本研究目的是探讨超顺磁性壳聚糖FGF-2明胶微球(SPCFGM)对小鼠间充质干细胞增殖分化作用的影响。采用化学共沉淀法制备超顺磁性氧化铁壳聚糖纳米粒子(SPIOCNs),与质粒FGF-2结合后,用乳化交联法制备SPCFGM和不含质粒FGF-2的超顺磁性壳聚糖明胶微球(SPCGM),激光粒度分析仪和透射电镜检测SPCFGM、SPIOCNs表征,测定SPCFGM的载药量、包封率及体外释放活性,分别用等量SPCFGM、SPCGM、加入C3H10细胞培养基中,设SPCFGM组、SPCGM组、空白对照组3组细胞。DAPI染色观察细胞凋亡,Western blot法验证各组FGF-2的表达水平,CCK8法和流式细胞术检测细胞的增殖活力及细胞周期分布。结果显示:SPIOCNs微粒和SPCFGM微球都呈球形,粒径分别为(25±9) nm和(140±12) μm。SPCFGM的载药量为57.13%±5.41%,包封率为69.97%±0.04%。3组细胞无凋亡形态,SPCFGM组FGF-2蛋白水平表达较其它两组明显增高,细胞增殖活力明显增高(P＜0.05)。SPCFGM可释放FGF-2,并保持FGF-2的生物活性,促进C3H10细胞增殖分化,对细胞无毒副作用。
引用本文： 丁幸坡, 李明, 曹豫江, 杨琼, 何通川, 罗聪, 李海冰, 毕杨. 质粒FGF-2磁性壳聚糖明胶微球对间充质干细胞增殖分化的影响. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(5): 1083-1089. doi: 10.7507/1001-5515.20150192 复制
引言
目前，如何促进关节软骨损伤修复与再生是生物学家及生物工程师面临的严峻挑战[1]。从生物学角度来看，关节软骨损伤后易引起关节疼痛、畸形及功能丧失，其修复是一个复杂的过程，因其无神经及血管支配，细胞体积比较低并且富含粘多糖的特性就限制了新生细胞主动或被动的向病变部位迁移,导致修复困难[2-3]。
软骨组织工程用于关节软骨损伤修复是近年来研究的热点。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有向软骨细胞分化的潜能，是软骨组织工程理想的种子细胞。但是MSCs的分化潜能随年龄的增长而明显下降，诱导分化机制尚不明确，其遗传及体内增殖的安全性有待确定[4]。成纤维细胞生长因子2 (fibroblast growth factor2,FGF-2)是成纤维细胞因子家族一员，是参与软骨损伤早期修复的关键因子，促进软骨下间充质细胞的聚集和向软骨细胞分化，在软骨再生过程中起重要作用[5]。利用FGF-2对 MSCs的干预作用，即可以促进MSCs增殖，又可以定向诱导MSCs向软骨细胞分化，但是外源性FGF-2性质不稳定，半衰期短，进入体内后易被蛋白酶降解[6]。因此，为了使FGF-2能在体内充分发挥其生物学效应，本研究拟通过制备超顺磁性壳聚糖FGF-2明胶微球(superparamagnetic chitosan FGF-2 gelatin microspheres,SPCFGM)，实现FGF-2明胶微球既作为一种基因载体又作为释放系统的可能性，调节FGF-2体内释放的量效关系，为软骨组织工程技术探索一条新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒pIRES2-EGFP-FGF-2由本课题组前期完成，胎牛血清和培养基DMEM购自美国Hyclone公司，质粒提取试剂盒购自美国Omega公司，FGF2一抗及羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物有限公司，CCK-8试剂购自南京凯基生物科技发展有限公司，硫酸亚铁铵、硫酸铁铵购自重庆北碚化学试剂厂，明胶，壳聚糖，4′,6-二脒基-2-苯基吲(4′，6-diamidino-2-pheny lindole，DAPI)购自Sigma公司，盐酸及亚铁氰化钾购自成都市科龙化工试剂厂，所用化学试剂均为分析纯。
1.2 超顺磁性氧化铁壳聚糖纳米粒子的制备及检测
化学共沉淀法[7]制备超顺磁性氧化铁壳聚糖纳米粒子(superparamagnetic iron oxide chitosan nanoparticles,SPIOCNs)，将得到的黑色沉淀用蒸馏水反复洗涤，直至中性，室温保存。取适量样本在透射电镜下观察形态，并用激光衍射粒度分析仪测定粒径及分布。用凯氏定氮法测定SPIOCNs氮含量[8]。
1.3 质粒pIRES2-EGFP-FGF-2与SPIOCNs的结合实验
取1 μL质粒pIRES2-EGFP-FGF-2在1.8 V条件下利用电转法转染入E.coli DH5α感受态细菌中，37 ℃孵育30 min，加入含有卡那霉素(1∶1 000)的LB培养基中，培养过夜，按照质粒提取试剂盒的说明书提取质粒，经BglⅡ、Sal I 双酶切鉴定，并检测浓度。将SPIOCNs溶入醋酸钠缓冲液中(pH=5.5),按不同氮/磷比例(0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1)与质粒混合，旋涡搅拌20 s,55 ℃下复合1 h。用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察质粒与SPIOCNs结合情况。
1.4 SPCFGM的制备
乳化交联法制备SPCFGM。取醋酸缓冲液(pH=5.5)配置的SPIOCNs 5 mL和FGF-2质粒5 mL混合，55 ℃孵育1 h，向混合液中加入10 mL 25%明胶，800 r/min搅拌溶解20 min制成明胶磁流体。另在三口烧瓶中加入100 mL液体石蜡和1 mL司班80，于65 ℃、800 r/min充分搅拌。将明胶磁流体缓慢滴入三口烧瓶中，300 r/min搅拌10 min，待出现乳状液后迅速改为冰浴，降温至4 ℃，缓慢滴加25％的戊二醛0.1 mL，继续搅拌2 h，加入40 mL丙酮，搅拌3 min后静置，待溶液分层后，可以看到制备出的淡黄色微球沉淀在最下层，过滤后将微球泡在10 mL丙酮溶液中，予4 ℃固化24 h。蒸馏水洗涤3次后将微球冻干，－20 ℃保存。取适量样本用蒸馏水溶解，使微球均匀分散，取微球混液滴于载玻片上，在光学显微镜下观察形态，并用激光衍射粒度分析仪测定其粒径及分布。
1.5 SPCFGM的载药量及包封率的测定
制备3批SPCFGM，收集最后的洗涤液，8 000 r/min离心5 min，取上清，用紫外分光光度仪在波长260 mm下检测质粒浓度，并称量微球重量。用上述方法制备不含质粒FGF-2的SPCGM，取制备过程中最后的洗涤液，用于检测质粒浓度时调零，按下列公式计算微球的载药量和包封率[9]:载药量＝(投入FGF-2的量－上清液中FGF-2的量)／微球重量×100％、包封率＝(投入FGF-2的量－上清液中FGF-2的量)／投入FGF-2的量×100％。
1.6 磁力天平测定SPCFGM、SPCGM的磁感应性
分别取5 mL SPCFGM及SPCGM于EP管中，置于磁天平中间称取重量，将磁场强度从0 mT(毫特斯拉,milli-tesla)逐级调到600 mT，以50 mT为间隔，分别记录磁力天平显示的重量，再将磁场强度从600 mT逐次下调至0 mT，再次记录其重量变化，实验重复三次，用0~50 mT间所测得的试管重量平均差值反映SPCFGM、SPCGM的磁感应性。
1.7 SPCFGM中质粒FGF-2的体外释放实验
称取SPCFGM 5.00 mg，置于 25 mL三角烧瓶中，加10 mL 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)，于37 ℃衡温水浴，每次采样0.5 mL上清液，同时补充PBS以维持释放介质体积不变，用核酸蛋白测定仪(260 nm)测定释放液中质粒FGF-2的含量，实验重复3次，取其均值，连续测量7 d，计算每日及累计质粒释放量，绘制体外释放曲线[10]。
1.8 细胞培养及分组
小鼠胚胎期多潜能间充质干细胞C3H10细胞为重庆医科大学附属儿童医院干细胞实验室保存，置于含10%胎牛血清DMED培养基，5% CO2、37 ℃培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。称取一定质量的SPCGM和SPCFGM两种微球，用含10%血清的DMEM培养基配制成终浓度100 μg/mL的混悬液。实验分为3组：空白对照组(Control组)，采用10%血清的DMEM培养基配；SPCGM组，采用100 μg/mL的SPCGM混悬液培养；SPCFGM组，采用100 μg/mL的SPCFGM混悬液培养。
1.9 DAPI染色检测细胞凋亡
按上述方法处理3组C3H10细胞3 d后，吸弃培养基，用PBS将微球洗去，4%多聚甲醛固定1 h，吸弃多聚甲醛，PBS洗3遍，每孔加入2 μg/mL DAPI 0.5 mL，37 ℃避光孵育10 min，PBS洗三遍，倒置荧光显微镜观察各组细胞细胞核形态，是否有核浓缩、核碎裂、染色质聚集等现象。
1.10 Western blot法检测FGF-2在C3H10细胞中的表达
按上述方法处理3组C3H10细胞7 d后，提取各组细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，取50 μg经10％SDS-PAGE分离，条件：先80 V、30 min，后100V、100 min，然后100 V、60 min电转移至PVDF膜上，用5％脱脂奶粉室温封闭1 h；TBST洗膜3次，加入兔抗小鼠FGF-2一抗(1∶200稀释)和小鼠抗小鼠β-actin 单抗(1∶200稀释)，4 ℃过夜；TBST洗膜后，分别加入HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG(1∶1 000稀释)，室温孵育1 h；TBST洗膜3次后ECL发光成像。
1.11 CCK-8法检测SPCFGM对C3H10细胞的增殖影响
以1×105个/mL密度接种于96孔培养板中，按上述方法处理3组C3H10细胞，，每孔100 uL培养体系，每组设3个复孔。置37℃ 、5%CO2的培养箱分别培养1、3、5和7 d后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，于培养箱中继续孵育2 h，酶标仪上测定450 nm波长处每孔细胞的吸光度值(A450)，实验重复3次。
1.12 流式细胞术检测细胞增殖周期
按上述方法处理3组C3H10细胞3 d后，用PBS将微球洗去，用胰酶消化细胞，收集于EP管内，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗两次后用预冷的70%(体积比)乙醇固定，流式细胞术分析细胞增殖周期。
1.13 统计学方法
采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计学处理，结果以
2 结果
2.1 SPIOCNs、SPCFGM的形态及粒径
经透射电子显微镜观察SPIOCNs，如图 1(a)所示，可见SPIOCNs微粒呈球形，分布均匀，呈聚集现象，激光衍射粒度分析仪测定其粒径为(25±9) nm，符合超顺磁性的条件。在光学显微镜下观察SPCFGM，如图 1(c)所示,可见SPCFGM微球呈规则球形，表面光滑，分散性好，粒径(140±12) μm。
图1
SPIOCNs、SPCFGM的形态及粒径
(a) SPIOCNs透射电镜照片(80 000×)； (b)SPIOCNs粒径分布；(c)SPCFGM光学显微镜照片(100×)；(d)SPCFGM粒径分布
Figure1. Morphologicy and grain size of SPIOCNs and SPCFGM(a) transmission electron micrograph of SPIOCNs (80 000×); (b) size distribution of SPIOCNs; (c) optical microscope images of SPCFGM (100×); (d) size distribution of SPCFGM
2.2 质粒pIRES2-EGFP-FGF-2与SPIOCNs的结合实验
凯氏定氮法测定SPIOCNs氮含量为(18.45±2.07) mg/mL，质粒浓度为(308.64±24.67) ng/μL。琼脂糖凝胶电泳图显示在不同氮/磷比条件下质粒与SPIOCNs的结合情况，如图 2所示，在第6泳道(氮/磷比为2.5∶1)时无条带跑出，说明此时SPIOCNs与质粒FGF-2已完全结合。
图2
不同氮/磷比条件下质粒与SPIOCNs的结合的电泳图
1：FGF-2质粒；2-6：质粒与SPIOCNs的氮/磷比分别为1∶2、1∶1、1.5∶1、 2∶1、2.5∶1；7：DNA MarkerⅡ
Figure2. Agarose gel electrophoretic profile of plasmid combined SPIOCNs with different N/P ratios1: FGF-2; 2-6: the N/P ration of plasmid/SPIOCNs is 1∶2, 1∶1, 1.5∶1, 2∶1, and 2.5∶1, respectively; 7: DNA MarkerⅡ
2.3 SPCFGM的磁感应性、载药量、包封率及体外释放活性
磁力天平测定结果显示，当磁场强度由0 mT增加到50 mT时，SPCFGM增重(18.23±0.24) mg；SPCGMM增重(17.52±0.16) mg，当磁场强度从600 mT逐渐下降至0 mT时，二者的重量变化均为0 mg，提示SPCFGM和SPCGM有较强的磁感应性。载药量和包封率是评价微球包裹药物能力的两个重要指标，在本实验中，SPCFGM的载药量为57.13%±5.41%，包封率为69.97%±0.04%。SPCFGM释放曲线如图 3所示，前4 d微球释放FGF-2速度较快，5 d后释放趋于平稳。
图3
SPCFGM释放FGF-2累积浓度的效果
Figure3.
Effect of accumulative concentrations of FGF-2 released from SPCFGM
2.4 DAPI染色检测细胞凋亡形态
荧光显微镜下可见，微球处理细胞3 d后，SPCGM组和SPCFGM组细胞的细胞核呈强荧光，核形完整，染色质均匀，无核皱缩、核碎裂等凋亡细胞现象，与Control组的细胞形态无明显差异，如图 4所示。提示终浓度100 μg/mL明胶微球不会导致C3H10细胞凋亡，对其无细胞毒作用。
图4
DAPI染色检测细胞凋亡形态(400×)
Figure4.
Apoptosis morphology of cells detected by DAPI dye (400×)
2.5 Western blot法检测FGF-2在C3H10细胞中的表达
Western blot分析显示，微球处理7 d后，SPCFGM组FGF-2蛋白相对表达量(3.04±0.74)明显高于Control组(0.81±0.16)及SPCGM组(0.63±0.15)(P＜0.05)，而Control组与SPCGM组FGF-2蛋白的表达量无统计学意义，如图 5所示。提示SPCFGM在7 d内可以释放FGF-2，并能高效表达FGF-2蛋白。
图5
Western blot检测各组细胞FGF-2蛋白的水平
Figure5.
Level of protein FGF-2 determined by Western blot in each group
2.6 CCK-8法检测SPCFGM对C3H10细胞增殖的影响
各组细胞增殖情况如表 1所示，微球处理第1 d，3组细胞都增殖缓慢，SPCFGM组与SPCGM组对C3H10细胞增殖无明显差异(P＞0.05)，从第3 d起，SPCFGM组细胞增殖加快，且明显高于Control组及SPCGM组(P＜0.05)，而Control组与SPCGM组细胞增殖情况无明显差异(P＞0.05)。提示SPCFGM在7 d内释放FGF-2，FGF-2促进C3H10细胞增殖。
表1
各组细胞不同时间点的A450值(2.7 流式细胞术检测细胞增殖周期
在细胞有丝分裂的各个时期中，能反映细胞增殖活性的时期是G2期和S期，细胞增殖指数PI=(G2+S)%。各组细胞增殖周期结果如图 6所示，微球处理细胞3 d后，SPCFGM组细胞增殖指数最高(56.10±3.01)，增殖能力最强，明显高于Control组(15.70±5.81)及SPCGM组(17.83±10.09)(P＜0.05)，提示SPCFGM在3 d内释放FGF-2，FGF-2促进C3H10细胞的有丝分裂。
图6
流式细胞仪检侧各组细胞增殖周期结果
Figure6.
Proliferation cycle results of various cells measured by flow cytometry
3 讨论与结论
超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)具有超顺磁性和良好的生物相容性，因而引起人们的广泛关注。所谓超顺磁性，是指当氧化铁纳米颗粒粒径＜30 nm时，给予外加磁场就产生磁性，无磁场时，其磁性消失[11]。此特性还使得SPIONs具有磁靶向作用，已被用于肿瘤靶向治疗[12]、磁共振成像[13]等研究。另有研究表明，适宜浓度SPIONs标记MSCs并不影响干细胞多向诱导分化能力[14]。并且SPIONs进入机体后，一部分可被机体吸收利用，其余部分通过肾脏、胆汁、皮肤等安全排除体外，对机体无损害[15]。然而，SPIONs在液态环境中易出现团聚现象，且易被氧化失去超顺磁性，因此，SPIONs应用于生物医学领域时，有必要对其进行表面修饰，不仅能增强稳定性，还能提高其在水溶液中的分散性和生物相容性，降低细胞毒性[16-17]。常用的表面修饰物有高分子聚合物、有机小分子、多糖、多肽等，本研究选用壳聚糖(chitosan,CS)修饰SPIONs。CS具有成本低、可生物降解性、生物相容性好、无毒性等优点，是常用的天然高分子载体材料[18]。同时，CS在酸性条件下为带有阳离子的高分子聚合物，通过静电吸附作用与DNA结合，使DNA不易被降解，并能够完全进入细胞，可作为基因治疗中的非病毒性载体[19]。
基因载体可以把目的基因送入靶细胞，然后将目的基因释放出来，从而发挥目的基因的特点功能。因此，作为基因载体材料的重要判断标准就是要能与DNA结合，并能在一定程度上保护DNA[20]。SPIOCNs的含氮量代表了复合微粒中壳聚糖的含量，间接反映了微粒结合DNA的能力。本实验利用凯氏定氮法测定SPIOCNs的含氮量，并通过琼脂糖凝胶电泳发现氮/磷比为2.5∶1时SPIOCNs与质粒FGF-2可以完全结合，Western blot证实SPCFGM作用于MSCs后，FGF-2蛋白高表达，说明与SPIOCNs结合的FGF-2可以释放进入细胞，并得到高效表达，证明本实验所制作的SPIOCNs可作为基因载体。
明胶是一种天然的动物胶原提取物，具有良好的生物相容性，明胶作为缓释材料主要应用在药物载体、赋型剂或缓释壳层等方面。这些材料的形成主要是利用了明胶独特的理化性能：能形成凝胶,易于成型；能与别的物质(如戊二醛)发生交联反应，形成缓释层；能被酶降解，易于被人体吸收等[21]。明胶与一些生长因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、FGF-2具有相反的电性，不仅能够通过电荷吸引吸附细胞因子，而且可通过渗透、扩散和基质本身的溶蚀调控细胞因子释放速率，起到缓释的作用[22]。故本研究选用明胶作为FGF-2的包封材料。
载药量和包封率是评价微球载药能力的重要指标，受制备材料、制备工艺等因素影响。本实验通过乳化交联法制备的SPCFGM表面光滑，分布均匀，载药量为57.13%±5.41%，包封率为69.97%±0.04%，达到FGF-2维持其活性的释放量。本实验制备的微球中由于加入了纳米氧化铁，使微球的重量增加，导致FGF-2在微球中的百分比下降，包封率有所降低。因此，提高微球载药量和包封率是本实验下一步研究的重点。
本研究还通过体外试验证实，SPCFGM作用于MSCs后，缓慢释放FGF-2，使FGF-2蛋白在MSCs中高表达，MSCs细胞增殖指数明显增高，能促进MSCs增殖分化，且SPCFGM对MSCs的增值分化具有持续性作用，证明SPCFGM可以持续缓慢释放FGF-2，并保持FGF-2的生物活性，与Mastrogiacomo等对FGF-2的研究一致[23]。
DAPI是一种荧光染料，可与双链DNA结合发挥标记作用，常用于细胞凋亡检测。凋亡细胞的细胞核破裂形成碎片，核解体，染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。本实验结果显示，SPCFGM作用于MSCs，细胞核完整，染色质均匀，无细胞凋亡形态。进一步证实SPCFGM无细胞毒性。综上所述，本实验成功制备了可释放FGF-2的SPCFGM，并保持FGF-2的活性，能促进MSCs增殖，并对MSCs细胞无毒副作用，是理想的基因载体和包封材料。下一步，我们拟将其用于体内试验，探索利用SPCFGM修复关节软骨缺损的新方法。
引言
目前，如何促进关节软骨损伤修复与再生是生物学家及生物工程师面临的严峻挑战[1]。从生物学角度来看，关节软骨损伤后易引起关节疼痛、畸形及功能丧失，其修复是一个复杂的过程，因其无神经及血管支配，细胞体积比较低并且富含粘多糖的特性就限制了新生细胞主动或被动的向病变部位迁移,导致修复困难[2-3]。
软骨组织工程用于关节软骨损伤修复是近年来研究的热点。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有向软骨细胞分化的潜能，是软骨组织工程理想的种子细胞。但是MSCs的分化潜能随年龄的增长而明显下降，诱导分化机制尚不明确，其遗传及体内增殖的安全性有待确定[4]。成纤维细胞生长因子2 (fibroblast growth factor2,FGF-2)是成纤维细胞因子家族一员，是参与软骨损伤早期修复的关键因子，促进软骨下间充质细胞的聚集和向软骨细胞分化，在软骨再生过程中起重要作用[5]。利用FGF-2对 MSCs的干预作用，即可以促进MSCs增殖，又可以定向诱导MSCs向软骨细胞分化，但是外源性FGF-2性质不稳定，半衰期短，进入体内后易被蛋白酶降解[6]。因此，为了使FGF-2能在体内充分发挥其生物学效应，本研究拟通过制备超顺磁性壳聚糖FGF-2明胶微球(superparamagnetic chitosan FGF-2 gelatin microspheres,SPCFGM)，实现FGF-2明胶微球既作为一种基因载体又作为释放系统的可能性，调节FGF-2体内释放的量效关系，为软骨组织工程技术探索一条新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒pIRES2-EGFP-FGF-2由本课题组前期完成，胎牛血清和培养基DMEM购自美国Hyclone公司，质粒提取试剂盒购自美国Omega公司，FGF2一抗及羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物有限公司，CCK-8试剂购自南京凯基生物科技发展有限公司，硫酸亚铁铵、硫酸铁铵购自重庆北碚化学试剂厂，明胶，壳聚糖，4′,6-二脒基-2-苯基吲(4′，6-diamidino-2-pheny lindole，DAPI)购自Sigma公司，盐酸及亚铁氰化钾购自成都市科龙化工试剂厂，所用化学试剂均为分析纯。
1.2 超顺磁性氧化铁壳聚糖纳米粒子的制备及检测
化学共沉淀法[7]制备超顺磁性氧化铁壳聚糖纳米粒子(superparamagnetic iron oxide chitosan nanoparticles,SPIOCNs)，将得到的黑色沉淀用蒸馏水反复洗涤，直至中性，室温保存。取适量样本在透射电镜下观察形态，并用激光衍射粒度分析仪测定粒径及分布。用凯氏定氮法测定SPIOCNs氮含量[8]。
1.3 质粒pIRES2-EGFP-FGF-2与SPIOCNs的结合实验
取1 μL质粒pIRES2-EGFP-FGF-2在1.8 V条件下利用电转法转染入E.coli DH5α感受态细菌中，37 ℃孵育30 min，加入含有卡那霉素(1∶1 000)的LB培养基中，培养过夜，按照质粒提取试剂盒的说明书提取质粒，经BglⅡ、Sal I 双酶切鉴定，并检测浓度。将SPIOCNs溶入醋酸钠缓冲液中(pH=5.5),按不同氮/磷比例(0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1)与质粒混合，旋涡搅拌20 s,55 ℃下复合1 h。用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察质粒与SPIOCNs结合情况。
1.4 SPCFGM的制备
乳化交联法制备SPCFGM。取醋酸缓冲液(pH=5.5)配置的SPIOCNs 5 mL和FGF-2质粒5 mL混合，55 ℃孵育1 h，向混合液中加入10 mL 25%明胶，800 r/min搅拌溶解20 min制成明胶磁流体。另在三口烧瓶中加入100 mL液体石蜡和1 mL司班80，于65 ℃、800 r/min充分搅拌。将明胶磁流体缓慢滴入三口烧瓶中，300 r/min搅拌10 min，待出现乳状液后迅速改为冰浴，降温至4 ℃，缓慢滴加25％的戊二醛0.1 mL，继续搅拌2 h，加入40 mL丙酮，搅拌3 min后静置，待溶液分层后，可以看到制备出的淡黄色微球沉淀在最下层，过滤后将微球泡在10 mL丙酮溶液中，予4 ℃固化24 h。蒸馏水洗涤3次后将微球冻干，－20 ℃保存。取适量样本用蒸馏水溶解，使微球均匀分散，取微球混液滴于载玻片上，在光学显微镜下观察形态，并用激光衍射粒度分析仪测定其粒径及分布。
1.5 SPCFGM的载药量及包封率的测定
制备3批SPCFGM，收集最后的洗涤液，8 000 r/min离心5 min，取上清，用紫外分光光度仪在波长260 mm下检测质粒浓度，并称量微球重量。用上述方法制备不含质粒FGF-2的SPCGM，取制备过程中最后的洗涤液，用于检测质粒浓度时调零，按下列公式计算微球的载药量和包封率[9]:载药量＝(投入FGF-2的量－上清液中FGF-2的量)／微球重量×100％、包封率＝(投入FGF-2的量－上清液中FGF-2的量)／投入FGF-2的量×100％。
1.6 磁力天平测定SPCFGM、SPCGM的磁感应性
分别取5 mL SPCFGM及SPCGM于EP管中，置于磁天平中间称取重量，将磁场强度从0 mT(毫特斯拉,milli-tesla)逐级调到600 mT，以50 mT为间隔，分别记录磁力天平显示的重量，再将磁场强度从600 mT逐次下调至0 mT，再次记录其重量变化，实验重复三次，用0~50 mT间所测得的试管重量平均差值反映SPCFGM、SPCGM的磁感应性。
1.7 SPCFGM中质粒FGF-2的体外释放实验
称取SPCFGM 5.00 mg，置于 25 mL三角烧瓶中，加10 mL 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)，于37 ℃衡温水浴，每次采样0.5 mL上清液，同时补充PBS以维持释放介质体积不变，用核酸蛋白测定仪(260 nm)测定释放液中质粒FGF-2的含量，实验重复3次，取其均值，连续测量7 d，计算每日及累计质粒释放量，绘制体外释放曲线[10]。
1.8 细胞培养及分组
小鼠胚胎期多潜能间充质干细胞C3H10细胞为重庆医科大学附属儿童医院干细胞实验室保存，置于含10%胎牛血清DMED培养基，5% CO2、37 ℃培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。称取一定质量的SPCGM和SPCFGM两种微球，用含10%血清的DMEM培养基配制成终浓度100 μg/mL的混悬液。实验分为3组：空白对照组(Control组)，采用10%血清的DMEM培养基配；SPCGM组，采用100 μg/mL的SPCGM混悬液培养；SPCFGM组，采用100 μg/mL的SPCFGM混悬液培养。
1.9 DAPI染色检测细胞凋亡
按上述方法处理3组C3H10细胞3 d后，吸弃培养基，用PBS将微球洗去，4%多聚甲醛固定1 h，吸弃多聚甲醛，PBS洗3遍，每孔加入2 μg/mL DAPI 0.5 mL，37 ℃避光孵育10 min，PBS洗三遍，倒置荧光显微镜观察各组细胞细胞核形态，是否有核浓缩、核碎裂、染色质聚集等现象。
1.10 Western blot法检测FGF-2在C3H10细胞中的表达
按上述方法处理3组C3H10细胞7 d后，提取各组细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，取50 μg经10％SDS-PAGE分离，条件：先80 V、30 min，后100V、100 min，然后100 V、60 min电转移至PVDF膜上，用5％脱脂奶粉室温封闭1 h；TBST洗膜3次，加入兔抗小鼠FGF-2一抗(1∶200稀释)和小鼠抗小鼠β-actin 单抗(1∶200稀释)，4 ℃过夜；TBST洗膜后，分别加入HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG(1∶1 000稀释)，室温孵育1 h；TBST洗膜3次后ECL发光成像。
1.11 CCK-8法检测SPCFGM对C3H10细胞的增殖影响
以1×105个/mL密度接种于96孔培养板中，按上述方法处理3组C3H10细胞，，每孔100 uL培养体系，每组设3个复孔。置37℃ 、5%CO2的培养箱分别培养1、3、5和7 d后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，于培养箱中继续孵育2 h，酶标仪上测定450 nm波长处每孔细胞的吸光度值(A450)，实验重复3次。
1.12 流式细胞术检测细胞增殖周期
按上述方法处理3组C3H10细胞3 d后，用PBS将微球洗去，用胰酶消化细胞，收集于EP管内，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗两次后用预冷的70%(体积比)乙醇固定，流式细胞术分析细胞增殖周期。
1.13 统计学方法
采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计学处理，结果以
2 结果
2.1 SPIOCNs、SPCFGM的形态及粒径
经透射电子显微镜观察SPIOCNs，如图 1(a)所示，可见SPIOCNs微粒呈球形，分布均匀，呈聚集现象，激光衍射粒度分析仪测定其粒径为(25±9) nm，符合超顺磁性的条件。在光学显微镜下观察SPCFGM，如图 1(c)所示,可见SPCFGM微球呈规则球形，表面光滑，分散性好，粒径(140±12) μm。
图1
SPIOCNs、SPCFGM的形态及粒径
(a) SPIOCNs透射电镜照片(80 000×)； (b)SPIOCNs粒径分布；(c)SPCFGM光学显微镜照片(100×)；(d)SPCFGM粒径分布
Figure1. Morphologicy and grain size of SPIOCNs and SPCFGM(a) transmission electron micrograph of SPIOCNs (80 000×); (b) size distribution of SPIOCNs; (c) optical microscope images of SPCFGM (100×); (d) size distribution of SPCFGM
2.2 质粒pIRES2-EGFP-FGF-2与SPIOCNs的结合实验
凯氏定氮法测定SPIOCNs氮含量为(18.45±2.07) mg/mL，质粒浓度为(308.64±24.67) ng/μL。琼脂糖凝胶电泳图显示在不同氮/磷比条件下质粒与SPIOCNs的结合情况，如图 2所示，在第6泳道(氮/磷比为2.5∶1)时无条带跑出，说明此时SPIOCNs与质粒FGF-2已完全结合。
图2
不同氮/磷比条件下质粒与SPIOCNs的结合的电泳图
1：FGF-2质粒；2-6：质粒与SPIOCNs的氮/磷比分别为1∶2、1∶1、1.5∶1、 2∶1、2.5∶1；7：DNA MarkerⅡ
Figure2. Agarose gel electrophoretic profile of plasmid combined SPIOCNs with different N/P ratios1: FGF-2; 2-6: the N/P ration of plasmid/SPIOCNs is 1∶2, 1∶1, 1.5∶1, 2∶1, and 2.5∶1, respectively; 7: DNA MarkerⅡ
2.3 SPCFGM的磁感应性、载药量、包封率及体外释放活性
磁力天平测定结果显示，当磁场强度由0 mT增加到50 mT时，SPCFGM增重(18.23±0.24) mg；SPCGMM增重(17.52±0.16) mg，当磁场强度从600 mT逐渐下降至0 mT时，二者的重量变化均为0 mg，提示SPCFGM和SPCGM有较强的磁感应性。载药量和包封率是评价微球包裹药物能力的两个重要指标，在本实验中，SPCFGM的载药量为57.13%±5.41%，包封率为69.97%±0.04%。SPCFGM释放曲线如图 3所示，前4 d微球释放FGF-2速度较快，5 d后释放趋于平稳。
图3
SPCFGM释放FGF-2累积浓度的效果
Figure3.
Effect of accumulative concentrations of FGF-2 released from SPCFGM
2.4 DAPI染色检测细胞凋亡形态
荧光显微镜下可见，微球处理细胞3 d后，SPCGM组和SPCFGM组细胞的细胞核呈强荧光，核形完整，染色质均匀，无核皱缩、核碎裂等凋亡细胞现象，与Control组的细胞形态无明显差异，如图 4所示。提示终浓度100 μg/mL明胶微球不会导致C3H10细胞凋亡，对其无细胞毒作用。
图4
DAPI染色检测细胞凋亡形态(400×)
Figure4.
Apoptosis morphology of cells detected by DAPI dye (400×)
2.5 Western blot法检测FGF-2在C3H10细胞中的表达
Western blot分析显示，微球处理7 d后，SPCFGM组FGF-2蛋白相对表达量(3.04±0.74)明显高于Control组(0.81±0.16)及SPCGM组(0.63±0.15)(P＜0.05)，而Control组与SPCGM组FGF-2蛋白的表达量无统计学意义，如图 5所示。提示SPCFGM在7 d内可以释放FGF-2，并能高效表达FGF-2蛋白。
图5
Western blot检测各组细胞FGF-2蛋白的水平
Figure5.
Level of protein FGF-2 determined by Western blot in each group
2.6 CCK-8法检测SPCFGM对C3H10细胞增殖的影响
各组细胞增殖情况如表 1所示，微球处理第1 d，3组细胞都增殖缓慢，SPCFGM组与SPCGM组对C3H10细胞增殖无明显差异(P＞0.05)，从第3 d起，SPCFGM组细胞增殖加快，且明显高于Control组及SPCGM组(P＜0.05)，而Control组与SPCGM组细胞增殖情况无明显差异(P＞0.05)。提示SPCFGM在7 d内释放FGF-2，FGF-2促进C3H10细胞增殖。
表1
各组细胞不同时间点的A450值(2.7 流式细胞术检测细胞增殖周期
在细胞有丝分裂的各个时期中，能反映细胞增殖活性的时期是G2期和S期，细胞增殖指数PI=(G2+S)%。各组细胞增殖周期结果如图 6所示，微球处理细胞3 d后，SPCFGM组细胞增殖指数最高(56.10±3.01)，增殖能力最强，明显高于Control组(15.70±5.81)及SPCGM组(17.83±10.09)(P＜0.05)，提示SPCFGM在3 d内释放FGF-2，FGF-2促进C3H10细胞的有丝分裂。
图6
流式细胞仪检侧各组细胞增殖周期结果
Figure6.
Proliferation cycle results of various cells measured by flow cytometry
3 讨论与结论
超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)具有超顺磁性和良好的生物相容性，因而引起人们的广泛关注。所谓超顺磁性，是指当氧化铁纳米颗粒粒径＜30 nm时，给予外加磁场就产生磁性，无磁场时，其磁性消失[11]。此特性还使得SPIONs具有磁靶向作用，已被用于肿瘤靶向治疗[12]、磁共振成像[13]等研究。另有研究表明，适宜浓度SPIONs标记MSCs并不影响干细胞多向诱导分化能力[14]。并且SPIONs进入机体后，一部分可被机体吸收利用，其余部分通过肾脏、胆汁、皮肤等安全排除体外，对机体无损害[15]。然而，SPIONs在液态环境中易出现团聚现象，且易被氧化失去超顺磁性，因此，SPIONs应用于生物医学领域时，有必要对其进行表面修饰，不仅能增强稳定性，还能提高其在水溶液中的分散性和生物相容性，降低细胞毒性[16-17]。常用的表面修饰物有高分子聚合物、有机小分子、多糖、多肽等，本研究选用壳聚糖(chitosan,CS)修饰SPIONs。CS具有成本低、可生物降解性、生物相容性好、无毒性等优点，是常用的天然高分子载体材料[18]。同时，CS在酸性条件下为带有阳离子的高分子聚合物，通过静电吸附作用与DNA结合，使DNA不易被降解，并能够完全进入细胞，可作为基因治疗中的非病毒性载体[19]。
基因载体可以把目的基因送入靶细胞，然后将目的基因释放出来，从而发挥目的基因的特点功能。因此，作为基因载体材料的重要判断标准就是要能与DNA结合，并能在一定程度上保护DNA[20]。SPIOCNs的含氮量代表了复合微粒中壳聚糖的含量，间接反映了微粒结合DNA的能力。本实验利用凯氏定氮法测定SPIOCNs的含氮量，并通过琼脂糖凝胶电泳发现氮/磷比为2.5∶1时SPIOCNs与质粒FGF-2可以完全结合，Western blot证实SPCFGM作用于MSCs后，FGF-2蛋白高表达，说明与SPIOCNs结合的FGF-2可以释放进入细胞，并得到高效表达，证明本实验所制作的SPIOCNs可作为基因载体。
明胶是一种天然的动物胶原提取物，具有良好的生物相容性，明胶作为缓释材料主要应用在药物载体、赋型剂或缓释壳层等方面。这些材料的形成主要是利用了明胶独特的理化性能：能形成凝胶,易于成型；能与别的物质(如戊二醛)发生交联反应，形成缓释层；能被酶降解，易于被人体吸收等[21]。明胶与一些生长因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、FGF-2具有相反的电性，不仅能够通过电荷吸引吸附细胞因子，而且可通过渗透、扩散和基质本身的溶蚀调控细胞因子释放速率，起到缓释的作用[22]。故本研究选用明胶作为FGF-2的包封材料。
载药量和包封率是评价微球载药能力的重要指标，受制备材料、制备工艺等因素影响。本实验通过乳化交联法制备的SPCFGM表面光滑，分布均匀，载药量为57.13%±5.41%，包封率为69.97%±0.04%，达到FGF-2维持其活性的释放量。本实验制备的微球中由于加入了纳米氧化铁，使微球的重量增加，导致FGF-2在微球中的百分比下降，包封率有所降低。因此，提高微球载药量和包封率是本实验下一步研究的重点。
本研究还通过体外试验证实，SPCFGM作用于MSCs后，缓慢释放FGF-2，使FGF-2蛋白在MSCs中高表达，MSCs细胞增殖指数明显增高，能促进MSCs增殖分化，且SPCFGM对MSCs的增值分化具有持续性作用，证明SPCFGM可以持续缓慢释放FGF-2，并保持FGF-2的生物活性，与Mastrogiacomo等对FGF-2的研究一致[23]。
DAPI是一种荧光染料，可与双链DNA结合发挥标记作用，常用于细胞凋亡检测。凋亡细胞的细胞核破裂形成碎片，核解体，染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。本实验结果显示，SPCFGM作用于MSCs，细胞核完整，染色质均匀，无细胞凋亡形态。进一步证实SPCFGM无细胞毒性。综上所述，本实验成功制备了可释放FGF-2的SPCFGM，并保持FGF-2的活性，能促进MSCs增殖，并对MSCs细胞无毒副作用，是理想的基因载体和包封材料。下一步，我们拟将其用于体内试验，探索利用SPCFGM修复关节软骨缺损的新方法。
