catenin结合形成复合体，参与细胞间的黏附调控，防止细胞发生转移；少部分游离的β-catenin在胞浆内被其降解复合体磷酸化后由泛素蛋白酶体识别并使之降解，以维持细胞内β-catenin的低水平状态，使核内转录因子处于阻抑状态[13]。激活后的Wnt途径可使GSK-3β/Axin/APC复合体磷酸化而防止β-catenin被降解，稳定的β-catenin能够转移到细胞核内，与核内转录因子Tcf/Lef靶基因结合，诱导多种Tcf/Lef因子相关基因的转录，如细胞周期和凋亡相关基因c-myc和细胞周期蛋白D1(cyclinD1)，血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)，参与肿瘤进展的基因基质金属蛋白酶7(matrix metalloprotease7,MMP7)、MMP26和黏附因子CD44等，进而对人体正常细胞增殖起到调整促进作用[14]。异常Wnt信号通路致癌的关键就在于游离型β-catenin在细胞内的异位表达及Tcf/Lef依赖性靶基因的激活。显然β-catenin在这条信号通路中扮演着极其重要的角色，是整条通路的关键枢纽分子。因此，β-catenin由胞浆向胞核的转移被认为是该信号通路被激活后行使其功能的重要特征[15]，该信号通路的异常与结肠癌发生发展密切相关。
Tcf最初被确定为T和B淋巴细胞特异性转录因子，近年来研究证实其在肿瘤的发生、发展中发挥重要的作用[16]。Tcf家族包括Tcf1、Lef-1、Tcf3及Tcf4，研究认为Tcf4在结肠癌中呈高表达[4, 17]。Tcf4蛋白结构域的N端具有β-catenin结合结构域(β-catenin binding domain,CBD),研究表明Tcf4是具有双向调节功能的转录因子[18]，当Wnt信号通路激活时，游离的β-catenin在细胞质内稳定、积累及进入细胞核，与Tcf4形成复合体激活下游靶癌基因；而在无Wnt信号时，Tcf4通过与多种抑制蛋白相互作用，特异性结合Wnt信号通路下游靶基因，保持靶基因关闭，发挥阻碍作用。因此，Tcf4/β-catenin复合体及下游靶基因的激活转录是结直肠癌细胞恶性转化的重要标志，也是Wnt信号传递的重要步骤[5, 17]。本实验研究发现，在正常大肠黏膜上皮细胞中β-catenin呈膜完整性表达，而在结直肠癌中出现不同程度细胞膜表达缺失或细胞质和细胞核的异位表达，经统计两者的表达差异均有统计学意义(P<0.01)，可以推测在结直肠癌的发生发展中Wnt信号通路可能处于激活状态。本研究观察在正常大肠黏膜上皮中，Tcf4在肠隐窝顶端上皮细胞核中表达最高，到肠绒毛表达逐步下降，在结直肠癌细胞中呈现细胞核高表达。分析Tcf4表达与β-catenin异位表达的关系，发现79例Tcf4表达的结直肠癌组织中，63例呈现β-catenin的异位表达，提示Tcf4表达与β-catenin异位表达存在显著的相关性(r=0.310,P=0.002)。本研究发现，Tcf4表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及Dukes分期相关，与Wang等[19]研究具有一致性；β-catenin异位表达与淋巴结转移、远处转移及Dukes分期相关。本实验研究提示Tcf4蛋白表达与β-catenin异位表达参与了结直肠癌的侵袭、转移过程，是结直肠癌高侵袭性、高增殖活性及转移潜能的因素之一。
在Wnt信号通路中，Frz胞外的N端有一个富含半胱氨酸的结构域(cysteine rich domain,CRD)，能与Wnt糖蛋白结合。SFRP结构上与Frz受体具有30%~50%相同序列的CRD，可与Frz结合或形成无功能复合物抑制Frz受体而抑制Wnt信号通路的活动。SFRP是Wnt信号上游抑制基因，而SFRP基因启动子的甲基化或缺失导致基因表达下调或沉默后，对Wnt信号通路的抑制作用减弱，使Wnt信号通路持续存在，从而促进肿瘤的形成与发展，可见SFRP是Wnt途径的负性调节因子。SFRP1是一种分泌性糖蛋白，是SFRPs家族重要成员之一。近年的研究表明，SFRP1通过启动子的甲基化而失活[8, 20-21]，是一种新的肿瘤抑制基因。研究认为，当结直肠癌细胞中SFRP1功能重新恢复时，SFRP1不仅能减少Wnt信号通路的活动，且能减少Wnt信号通路下游突变的发生，从而抑制肿瘤进展。本实验检测97例结直肠癌及40例相应的癌旁组织中SFRP1的表达情况，结果显示SFRP1在结直肠癌组织中的表达显著低于正常大肠黏膜组织(P<0.01)，提示SFRP1可能在抑制大肠细胞恶性转化和异常增生中发挥着重要作用。SFRP1在结直肠癌中表达降低，可能与其启动子甲基化导致SFRP1基因的转录表达受到抑制有关，关于SFRP1基因启动子甲基化水平情况，将在我们后续实验中继续研究。本研究观察SFRP1表达与Tcf4和β-catenin异位表达的关系，发现SFRP1表达下调的结直肠癌组织中，Tcf4和β-catenin异位表达明显增高，经Spearman相关分析发现SFRP1与Tcf4和β-catenin异位表达间均存在负相关关系(r=－0.60,P<0.01；r=－0.57，P<0.01)，提示SFRP1表达缺失可能是引起β-catenin异位表达，形成β-Catenin/Tcf4蛋白复合体的机制之一，并可能通过Wnt/β-catenin信号通路的活化参与结直肠癌的发生。通过多因素分析显示，SFRP1和β-catenin异位表达及Dukes分期是结直肠癌根治后患者的独立预后因素。进一步生存分析显示，Tcf4和β-catenin异位表达与患者低生存率有关，而SFRP1阳性组5年生存率则显著高于阴性组，提示SFRP1作为Wnt通路抑制基因在结直肠癌组织中表达下调，可能引起Wnt通路激活，导致在结直肠癌组织中β-catenin异位表达、Tcf4出现高表达，促进了结直肠癌的发生、发展。如果能够恢复SFRP1的表达，来拮抗Wnt/β-catenin信号通路，或开发针对β-catenin结合位点的生物小肽，竞争性抑制Tcf4/β-catenin复合体形成，从而阻断Wnt下游靶基因的传导，将会为结直肠癌的治疗开辟新的途径。
