尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)是细胞外膜蛋白。uPAR不仅在恶性肿瘤细胞中表达明显增高,同时在肿瘤间质中也表达增强。本研究将uPAR作为分子靶点,以人类氨基末端片段(hATF)作为靶向原件标记超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO),利用该靶向探针在uPAR中度表达的HT29荷瘤裸鼠体内验证该探针的影像效能。体外通过流式细胞术检测细胞uPAR表达量,普鲁士蓝染色以及细胞MRI扫描检测探针的特异性,MRI扫描荷瘤裸鼠检测探针体内的成像效能,并通过病理学检查显示探针在肿瘤内分布情况。结果显示,不同肿瘤细胞具有不同uPAR表达特性,在筛选的细胞系中,Hela为uPAR强阳性细胞,HT29为uPAR中度阳性细胞,Lovo则为uPAR阴性细胞。体外试验利用强表达uPAR的Hela细胞与hATF-SPIO探针共同孵育,通过普鲁士蓝染色及MRI细胞扫描发现,hATF-SPIO能够特异性结合Hela细胞且使得其T2WI信号明显减低;而对照组Lovo细胞MRI信号值在探针孵育前后未见明显变化,普鲁士蓝染色也未见hATF-SPIO在Lovo细胞中的滞留。MRI动物扫描显示hATF-SPIO探针能够随着血流达到HT29移植瘤且使得HT29肿瘤在T2加权相上较Lovo移植瘤信号降低,在探针注入后24 h,两者信号值有明显差异;随后肿瘤组织的普鲁士蓝染色观察显示hATF-SPIO探针在HT29移植瘤内存留。综上所述,通过实验证明hATF-SPIO不仅在体外能够靶向结合uPAR表达的肿瘤细胞,并能够在体内靶向显影uPAR中度表达的结肠肿瘤。
引用本文： 张舒, 王磊, 陈露, 许华燕, 吴强, 毕锋, 郜发宝, 许峰. 标记hATF的超顺磁性氧化铁纳米颗粒探针在结肠癌肿瘤模型中的分子影像. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(5): 1067-1074. doi: 10.7507/1001-5515.20150189 复制
引言
结直肠癌是消化道恶性肿瘤的一种，发病率及病死率在所有恶性肿瘤中排名第三。然而，研究表明非远端转移的结直肠癌患者5年生存率可达70%～90%[1]，因此有效的早期筛查能够使结直肠癌患者生存获益。众多成像系统中，核磁共振成像(magnetic resonance image，MRI)具有良好的组织分辨率及解析率，能够探测深部组织病变，同时没有潜在的放射性损伤，因此广泛用于肿瘤检测。近年来，随着纳米技术的发展，很多新型纳米材料已用于分子影像，使分子影像技术的特异性及灵敏度均得以提高[2-3]。以MRI作为成像系统，采用超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide particle，SPIO)的靶向探针已在多种肿瘤诊断和治疗中得到应用[4-6]。这些靶向肿瘤的SPIO作为MRI的T2造影剂不仅能够提高MRI检测微小病变及转移灶的灵敏度，而且还能作为载物平台，携带药物或者核酸进入目的组织，提高疗效[7]。然而，这些SPIO用于肿瘤靶向显影时也有诸多不足之处，主要问题在于：①肿瘤血管的无序性使得探针在肿瘤内分布不均匀；②由于肿瘤间质的阻碍，探针穿过肿瘤新生血管间隙后聚集在肿瘤新生血管周围，很难通过肿瘤间质直接作用于肿瘤实质细胞。这些留存于间质中却未能特异性结合在相应受体上的探针，将被单核巨噬系统吞噬并清除，导致检测效能降低。因此，若选取能特异表达在肿瘤细胞表面及间质细胞的生物学标记作为靶点，则能够增加靶向SPIO在肿瘤组织中的存留，从而在一定程度上解决这些问题。
尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogen activator receptor,uPAR)是一种与肿瘤增殖、转移及血管生成相关的膜蛋白。uPAR不仅表达于肿瘤细胞表面，还表达在肿瘤间质的成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞膜表面[8-10]。近年来，将uPAR作为靶点的正电子发射计算机断层显像/计算机断层成像(positron emission tomography/computed tomography,PET/CT)以及MRI造影剂已在胰腺癌、胶质瘤、乳腺癌和前列腺癌中显影成功[11-14]。病理研究显示，结直肠癌肿瘤组织uPAR表达阳性，且在肿瘤微浸润间质部分表达也明显增高[15]，并提示不良预后。因此，本研究利用uPAR靶向的MRI探针作为显影剂，通过建立肿瘤裸鼠模型，检测该靶向探针在uPAR中度表达的结肠癌模型中的显影特性。
1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌Hela细胞、人结肠癌HT29细胞和Lovo细胞均获赠于四川大学临床医学院信号传导实验室；实验用裸鼠购自四川达硕实验动物公司；胎牛血清购自Gibco公司；青霉素/链霉素双抗、DMEM培养基和胰蛋白酶购自Hyclone公司；Matrigel基质膜基质购自B&D公司；流式细胞术uPAR单克隆抗体和小鼠IgG1同型对照(isotype control，ISO)购自eBioscience公司；普鲁士蓝染色试剂盒购自Solarbio公司；2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐(WST/CCK-8)购自同仁公司；异氟烷购自瑞沃德公司。
1.2 细胞系以及动物模型
Hela宫颈癌细胞系、HT29人结肠癌细胞系和Lovo人结肠癌细胞系均采用含100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青霉素/链霉素双抗的DMEM高糖培养基，放置于37 ℃、50 mL/L浓度CO2孵箱中培养。在体外试验、探针靶向特异性实验中，由于HT29抱团生长，不利于实验的观察，因此将Hela细胞作为阳性对照。所有动物实验均为4~6周龄雌性裸鼠。取对数生长期的肿瘤细胞，2.5 g/L胰酶消化离心收集细胞，PBS配制细胞悬液且调整活细胞浓度2×107个/mL，并加入等体积的高浓度Matrigel，HT29细胞以及Lovo细胞均按照1×106个/只分别接种于裸鼠右下肢及左下肢皮下，肿瘤最大直径达到8 mm时，进行MRI扫描。肿瘤直径通过游标卡尺测量。
1.3 hATF-SPIO探针合成
人类氨基末端片段(human amino-terminal fragment，hATF)包含135 个氨基酸是uPAR天然受体尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator,uPA)的氨基酸末端片段，hATF包含的7个氨基酸构成的Ω环，是与uPAR高度亲和的二级结构[16-18]，其解离常数值(Kd)低于1 nmol/L，并且能与uPA竞争结合肿瘤及内皮细胞上的uPAR，同时抑制肿瘤生长及血管的生成[19]。hATF-SPIO探针获赠于Emory大学Lily Y教授实验室，合成方法参照文献[11]。10 nm铁磁性核心包裹分子量为2 000的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，再与重组蛋白hATF连接，形成水合粒径约30 nm的靶向探针hATF-SPIO。
1.4 流式细胞术检测uPAR的表达
20 g/L EDTA溶液消化贴壁肿瘤细胞，计数并收集1×106个活细胞，PBS溶液清洗3次，弃上清，加入300 μL PBS重悬细胞。将细胞悬液均分为3组，分别加入5 μL APC标记小鼠抗人uPAR抗体(eBioscience)、5 μL APC标记小鼠IgG1κ ISO或等量的PBS溶液，4 ℃避光孵育30 min。每组细胞加入适量PBS清洗1次并弃上清，300 μL PBS溶液重悬细胞，上机检测(NAVIOS,BECKMAN COULTER)，并根据ISO荧光强度设置检测阈值，每种细胞系至少重复检测3次。
1.5 CCK-8 实验检测细胞存活率
取对数生长期肿瘤细胞接种于96孔培养板，2 000个/孔，轻摇混匀，置于37 ℃、50 mL/L浓度CO2孵箱中培养24 h。将35 μg/mL和70 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO探针加入到对应试验孔中，与细胞共同孵育，于不同时间点(4、24、48 h)，进行CCK-8试验。CCK-8原液与培养液按1∶10比例配制预混液，每孔加100 μL混液，避光继续孵育2～4 h。Micro-ELISA仪读取吸光度，490 nm波长下测定各孔光吸收值A，计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(A加药－A空白)/(A对照－A空白)×100%。
1.6 MRI扫描
1.6.1 细胞实验
计数接种1×106个Lovo细胞和Hela细胞培养贴壁，分别与30 μg/mL和15 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO探针共同孵育24 h，收集细胞，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗1次，弃上清，重悬于10 mg/mL琼脂糖凝胶中，待凝胶固定后行MRI扫描。
1.6.2 动物实验
荷瘤裸鼠固定后，采用异氟烷/氧气(V/V，1∶1)气体麻醉，待呼吸频率稳定于20~30次/min时，鼠尾静脉以400 pmol/只(即每只给予0.4 mg含Fe量的hATF-SPIO探针)浓度注入hATF-SPIO探针。每只实验裸鼠于注入探针前及注入探针后12、24和48 h，7T MRI(Bruker Biospec)扫描。扫描采用T2 RARE序列：TR=3 000 ms;TE=45 ms;Matrix=256×256;FOV=30 mm;层厚=1 mm。SPIO探针为MRI的T2对比剂，因此选用T2WI观测探针在体内的分析信号强度(signal intensity，SI)随时间的变化。感兴趣区(region of interest,ROI)选择：ROI选择在肿瘤最大层面，沿肿瘤边界包绕整个肿瘤切面，且排除坏死区域，每层至少包含50 个像素[20]。
1.7 病理学检测
1.7.1 细胞实验
Hela和Lovo细胞以5 000个/孔接种于24孔板，以30 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO探针共同孵育24 h后行普鲁士蓝染色。
1.7.2 动物实验
所有荷瘤裸鼠MRI扫描后，颈椎脱臼法处死，分离肿瘤组织，以40 g/L多聚甲醛固定和石蜡包埋切片。HE染色观察肿瘤情况以及普鲁士蓝染色检测肿瘤组织中SPIO的分布。
1.8 统计学方法
本实验数据均为重复3次以上的结果，计量结果采用均数±标准差表示，用SPSS 13.0软件处理；两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 荷瘤裸鼠模型的建立
荷瘤裸鼠寄养于四川大学华西临床医学院科技园动物实验中心SPF级裸鼠饲养间。5只裸鼠接种肿瘤后均存活，2种肿瘤细胞系成瘤率为100%。
2.2 流式细胞术检测
我们总共筛查了3种结肠癌细胞系，如图 1所示，检测了在不同细胞系中uPAR表达阳性的细胞占细胞总量的百分比，HT29细胞uPAR表达阳性率为21.89％±4.96%，与Lovo细胞表达率(0.055%±0.055%)比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。作为体外实验的阳性对照细胞Hela，其uPAR表达阳性率为95.43％±0.726%，与Lovo细胞比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。因此，流式细胞术检测显示，Hela为uPAR强阳性表达细胞，Lovo为uPAR表达阴性细胞，而HT29为uPAR中度表达的细胞系，与之前文献相符[21]。
图1
流式细胞术检测不同结肠癌细胞uPAR表达量
Figure1.
uPAR expression of different colon cancer cells measured with Flow cytometry
2.3 探针靶向性分析
35 μg/mL以及70 μg/mL含Fe浓度的hATF-SPIO分别与不同肿瘤细胞共同孵育4、24及48 h，细胞存活率均高于100%，如图 2所示，且各组间差异不具有统计学意义(P＞0.05)。为了排除血清对探针结合受体的干扰，我们采用无血清培养基稀释探针并与细胞孵育24 h。MRI显示Lovo细胞在不同浓度都可查见信号值略低于空白对照组，但不同浓度之间并无明显差异，Hela细胞在含Fe浓度为15 μg/mL的探针作用下时查见其MRI信号减低，随着探针浓度的增加，信号降低更明显，如图 3所示。为了验证hATF-SPIO在细胞内的分布，通过普鲁士蓝染色显示30 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO能靶向结合uPAR表达强阳性的Hela细胞，并且进入到Hela细胞胞质中，而uPAR表达阴性的Lovo细胞内并未查见铁染颗粒，如图 4所示。
图2
CCK-8检测不同浓度探针作用下肿瘤细胞存活率
Figure2.
Survival rate tests of tumor cells measured with CCK-8 incubated with different hATF-SPIO
图3
不同肿瘤细胞hATF-SPIO孵育后的MRI检测
Figure3.
MRI for different tumor cells incubated with hATF-SPIO
图4
不同肿瘤细胞与30 μg/mL含Fe量hATF-SPIO孵育后普鲁士蓝检测
Figure4.
Prussian blue staining for different tumor cells incubated with hATF-SPIO
2.4 MRI动物扫描
在注射探针之前，HT29肿瘤与Lovo肿瘤的SI值没有明显差异(P＞0.05)。探针注入后，两种肿瘤SI值均有下降；在12 h与24 h时，HT29肿瘤的SI值较Lovo肿瘤的SI值更低，且差异均有统计学意义(P＜0.05)。在48 h时，两种肿瘤SI值没有明显差异(P＞0.05，如表 1所示)。在T2WI图像上，HT29移植瘤在12 h时出现局部低信号影，且一直持续到48 h，而Lovo移植瘤则没有变化，如图 5所示。hATF-SPIO注入裸鼠体内后，由于网状内皮细胞的摄取，使得肝脏和脾脏在T2WI上的信号在30 min内出现明显减低，持续至48 h，如图 6所示。
图5
hATF-SPIO注射后T2 RARE序列不同结肠癌组织MR图像
红色虚线：HT29肿瘤；绿色虚线：Lovo肿瘤
Figure5. T2 RARE weighted image of colon xenografts after injection of hATF-SPIOred dotted line: HT29 xenograft; green dotted line: Lovo xenograft
图6
hATF-SPIO注射后T2 RARE序列脾脏MR图像
黄色虚线：脾脏；蓝色虚线：肝脏
Figure6. T2 RARE weighted image of spleen after injection of hATF-SPIOyellow dotted line: spleen; blue dotted line: liver
表1
T2WI序列不同肿瘤各时间点信号强度变化
Table1.
Changes in tumor signal intensity after probe injections in T2WI sequence
2.5 病理学分析
HE染色可见HT29皮下移植瘤呈巢团样，且瘤体组织周围被肿瘤间质包裹，以成纤维细胞为主，整个肿瘤组织内未见坏死区域；Lovo皮下移植瘤查见大量肿瘤实质细胞，瘤体内间质较HT29移植瘤更少，整个瘤体也未见坏死区域，但局部可见少量充血。通过普鲁士蓝染色，可以明确SPIO在肿瘤的分布情况。在uPAR表达阴性的Lovo皮下移植瘤内未查见SPIO的分布，HT29皮下移植瘤内可见铁染色阳性，如图 7所示。
图7
不同肿瘤组织的普鲁士蓝及HE染色(200×)
Figure7.
HE stain and Prussian blue stain for tumor sections(200×)
3 讨论
非靶向的SPIO作为血池造影剂显影肿瘤组织时，由于肿瘤新生血管内皮的不连续性，使得血池中的SPIO能够通过血管内皮间隙进入到肿瘤组织中，肿瘤组织缺乏淋巴回流系统，因此SPIO能够在肿瘤中停留，此被动靶向的过程称为高通透性和滞留效应(enhance permeability and retention effect,EPR)[22]。EPR效应是探针到达肿瘤局部的必要条件，然而肿瘤新生血管的无序性以及肿瘤间质的阻碍，不仅会影响SPIO的滲入，同时干扰了靶向SPIO与受体的结合，导致未能结合SPIO，很快被巨噬细胞吞噬清除，从而降低了显影效能。连接靶向元件的SPIO靶向探针通过特异性结合特定受体，避免了单核巨噬细胞的清除作用，延长了在肿瘤局部的停留时间，在一定程度上解决了上述问题。目前文献报道运用SPIO靶向显影恶性肿瘤的分子靶点，如Her2、MUC1等，并不在肿瘤间质内及肿瘤新生血管表达[23-24]。这些受体在肿瘤局部表达量有限，导致靶向探针不能大量转运到肿瘤实质内，未结合的SPIO又很快被清除。因此，为了优化靶向SPIO在特定肿瘤组织中的浓聚，增强其被网状内皮系统吞噬和清除的抗性，增加信噪比，我们选用了uPAR作为分子靶点。uPAR不仅表达于肿瘤细胞，而且肿瘤间质细胞中的表达也明显增高，并能够很好地显示肿瘤浸润的部分以及肿瘤边缘[14]。此外，uPAR的表达随周围环境的改变而不同。Krishnamachary等[25]以及Lester等[26]发现缺氧条件培养下结肠癌细胞系及乳腺癌细胞系uPAR表达会明显增高。因此对于一些很小的肿瘤或者肿瘤乏氧区域，即使肿瘤实质内缺少肿瘤新生血管，依赖uPAR的靶向探针也能很好地显示肿瘤[10]。
前期研究发现SPIO高浓度作用于细胞时，会被细胞溶酶体降解，释放出铁离子，铁离子与细胞内的过氧化氢作用产生活性氧物质(reactive oxide species,ROS)，后者破坏细胞膜完整性或者损伤DNA，从而使细胞生存率下降[27-28]。本研究细胞生存实验显示30 μg/mL及70 μg/mL hATF-SPIO探针与细胞共同孵育至72 h，细胞存活率均大于100 %，以此证实探针在使用浓度下对细胞生存几乎无影响。其可能原因为PEG包被的SPIO在溶酶体内降解时，PEG会阻止铁离子的释放，减少了细胞内铁离子浓度，从而减少了由于铁离子与过氧化氢作用产生的ROS[29]。当hATF-SPIO与细胞孵育后，普鲁士蓝染色显示相对于Lovo细胞，Hela细胞中可查见明显的铁染颗粒；MRI扫描显示Hela细胞较Lovo细胞信号值明显降低，由此证实探针不仅能够结合细胞膜上uPAR并由受体介导进入细胞质，而且能有效改变弛豫时间，引起T2WI上信号改变。探针的靶向性与探针在体内作用时鉴别诊断的能力关系密切，探针靶向性越好，体内在靶向部位结合和聚集的能力就越高。
我们通过流式细胞术检测证实HT29结肠癌细胞系是一种中度表达uPAR的腺癌细胞，与之前报道的文献结果相符[21-30]，前期文献利用MRI靶向uPAR显影均采用uPAR强阳性肿瘤[11-12]，对于uPAR表达量相对较低的肿瘤并未进行深入研究。中度表达uPAR的HT29移植瘤只在PET研究中成功显影[21, 30]。本研究显示，当hATF-SPIO作用于体内时，探针注入12 h及24 h后，HT29肿瘤信号值较Lovo移植瘤明显降低，差异具有统计学意义，T2WI相上也观察到HT29移植瘤从探针注入后12 h到48 h呈明显暗信号。与PERSSON等[21]采用64Cu-DOTA-AE105显影HT29肿瘤(靶向核素信号在1 h时明显增高，信号增强在4.5 h时达到平台期，且持续至22 h)相比较，hATF-SPIO探针靶向成像作用时间更长。利用核素成像系统对HT29移植瘤分子影像研究中，研究者利用了线性短肽AE105作为靶向元件，其优势在于线性短肽分子量小，易于大量合成[31]，但是AE105与uPAR结合的能力以及与uPA竞争结合uPAR的能力均不及hATF，hATF与uPAR的离解常数低于1 nmol/L[19]。因此hATF一方面能够与天然配体uPA竞争结合细胞表面的uPAR受体，避免了uPA的占位效应，增加探针结合uPAR的概率;另一方面，hATF与uPAR结合后稳定，不易从细胞膜上脱离，增加了探针与受体结合后的稳定性。hATF-SPIO还可以通过uPAR受体介导，进入到肿瘤细胞或间质细胞内，避免探针被巨噬细胞吞噬清除，以此保证了HT29肿瘤局部探针的聚集。病理学验证表明，hATF-SPIO能够顺利进入HT29肿瘤组织，并在组织内存留，与影像结果一致。因此，我们利用hATF-SPIO成功显影了uPAR中度表达的HT29结肠癌移植瘤，且观察到利用该探针的有效靶向成像时间为探针注入后12～24 h。
由于SPIO是T2对比剂，我们的研究采用了T2 RARE序列进行MRI扫描，采用该序列即使在局部SPIO较低浓度状态下，也能发生图像信号的变化，即具有成像检测的敏感性。但SPIO在T2加权像上呈负性对比，因此可能会造成信号的丢失或者不能有效区分靶向组织与背景区域；除此之外，T2加权像在不同组织的交界面上易产生“开花效应”(blooming effect)，即在不同组织交界面会产生磁敏感性伪影，使得肿瘤边界显示不清，导致定位及感兴趣区域勾画不准确[32]。Robson等[33]和Zhang等[34]利用超短回波时间(ultrashort echo time,UTE)序列，使得SPIO在UTE序列图像上呈现高信号表现，一方面维持了原有SPIO的检测灵敏性，另一方面解决了负性对比剂带来的诸多问题，我们也将类似序列纳入后期研究中。
综上所述，我们利用hATF-SPIO靶向显影uPAR中度表达的结肠癌模型，一方面进一步验证了探针的显影效能，同时为该探针用于不同uPAR表达情况的肿瘤显影提供了理论依据；一方面提供了探针细胞生物安全性的信息。但是探针体内安全信息仍缺乏，以及成像序列仍存在部分问题，我们将在后期实验中进一步改善。
引言
结直肠癌是消化道恶性肿瘤的一种，发病率及病死率在所有恶性肿瘤中排名第三。然而，研究表明非远端转移的结直肠癌患者5年生存率可达70%～90%[1]，因此有效的早期筛查能够使结直肠癌患者生存获益。众多成像系统中，核磁共振成像(magnetic resonance image，MRI)具有良好的组织分辨率及解析率，能够探测深部组织病变，同时没有潜在的放射性损伤，因此广泛用于肿瘤检测。近年来，随着纳米技术的发展，很多新型纳米材料已用于分子影像，使分子影像技术的特异性及灵敏度均得以提高[2-3]。以MRI作为成像系统，采用超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide particle，SPIO)的靶向探针已在多种肿瘤诊断和治疗中得到应用[4-6]。这些靶向肿瘤的SPIO作为MRI的T2造影剂不仅能够提高MRI检测微小病变及转移灶的灵敏度，而且还能作为载物平台，携带药物或者核酸进入目的组织，提高疗效[7]。然而，这些SPIO用于肿瘤靶向显影时也有诸多不足之处，主要问题在于：①肿瘤血管的无序性使得探针在肿瘤内分布不均匀；②由于肿瘤间质的阻碍，探针穿过肿瘤新生血管间隙后聚集在肿瘤新生血管周围，很难通过肿瘤间质直接作用于肿瘤实质细胞。这些留存于间质中却未能特异性结合在相应受体上的探针，将被单核巨噬系统吞噬并清除，导致检测效能降低。因此，若选取能特异表达在肿瘤细胞表面及间质细胞的生物学标记作为靶点，则能够增加靶向SPIO在肿瘤组织中的存留，从而在一定程度上解决这些问题。
尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogen activator receptor,uPAR)是一种与肿瘤增殖、转移及血管生成相关的膜蛋白。uPAR不仅表达于肿瘤细胞表面，还表达在肿瘤间质的成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞膜表面[8-10]。近年来，将uPAR作为靶点的正电子发射计算机断层显像/计算机断层成像(positron emission tomography/computed tomography,PET/CT)以及MRI造影剂已在胰腺癌、胶质瘤、乳腺癌和前列腺癌中显影成功[11-14]。病理研究显示，结直肠癌肿瘤组织uPAR表达阳性，且在肿瘤微浸润间质部分表达也明显增高[15]，并提示不良预后。因此，本研究利用uPAR靶向的MRI探针作为显影剂，通过建立肿瘤裸鼠模型，检测该靶向探针在uPAR中度表达的结肠癌模型中的显影特性。
1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌Hela细胞、人结肠癌HT29细胞和Lovo细胞均获赠于四川大学临床医学院信号传导实验室；实验用裸鼠购自四川达硕实验动物公司；胎牛血清购自Gibco公司；青霉素/链霉素双抗、DMEM培养基和胰蛋白酶购自Hyclone公司；Matrigel基质膜基质购自B&D公司；流式细胞术uPAR单克隆抗体和小鼠IgG1同型对照(isotype control，ISO)购自eBioscience公司；普鲁士蓝染色试剂盒购自Solarbio公司；2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐(WST/CCK-8)购自同仁公司；异氟烷购自瑞沃德公司。
1.2 细胞系以及动物模型
Hela宫颈癌细胞系、HT29人结肠癌细胞系和Lovo人结肠癌细胞系均采用含100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青霉素/链霉素双抗的DMEM高糖培养基，放置于37 ℃、50 mL/L浓度CO2孵箱中培养。在体外试验、探针靶向特异性实验中，由于HT29抱团生长，不利于实验的观察，因此将Hela细胞作为阳性对照。所有动物实验均为4~6周龄雌性裸鼠。取对数生长期的肿瘤细胞，2.5 g/L胰酶消化离心收集细胞，PBS配制细胞悬液且调整活细胞浓度2×107个/mL，并加入等体积的高浓度Matrigel，HT29细胞以及Lovo细胞均按照1×106个/只分别接种于裸鼠右下肢及左下肢皮下，肿瘤最大直径达到8 mm时，进行MRI扫描。肿瘤直径通过游标卡尺测量。
1.3 hATF-SPIO探针合成
人类氨基末端片段(human amino-terminal fragment，hATF)包含135 个氨基酸是uPAR天然受体尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator,uPA)的氨基酸末端片段，hATF包含的7个氨基酸构成的Ω环，是与uPAR高度亲和的二级结构[16-18]，其解离常数值(Kd)低于1 nmol/L，并且能与uPA竞争结合肿瘤及内皮细胞上的uPAR，同时抑制肿瘤生长及血管的生成[19]。hATF-SPIO探针获赠于Emory大学Lily Y教授实验室，合成方法参照文献[11]。10 nm铁磁性核心包裹分子量为2 000的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，再与重组蛋白hATF连接，形成水合粒径约30 nm的靶向探针hATF-SPIO。
1.4 流式细胞术检测uPAR的表达
20 g/L EDTA溶液消化贴壁肿瘤细胞，计数并收集1×106个活细胞，PBS溶液清洗3次，弃上清，加入300 μL PBS重悬细胞。将细胞悬液均分为3组，分别加入5 μL APC标记小鼠抗人uPAR抗体(eBioscience)、5 μL APC标记小鼠IgG1κ ISO或等量的PBS溶液，4 ℃避光孵育30 min。每组细胞加入适量PBS清洗1次并弃上清，300 μL PBS溶液重悬细胞，上机检测(NAVIOS,BECKMAN COULTER)，并根据ISO荧光强度设置检测阈值，每种细胞系至少重复检测3次。
1.5 CCK-8 实验检测细胞存活率
取对数生长期肿瘤细胞接种于96孔培养板，2 000个/孔，轻摇混匀，置于37 ℃、50 mL/L浓度CO2孵箱中培养24 h。将35 μg/mL和70 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO探针加入到对应试验孔中，与细胞共同孵育，于不同时间点(4、24、48 h)，进行CCK-8试验。CCK-8原液与培养液按1∶10比例配制预混液，每孔加100 μL混液，避光继续孵育2～4 h。Micro-ELISA仪读取吸光度，490 nm波长下测定各孔光吸收值A，计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(A加药－A空白)/(A对照－A空白)×100%。
1.6 MRI扫描
1.6.1 细胞实验
计数接种1×106个Lovo细胞和Hela细胞培养贴壁，分别与30 μg/mL和15 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO探针共同孵育24 h，收集细胞，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗1次，弃上清，重悬于10 mg/mL琼脂糖凝胶中，待凝胶固定后行MRI扫描。
1.6.2 动物实验
荷瘤裸鼠固定后，采用异氟烷/氧气(V/V，1∶1)气体麻醉，待呼吸频率稳定于20~30次/min时，鼠尾静脉以400 pmol/只(即每只给予0.4 mg含Fe量的hATF-SPIO探针)浓度注入hATF-SPIO探针。每只实验裸鼠于注入探针前及注入探针后12、24和48 h，7T MRI(Bruker Biospec)扫描。扫描采用T2 RARE序列：TR=3 000 ms;TE=45 ms;Matrix=256×256;FOV=30 mm;层厚=1 mm。SPIO探针为MRI的T2对比剂，因此选用T2WI观测探针在体内的分析信号强度(signal intensity，SI)随时间的变化。感兴趣区(region of interest,ROI)选择：ROI选择在肿瘤最大层面，沿肿瘤边界包绕整个肿瘤切面，且排除坏死区域，每层至少包含50 个像素[20]。
1.7 病理学检测
1.7.1 细胞实验
Hela和Lovo细胞以5 000个/孔接种于24孔板，以30 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO探针共同孵育24 h后行普鲁士蓝染色。
1.7.2 动物实验
所有荷瘤裸鼠MRI扫描后，颈椎脱臼法处死，分离肿瘤组织，以40 g/L多聚甲醛固定和石蜡包埋切片。HE染色观察肿瘤情况以及普鲁士蓝染色检测肿瘤组织中SPIO的分布。
1.8 统计学方法
本实验数据均为重复3次以上的结果，计量结果采用均数±标准差表示，用SPSS 13.0软件处理；两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 荷瘤裸鼠模型的建立
荷瘤裸鼠寄养于四川大学华西临床医学院科技园动物实验中心SPF级裸鼠饲养间。5只裸鼠接种肿瘤后均存活，2种肿瘤细胞系成瘤率为100%。
2.2 流式细胞术检测
我们总共筛查了3种结肠癌细胞系，如图 1所示，检测了在不同细胞系中uPAR表达阳性的细胞占细胞总量的百分比，HT29细胞uPAR表达阳性率为21.89％±4.96%，与Lovo细胞表达率(0.055%±0.055%)比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。作为体外实验的阳性对照细胞Hela，其uPAR表达阳性率为95.43％±0.726%，与Lovo细胞比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。因此，流式细胞术检测显示，Hela为uPAR强阳性表达细胞，Lovo为uPAR表达阴性细胞，而HT29为uPAR中度表达的细胞系，与之前文献相符[21]。
图1
流式细胞术检测不同结肠癌细胞uPAR表达量
Figure1.
uPAR expression of different colon cancer cells measured with Flow cytometry
2.3 探针靶向性分析
35 μg/mL以及70 μg/mL含Fe浓度的hATF-SPIO分别与不同肿瘤细胞共同孵育4、24及48 h，细胞存活率均高于100%，如图 2所示，且各组间差异不具有统计学意义(P＞0.05)。为了排除血清对探针结合受体的干扰，我们采用无血清培养基稀释探针并与细胞孵育24 h。MRI显示Lovo细胞在不同浓度都可查见信号值略低于空白对照组，但不同浓度之间并无明显差异，Hela细胞在含Fe浓度为15 μg/mL的探针作用下时查见其MRI信号减低，随着探针浓度的增加，信号降低更明显，如图 3所示。为了验证hATF-SPIO在细胞内的分布，通过普鲁士蓝染色显示30 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO能靶向结合uPAR表达强阳性的Hela细胞，并且进入到Hela细胞胞质中，而uPAR表达阴性的Lovo细胞内并未查见铁染颗粒，如图 4所示。
图2
CCK-8检测不同浓度探针作用下肿瘤细胞存活率
Figure2.
Survival rate tests of tumor cells measured with CCK-8 incubated with different hATF-SPIO
图3
不同肿瘤细胞hATF-SPIO孵育后的MRI检测
Figure3.
MRI for different tumor cells incubated with hATF-SPIO
图4
不同肿瘤细胞与30 μg/mL含Fe量hATF-SPIO孵育后普鲁士蓝检测
Figure4.
Prussian blue staining for different tumor cells incubated with hATF-SPIO
2.4 MRI动物扫描
在注射探针之前，HT29肿瘤与Lovo肿瘤的SI值没有明显差异(P＞0.05)。探针注入后，两种肿瘤SI值均有下降；在12 h与24 h时，HT29肿瘤的SI值较Lovo肿瘤的SI值更低，且差异均有统计学意义(P＜0.05)。在48 h时，两种肿瘤SI值没有明显差异(P＞0.05，如表 1所示)。在T2WI图像上，HT29移植瘤在12 h时出现局部低信号影，且一直持续到48 h，而Lovo移植瘤则没有变化，如图 5所示。hATF-SPIO注入裸鼠体内后，由于网状内皮细胞的摄取，使得肝脏和脾脏在T2WI上的信号在30 min内出现明显减低，持续至48 h，如图 6所示。
图5
hATF-SPIO注射后T2 RARE序列不同结肠癌组织MR图像
红色虚线：HT29肿瘤；绿色虚线：Lovo肿瘤
Figure5. T2 RARE weighted image of colon xenografts after injection of hATF-SPIOred dotted line: HT29 xenograft; green dotted line: Lovo xenograft
图6
hATF-SPIO注射后T2 RARE序列脾脏MR图像
黄色虚线：脾脏；蓝色虚线：肝脏
Figure6. T2 RARE weighted image of spleen after injection of hATF-SPIOyellow dotted line: spleen; blue dotted line: liver
表1
T2WI序列不同肿瘤各时间点信号强度变化
Table1.
Changes in tumor signal intensity after probe injections in T2WI sequence
2.5 病理学分析
HE染色可见HT29皮下移植瘤呈巢团样，且瘤体组织周围被肿瘤间质包裹，以成纤维细胞为主，整个肿瘤组织内未见坏死区域；Lovo皮下移植瘤查见大量肿瘤实质细胞，瘤体内间质较HT29移植瘤更少，整个瘤体也未见坏死区域，但局部可见少量充血。通过普鲁士蓝染色，可以明确SPIO在肿瘤的分布情况。在uPAR表达阴性的Lovo皮下移植瘤内未查见SPIO的分布，HT29皮下移植瘤内可见铁染色阳性，如图 7所示。
图7
不同肿瘤组织的普鲁士蓝及HE染色(200×)
Figure7.
HE stain and Prussian blue stain for tumor sections(200×)
3 讨论
非靶向的SPIO作为血池造影剂显影肿瘤组织时，由于肿瘤新生血管内皮的不连续性，使得血池中的SPIO能够通过血管内皮间隙进入到肿瘤组织中，肿瘤组织缺乏淋巴回流系统，因此SPIO能够在肿瘤中停留，此被动靶向的过程称为高通透性和滞留效应(enhance permeability and retention effect,EPR)[22]。EPR效应是探针到达肿瘤局部的必要条件，然而肿瘤新生血管的无序性以及肿瘤间质的阻碍，不仅会影响SPIO的滲入，同时干扰了靶向SPIO与受体的结合，导致未能结合SPIO，很快被巨噬细胞吞噬清除，从而降低了显影效能。连接靶向元件的SPIO靶向探针通过特异性结合特定受体，避免了单核巨噬细胞的清除作用，延长了在肿瘤局部的停留时间，在一定程度上解决了上述问题。目前文献报道运用SPIO靶向显影恶性肿瘤的分子靶点，如Her2、MUC1等，并不在肿瘤间质内及肿瘤新生血管表达[23-24]。这些受体在肿瘤局部表达量有限，导致靶向探针不能大量转运到肿瘤实质内，未结合的SPIO又很快被清除。因此，为了优化靶向SPIO在特定肿瘤组织中的浓聚，增强其被网状内皮系统吞噬和清除的抗性，增加信噪比，我们选用了uPAR作为分子靶点。uPAR不仅表达于肿瘤细胞，而且肿瘤间质细胞中的表达也明显增高，并能够很好地显示肿瘤浸润的部分以及肿瘤边缘[14]。此外，uPAR的表达随周围环境的改变而不同。Krishnamachary等[25]以及Lester等[26]发现缺氧条件培养下结肠癌细胞系及乳腺癌细胞系uPAR表达会明显增高。因此对于一些很小的肿瘤或者肿瘤乏氧区域，即使肿瘤实质内缺少肿瘤新生血管，依赖uPAR的靶向探针也能很好地显示肿瘤[10]。
前期研究发现SPIO高浓度作用于细胞时，会被细胞溶酶体降解，释放出铁离子，铁离子与细胞内的过氧化氢作用产生活性氧物质(reactive oxide species,ROS)，后者破坏细胞膜完整性或者损伤DNA，从而使细胞生存率下降[27-28]。本研究细胞生存实验显示30 μg/mL及70 μg/mL hATF-SPIO探针与细胞共同孵育至72 h，细胞存活率均大于100 %，以此证实探针在使用浓度下对细胞生存几乎无影响。其可能原因为PEG包被的SPIO在溶酶体内降解时，PEG会阻止铁离子的释放，减少了细胞内铁离子浓度，从而减少了由于铁离子与过氧化氢作用产生的ROS[29]。当hATF-SPIO与细胞孵育后，普鲁士蓝染色显示相对于Lovo细胞，Hela细胞中可查见明显的铁染颗粒；MRI扫描显示Hela细胞较Lovo细胞信号值明显降低，由此证实探针不仅能够结合细胞膜上uPAR并由受体介导进入细胞质，而且能有效改变弛豫时间，引起T2WI上信号改变。探针的靶向性与探针在体内作用时鉴别诊断的能力关系密切，探针靶向性越好，体内在靶向部位结合和聚集的能力就越高。
我们通过流式细胞术检测证实HT29结肠癌细胞系是一种中度表达uPAR的腺癌细胞，与之前报道的文献结果相符[21-30]，前期文献利用MRI靶向uPAR显影均采用uPAR强阳性肿瘤[11-12]，对于uPAR表达量相对较低的肿瘤并未进行深入研究。中度表达uPAR的HT29移植瘤只在PET研究中成功显影[21, 30]。本研究显示，当hATF-SPIO作用于体内时，探针注入12 h及24 h后，HT29肿瘤信号值较Lovo移植瘤明显降低，差异具有统计学意义，T2WI相上也观察到HT29移植瘤从探针注入后12 h到48 h呈明显暗信号。与PERSSON等[21]采用64Cu-DOTA-AE105显影HT29肿瘤(靶向核素信号在1 h时明显增高，信号增强在4.5 h时达到平台期，且持续至22 h)相比较，hATF-SPIO探针靶向成像作用时间更长。利用核素成像系统对HT29移植瘤分子影像研究中，研究者利用了线性短肽AE105作为靶向元件，其优势在于线性短肽分子量小，易于大量合成[31]，但是AE105与uPAR结合的能力以及与uPA竞争结合uPAR的能力均不及hATF，hATF与uPAR的离解常数低于1 nmol/L[19]。因此hATF一方面能够与天然配体uPA竞争结合细胞表面的uPAR受体，避免了uPA的占位效应，增加探针结合uPAR的概率;另一方面，hATF与uPAR结合后稳定，不易从细胞膜上脱离，增加了探针与受体结合后的稳定性。hATF-SPIO还可以通过uPAR受体介导，进入到肿瘤细胞或间质细胞内，避免探针被巨噬细胞吞噬清除，以此保证了HT29肿瘤局部探针的聚集。病理学验证表明，hATF-SPIO能够顺利进入HT29肿瘤组织，并在组织内存留，与影像结果一致。因此，我们利用hATF-SPIO成功显影了uPAR中度表达的HT29结肠癌移植瘤，且观察到利用该探针的有效靶向成像时间为探针注入后12～24 h。
由于SPIO是T2对比剂，我们的研究采用了T2 RARE序列进行MRI扫描，采用该序列即使在局部SPIO较低浓度状态下，也能发生图像信号的变化，即具有成像检测的敏感性。但SPIO在T2加权像上呈负性对比，因此可能会造成信号的丢失或者不能有效区分靶向组织与背景区域；除此之外，T2加权像在不同组织的交界面上易产生“开花效应”(blooming effect)，即在不同组织交界面会产生磁敏感性伪影，使得肿瘤边界显示不清，导致定位及感兴趣区域勾画不准确[32]。Robson等[33]和Zhang等[34]利用超短回波时间(ultrashort echo time,UTE)序列，使得SPIO在UTE序列图像上呈现高信号表现，一方面维持了原有SPIO的检测灵敏性，另一方面解决了负性对比剂带来的诸多问题，我们也将类似序列纳入后期研究中。
综上所述，我们利用hATF-SPIO靶向显影uPAR中度表达的结肠癌模型，一方面进一步验证了探针的显影效能，同时为该探针用于不同uPAR表达情况的肿瘤显影提供了理论依据；一方面提供了探针细胞生物安全性的信息。但是探针体内安全信息仍缺乏，以及成像序列仍存在部分问题，我们将在后期实验中进一步改善。
