在心血管疾病的发生过程中，常出现内皮功能紊乱等初期症状，而此过程与一氧化氮（NO）介导的血管舒张密切相关，NO的释放是由内皮一氧化氮合酶NOS3所调控。近期研究表明，心血管疾病常常伴随着NOS3基因多态性变化及表观遗传学修饰，而现有研究对于NOS3表观遗传学及基因多态性对于心血管疾病调控机制及靶向治疗研究关注较少。本文综述了近年来关于NOS3在心血管系统相关疾病中的研究现状，总结了其在各类疾病发病过程中的分子机制，重点阐述了NOS3蛋白解离、NOS3表观遗传修饰及多态性在心血管疾病发生发展中的作用，并为相关疾病药物开发的治疗靶点设计提供参考。
引用本文： 孙婷, 池晴佳, 王贵学. NOS3 参与心血管疾病调控机制研究进展. 生物医学工程学杂志, 2016, 33(1): 188-192. doi: 10.7507/1001-5515.20160034 复制
引言
心血管疾病包含着内皮功能紊乱、血管新生、血栓形成、血压升高等一系列病变。成血管化及成血管过程的稳定与否决定着心血管疾病的发生发展状况。在血管生成过程中，人血管内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS,NOS3)诱导释放的内皮型一氧化氮(nitric oxide，NO)可以促进血管舒张，参与血管生成的调控。在心血管疾病发展过程中，常常伴有NOS3基因表达受限或促进，从而导致生成NO的量不稳定，进而有可能出现血管内皮功能紊乱，导致动脉粥样硬化及高血压等疾病发生。
在哺乳动物中，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)有三种形式：神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS，NOS1)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS，NOS2)和NOS3。NOS家族均为二聚体结构，每个多肽链含有两个主要的功能区域，即羰基末端的氧化区域和氨基末端的还原区域[1-2]。它们通过相同的作用途径来释放NO，但由于在不同位置表达，在生物体中也分别发挥不同的作用[3]。其中NOS1主要在脑部神经系统中特异性表达，调节各种平滑肌的紧实度，使肌肉松弛[4]。NOS2在正常生物体中几乎没有表达，在抵御外来因素入侵时，它才会表现出活性，在巨噬细胞中大量表达生成NO[4]，直接干扰靶细胞的DNA从而致使其断裂呈碎片[3]。NOS3大部分在内皮细胞中表达，同时在心肌细胞、血小板及脑部某些神经元中也有表达[5]。NOS3的活性受Ca2+浓度的调控，当胞内Ca2+浓度升高时，Ca2+诱导钙调蛋白与NOS3二聚体结合，促进NOS3活性升高并刺激产生NO[6]。此外，血流剪切力通过使NOS3磷酸化来影响NOS3的功能[7]。在哺乳动物中，NOS3主要通过生成NO参与调节血管生成及抑制血小板凝聚、抑制白细胞黏附等重要生理过程。
NOS3蛋白的解离是造成NO合成不足的主要因素之一，NO的不足引起NO依赖的血管内皮功能紊乱，有可能导致多种病症的发生。近年来研究发现，NOS3的表观遗传学变化及组蛋白转录后修饰也与多种疾病的发生有密切关系。也有研究发现，冠心病、中风、心肌梗死、前列腺癌及小儿急性淋巴细胞白血病等多种疾病均与NOS3基因的多态性有一定关联，其具体机制还未阐明。本文总结了近年来NOS3参与心血管疾病发展过程的相关研究，重点阐述NOS3蛋白解离、NOS3表观遗传学变化及基因多态性与疾病发生的关系，进而为相关疾病的治疗靶点研究及相应药物开发提供参考。
1 NOS3参与心血管疾病发展的调控机制
人类的NOS3基因位于染色体7p35-p36区，包括26个外显子，全长21 kb，其蛋白eNOS大小为135 kD，包含有1 203个氨基酸。在生理条件下，血管中的NO主要被NOS3释放产生。NOS3受剪切力和血管舒缓激肽及乙酰胆碱等激动剂刺激，释放NO以促进血管舒张，抑制血小板聚集和黏附，参与内皮祖细胞的活化、平滑肌细胞增殖等调控过程[8]，同时也参与多种疾病的发病及抑制进程。
1.1 NOS3蛋白二聚体解离
NOS3蛋白二聚体的解离受多种因素的影响。NOS3蛋白中，多个丝氨酸、苏氨酸位点的磷酸化和二氢叶酸还原酶的降表达直接导致四氢生物喋呤(tetrahydrobiopterin,BH4)的缺乏，从而导致NOS3二聚体解离。另有近期研究发现，氧化应激及S-谷胱甘肽化在NOS3介导的动脉疾病中高频率出现，氧化应激及S-谷胱甘肽化导致NOS3蛋白解离而致使多种心血管疾病的产生。
内皮细胞响应血流刺激，通过调控NOS3来释放血管舒张剂NO进而调节血管生成，同时诱导产生的NO也会扩散入血液中抑制血小板聚集和黏附，不仅可以防止血栓形成，同时也阻止了因血小板诱导的生长因子释放导致的平滑肌细胞增殖及基质的产生[9]。正常生理条件下，NOS3蛋白产生的NO在内皮层功能维持中有重要作用。在血管中，多种酶类包括NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、解离的NOS3蛋白及线粒体呼吸链均会产生活性氧。同时，血管系统中也存在抗氧化系统，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽氧化酵素及对氧磷酶等来消耗这些活性氧，达到平衡。血液中胆固醇过多会导致血管中NO生物利用率降低，且伴随游离的活性氧增加，活性氧过多会导致脂蛋白和磷脂的氧化，导致动脉硬化。活性氧的增加会将原有的NO被快速氧化而失活，NO被氧化的产物——过氧亚硝基导致BH4的氧化，而缺少BH4会导致NOS3蛋白二聚体的解离，减少NOS3蛋白诱导的NO生成[10]，从而降低对血管内壁的保护。同时，NOS3蛋白的解离使其不再生成NO而是生成超氧化物O2-，从而导致更加严重的内皮功能紊乱，引起动脉粥样硬化及高脂血症等[11]。
在正常血管中，伴随着L-精氨酸和BH4的消耗以及精氨酸甲基化水平的提高，NOS3解偶联会引起氧化应激反应。在细胞信号和适应过程中存在一种可逆的蛋白质修饰——硫醇类蛋白质发生S-谷胱甘肽化。研究发现NOS3的S-谷胱甘肽化会可逆性地降低NOS3的活性。在NOS3功能维持中有两个高度保守的半胱氨酸残基(与FMN的和与FAD的结合域)是不可或缺的，这两个位点对于NOS3的氧化还原功能调节至关重要，S-谷胱甘肽化通过这两个半胱氨酸残基来调节NOS3的功能。高血压患者的血管中由于储存了大量的硫醇类特异性还原剂，导致内皮细胞中的NOS3的 S-谷胱甘肽化提高。NOS3的S-谷胱甘肽化提高进而导致NO合成的不足同时伴有过氧化物O2-的过度生成，导致内皮依赖的血管舒张受损，进一步导致炎性反应、内皮受损等一系列心血管疾病的产生。研究人员在患有高血压病症的大鼠血管进行免疫组化实验，发现大量的S-谷胱甘肽与NOS3一起被共定位在内皮层，而正常的大鼠血管中仅有少量的S-谷胱甘肽，在体证实了高血压发展过程中NOS3被S-谷胱甘肽化，进而调节细胞信号转导、内皮功能及血管舒张等过程[12]。此外，其他还原剂也能通过其他途径如S-亚硝基化作用等还原NOS3，参与调控高血压发病的病理过程。
1.2 NOS3基因的表观遗传修饰
NOS3的表达部分由表观遗传学修饰调控，包括基因启动子区域的甲基化及组蛋白乙酰化等。众所周知，基因的DNA甲基化程度决定了基因的转录水平，甲基化程度越高，其mRNA水平的表达越低。在NOS3低表达的细胞中，NOS3启动子区域呈现高度甲基化状态，而在NOS3高表达的细胞类型中，NOS3启动子区域几乎全部为去甲基化状态。体外实验表明，NOS3基因在未分化的早期内皮祖细胞及CD34+造血祖细胞和中期成血管细胞中呈高度甲基化，而在分化的内皮细胞[脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)及微血管内皮细胞等]中呈极低甲基化[13]，通过去甲基化可以提高NOS3低表达的细胞中NOS3的表达情况[14]。某些NOS3甲基化水平异常与心血管疾病发生有密切关系。
近期研究表明，小儿阻塞性睡眠呼吸综合征患者中可出现内皮功能紊乱现象，而这一现象是由NOS3表达的降低导致的，进一步研究发现，该表达降低是通过-171位CpG位点的甲基化造成的[15]。研究人员分别测定了正常胎儿和宫内生长受限胎儿的脐动脉内皮细胞(human umbilical artery endothelial cells,HUAEC)和HUVEC中NOS3的甲基化状态。发现与正常怀孕的对照组相比，患病胎儿的HUAEC中NOS3蛋白和mRNA水平表达均增加，HUVEC中NOS3蛋白和mRNA水平表达均降低。患病胎儿HUAEC中NOS3甲基化程度较对照组降低，患病胎儿HUVEC中NOS3甲基化程度较对照组升高，且CpG-352位点甲基化在患病胎儿的HUAEC中表达低于对照组，但在其HUVEC中CpG-352位点甲基化水平高于对照组[16]。此外，研究表明，NOS3甲基化状态与肥胖症也有一定联系，且胎儿时期的NOS3甲基化状态与未成年时期的骨密度也有一定关联[15, 17-18]。
在NOS3启动子区域有多个组蛋白修饰位点，不同的组蛋白修饰导致不同细胞类型中特异性的DNA转录水平，进而来调控不同类型细胞中NOS3的表达。NOS3的内皮特异性表达被细胞特异性的组蛋白修饰所调控，在NOS3基因启动子区域检测到了大量的组蛋白修饰位点，它们均与NOS3转录调控有关。缺氧状态下，细胞中组蛋白脱乙酰酶Jmjd3表达升高，导致NOS3组蛋白乙酰化降低进而抑制NOS3基因的表达，造成内皮功能紊乱[13]。研究人员构建了新生儿持续性肺动脉高压大鼠模型，通过染色体免疫共沉淀发现，在患者发病过程中伴随着NOS3表达变化，而此变化是通过表观遗传学机制来调控的。患病组中组蛋白H3和组蛋白H4的乙酰化水平显著高于对照组[19]。Won等[20]通过在小鼠中开展ChIP实验，发现DJ-1/park7可以通过调控NOS3中-138和-291启动子区域的乙酰化来改变NOS3的表达，进一步调节血管舒张及血压。
1.3 NOS3基因多态性
1998年，NOS3的一些多态性位点被科学家所发现，经后续研究表明，多种疾病的发生发展与NOS3基因的多态性密切相关。在NOS3基因中目前已发现多个多态性位点，包括外显子7中G894T(rs1799983)突变，内含子4位置有27 bp的可变数目串联重复区域(NOS3的4a4b多态性)(rs61722009)，启动子区域的T-786C突变(rs2070744)和内含子23的G/T突变等。其中外显子7中的G894T突变使其编码的氨基酸序列发生改变(Glu298-Asp)，研究人员分别对三种形式(GG，GT和TT)的个体进行了统计分析，研究表明，此突变有可能与冠心病、中风、心肌梗死及前列腺癌[21-22]等相关。在对妊娠高血压患者的研究中，发现晚期妊娠高血压患病者中894TT频率明显高于正常对照组[23]，对中国大陆汉族孕妇的研究中也发现妊娠高血压患者中298Asp等位基因频率明显降低[24]。也有研究发现，894GT和TT人群体重指数(body mass index,BMI)也较GG人群偏高[25]。另外，内含子4a4b多态性在所有人种的糖尿病患者中均存在[26]。在对突尼斯人群患心肌梗死的情况开展调查分析后发现，突尼斯心肌梗死患者与其NOS3内含子4a4b多态性存在联系，其患病者等位基因为4a的概率显著高于健康的对照组[27]。同时，在妊娠高血压患者分析中，早期妊娠高血压患者出现aa的频率显著高于对照组，晚期妊娠高血压中单体b出现的频率较高[23]。在T-786C多态性位点的个体中，由于其位于基因的启动子区域，突变有可能会调节NOS3基因的表达。研究发现，在等位基因位置核苷酸为C的个体出现动脉粥样硬化疾病及冠心病的概率要显著高于T的个体[28]，TC杂合及CC纯合的个体更容易发生偏头痛[25]，且此多态性与高血压及心肌梗死等均相关[28]。
由于NOS3的多态性，其突变也会造成多种癌症的发生。小儿急性淋巴细胞白血病容易复发也与NOS3多态性有密切关系，由于NOS3具有多个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点，这为NOS3基因的多种突变提供了极大可能。
2 基于NOS3靶点治疗的展望
关于心血管疾病的治疗，目前已有一些治疗手段通过临床前动物实验，也有一些正在临床试验中鉴定。以前的治疗方法包括直接吸入NO或者用可以释放NO的药物来短暂、快速地促进动脉血管舒张。分析NOS3参与心血管疾病的分子机制以及一些信号途径相关的靶点，或许可以作为相关疾病治疗的依据。
首先，氧化应激可以导致血管系统中NO被快速氧化，通过S-谷胱甘肽化、S-亚硝基化等途径导致NOS3二聚体解离。缓解氧化应激反应可以作为治疗内皮功能紊乱的靶点之一。由此可以从以下方面来考虑治疗靶点设计：①通过还原剂来中和血管系统中多余的超氧化物，使NO功能恢复正常，起到保护血管的作用；也可以通过抑制S-谷胱甘肽化、S-亚硝基化等还原反应来抑制氧化应激对于NOS3酶系统造成的进一步破坏[29]。②抑制NOS3二聚体解离可成为一个靶点，其中包括抑制BH4的氧化或者补充一定量的BH4，或者补充L-精氨酸的含量，使其保持足够浓度来参与NOS3二聚体形成，保持其NOS3生成NO的能力，进而保护血管系统[30]。
同时，NOS3基因的表观遗传修饰机制也有待深入研究。NOS3基因的多态性尤其是单核苷酸多态性很有可能在NOS3基因启动子区域产生额外的甲基化位点，使得基因多态性与表观遗传变化建立联系。表观遗传学修饰会在转录水平调节NOS3基因的表达，进而调控下游NOS3蛋白表达，影响NO的生成，进而参与各种生理病理过程。在某些疾病易感人群中研究人员发现了其NOS3甲基化水平的不同，这一点可以为相关疾病风险预测提供有力工具，以期从源头上避免疾病的产生。同时，通过定点甲基化或者去甲基化工具来调节NOS3的表达也可作为相关疾病治疗可以考虑的因素。
关于NOS3多态性与各类疾病的关系是一个非常值得深入研究的问题。目前的研究还在统计分析阶段，由于各个群体基因的不同，也由于每个研究选取的标准不同，研究人员得出的结论大多存在争议。且由于NOS3多态性与各类疾病关系的具体机制还未阐明，这将是探究心血管疾病发生机制的一个重要研究方向。
3 结语
NOS3在生物体中是至关重要的调节基因，其不仅与高血压、动脉粥样硬化、糖尿病及冠心病等疾病相关，还与多种肿瘤、肥胖症及胎儿宫内生长受限等多种疾病有一定关联。NOS3蛋白解离、NOS3基因表观遗传学修饰及其多态性与各类疾病关系的机制还未阐明，关于NOS3多态性、表观遗传机制等与心血管疾病的关系还需要科学家们更深入的研究，同时基于各类调控机制的药物靶点设计也是未来相关研究发展的方向。
引言
心血管疾病包含着内皮功能紊乱、血管新生、血栓形成、血压升高等一系列病变。成血管化及成血管过程的稳定与否决定着心血管疾病的发生发展状况。在血管生成过程中，人血管内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS,NOS3)诱导释放的内皮型一氧化氮(nitric oxide，NO)可以促进血管舒张，参与血管生成的调控。在心血管疾病发展过程中，常常伴有NOS3基因表达受限或促进，从而导致生成NO的量不稳定，进而有可能出现血管内皮功能紊乱，导致动脉粥样硬化及高血压等疾病发生。
在哺乳动物中，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)有三种形式：神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS，NOS1)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS，NOS2)和NOS3。NOS家族均为二聚体结构，每个多肽链含有两个主要的功能区域，即羰基末端的氧化区域和氨基末端的还原区域[1-2]。它们通过相同的作用途径来释放NO，但由于在不同位置表达，在生物体中也分别发挥不同的作用[3]。其中NOS1主要在脑部神经系统中特异性表达，调节各种平滑肌的紧实度，使肌肉松弛[4]。NOS2在正常生物体中几乎没有表达，在抵御外来因素入侵时，它才会表现出活性，在巨噬细胞中大量表达生成NO[4]，直接干扰靶细胞的DNA从而致使其断裂呈碎片[3]。NOS3大部分在内皮细胞中表达，同时在心肌细胞、血小板及脑部某些神经元中也有表达[5]。NOS3的活性受Ca2+浓度的调控，当胞内Ca2+浓度升高时，Ca2+诱导钙调蛋白与NOS3二聚体结合，促进NOS3活性升高并刺激产生NO[6]。此外，血流剪切力通过使NOS3磷酸化来影响NOS3的功能[7]。在哺乳动物中，NOS3主要通过生成NO参与调节血管生成及抑制血小板凝聚、抑制白细胞黏附等重要生理过程。
NOS3蛋白的解离是造成NO合成不足的主要因素之一，NO的不足引起NO依赖的血管内皮功能紊乱，有可能导致多种病症的发生。近年来研究发现，NOS3的表观遗传学变化及组蛋白转录后修饰也与多种疾病的发生有密切关系。也有研究发现，冠心病、中风、心肌梗死、前列腺癌及小儿急性淋巴细胞白血病等多种疾病均与NOS3基因的多态性有一定关联，其具体机制还未阐明。本文总结了近年来NOS3参与心血管疾病发展过程的相关研究，重点阐述NOS3蛋白解离、NOS3表观遗传学变化及基因多态性与疾病发生的关系，进而为相关疾病的治疗靶点研究及相应药物开发提供参考。
1 NOS3参与心血管疾病发展的调控机制
人类的NOS3基因位于染色体7p35-p36区，包括26个外显子，全长21 kb，其蛋白eNOS大小为135 kD，包含有1 203个氨基酸。在生理条件下，血管中的NO主要被NOS3释放产生。NOS3受剪切力和血管舒缓激肽及乙酰胆碱等激动剂刺激，释放NO以促进血管舒张，抑制血小板聚集和黏附，参与内皮祖细胞的活化、平滑肌细胞增殖等调控过程[8]，同时也参与多种疾病的发病及抑制进程。
1.1 NOS3蛋白二聚体解离
NOS3蛋白二聚体的解离受多种因素的影响。NOS3蛋白中，多个丝氨酸、苏氨酸位点的磷酸化和二氢叶酸还原酶的降表达直接导致四氢生物喋呤(tetrahydrobiopterin,BH4)的缺乏，从而导致NOS3二聚体解离。另有近期研究发现，氧化应激及S-谷胱甘肽化在NOS3介导的动脉疾病中高频率出现，氧化应激及S-谷胱甘肽化导致NOS3蛋白解离而致使多种心血管疾病的产生。
内皮细胞响应血流刺激，通过调控NOS3来释放血管舒张剂NO进而调节血管生成，同时诱导产生的NO也会扩散入血液中抑制血小板聚集和黏附，不仅可以防止血栓形成，同时也阻止了因血小板诱导的生长因子释放导致的平滑肌细胞增殖及基质的产生[9]。正常生理条件下，NOS3蛋白产生的NO在内皮层功能维持中有重要作用。在血管中，多种酶类包括NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、解离的NOS3蛋白及线粒体呼吸链均会产生活性氧。同时，血管系统中也存在抗氧化系统，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽氧化酵素及对氧磷酶等来消耗这些活性氧，达到平衡。血液中胆固醇过多会导致血管中NO生物利用率降低，且伴随游离的活性氧增加，活性氧过多会导致脂蛋白和磷脂的氧化，导致动脉硬化。活性氧的增加会将原有的NO被快速氧化而失活，NO被氧化的产物——过氧亚硝基导致BH4的氧化，而缺少BH4会导致NOS3蛋白二聚体的解离，减少NOS3蛋白诱导的NO生成[10]，从而降低对血管内壁的保护。同时，NOS3蛋白的解离使其不再生成NO而是生成超氧化物O2-，从而导致更加严重的内皮功能紊乱，引起动脉粥样硬化及高脂血症等[11]。
在正常血管中，伴随着L-精氨酸和BH4的消耗以及精氨酸甲基化水平的提高，NOS3解偶联会引起氧化应激反应。在细胞信号和适应过程中存在一种可逆的蛋白质修饰——硫醇类蛋白质发生S-谷胱甘肽化。研究发现NOS3的S-谷胱甘肽化会可逆性地降低NOS3的活性。在NOS3功能维持中有两个高度保守的半胱氨酸残基(与FMN的和与FAD的结合域)是不可或缺的，这两个位点对于NOS3的氧化还原功能调节至关重要，S-谷胱甘肽化通过这两个半胱氨酸残基来调节NOS3的功能。高血压患者的血管中由于储存了大量的硫醇类特异性还原剂，导致内皮细胞中的NOS3的 S-谷胱甘肽化提高。NOS3的S-谷胱甘肽化提高进而导致NO合成的不足同时伴有过氧化物O2-的过度生成，导致内皮依赖的血管舒张受损，进一步导致炎性反应、内皮受损等一系列心血管疾病的产生。研究人员在患有高血压病症的大鼠血管进行免疫组化实验，发现大量的S-谷胱甘肽与NOS3一起被共定位在内皮层，而正常的大鼠血管中仅有少量的S-谷胱甘肽，在体证实了高血压发展过程中NOS3被S-谷胱甘肽化，进而调节细胞信号转导、内皮功能及血管舒张等过程[12]。此外，其他还原剂也能通过其他途径如S-亚硝基化作用等还原NOS3，参与调控高血压发病的病理过程。
1.2 NOS3基因的表观遗传修饰
NOS3的表达部分由表观遗传学修饰调控，包括基因启动子区域的甲基化及组蛋白乙酰化等。众所周知，基因的DNA甲基化程度决定了基因的转录水平，甲基化程度越高，其mRNA水平的表达越低。在NOS3低表达的细胞中，NOS3启动子区域呈现高度甲基化状态，而在NOS3高表达的细胞类型中，NOS3启动子区域几乎全部为去甲基化状态。体外实验表明，NOS3基因在未分化的早期内皮祖细胞及CD34+造血祖细胞和中期成血管细胞中呈高度甲基化，而在分化的内皮细胞[脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)及微血管内皮细胞等]中呈极低甲基化[13]，通过去甲基化可以提高NOS3低表达的细胞中NOS3的表达情况[14]。某些NOS3甲基化水平异常与心血管疾病发生有密切关系。
近期研究表明，小儿阻塞性睡眠呼吸综合征患者中可出现内皮功能紊乱现象，而这一现象是由NOS3表达的降低导致的，进一步研究发现，该表达降低是通过-171位CpG位点的甲基化造成的[15]。研究人员分别测定了正常胎儿和宫内生长受限胎儿的脐动脉内皮细胞(human umbilical artery endothelial cells,HUAEC)和HUVEC中NOS3的甲基化状态。发现与正常怀孕的对照组相比，患病胎儿的HUAEC中NOS3蛋白和mRNA水平表达均增加，HUVEC中NOS3蛋白和mRNA水平表达均降低。患病胎儿HUAEC中NOS3甲基化程度较对照组降低，患病胎儿HUVEC中NOS3甲基化程度较对照组升高，且CpG-352位点甲基化在患病胎儿的HUAEC中表达低于对照组，但在其HUVEC中CpG-352位点甲基化水平高于对照组[16]。此外，研究表明，NOS3甲基化状态与肥胖症也有一定联系，且胎儿时期的NOS3甲基化状态与未成年时期的骨密度也有一定关联[15, 17-18]。
在NOS3启动子区域有多个组蛋白修饰位点，不同的组蛋白修饰导致不同细胞类型中特异性的DNA转录水平，进而来调控不同类型细胞中NOS3的表达。NOS3的内皮特异性表达被细胞特异性的组蛋白修饰所调控，在NOS3基因启动子区域检测到了大量的组蛋白修饰位点，它们均与NOS3转录调控有关。缺氧状态下，细胞中组蛋白脱乙酰酶Jmjd3表达升高，导致NOS3组蛋白乙酰化降低进而抑制NOS3基因的表达，造成内皮功能紊乱[13]。研究人员构建了新生儿持续性肺动脉高压大鼠模型，通过染色体免疫共沉淀发现，在患者发病过程中伴随着NOS3表达变化，而此变化是通过表观遗传学机制来调控的。患病组中组蛋白H3和组蛋白H4的乙酰化水平显著高于对照组[19]。Won等[20]通过在小鼠中开展ChIP实验，发现DJ-1/park7可以通过调控NOS3中-138和-291启动子区域的乙酰化来改变NOS3的表达，进一步调节血管舒张及血压。
1.3 NOS3基因多态性
1998年，NOS3的一些多态性位点被科学家所发现，经后续研究表明，多种疾病的发生发展与NOS3基因的多态性密切相关。在NOS3基因中目前已发现多个多态性位点，包括外显子7中G894T(rs1799983)突变，内含子4位置有27 bp的可变数目串联重复区域(NOS3的4a4b多态性)(rs61722009)，启动子区域的T-786C突变(rs2070744)和内含子23的G/T突变等。其中外显子7中的G894T突变使其编码的氨基酸序列发生改变(Glu298-Asp)，研究人员分别对三种形式(GG，GT和TT)的个体进行了统计分析，研究表明，此突变有可能与冠心病、中风、心肌梗死及前列腺癌[21-22]等相关。在对妊娠高血压患者的研究中，发现晚期妊娠高血压患病者中894TT频率明显高于正常对照组[23]，对中国大陆汉族孕妇的研究中也发现妊娠高血压患者中298Asp等位基因频率明显降低[24]。也有研究发现，894GT和TT人群体重指数(body mass index,BMI)也较GG人群偏高[25]。另外，内含子4a4b多态性在所有人种的糖尿病患者中均存在[26]。在对突尼斯人群患心肌梗死的情况开展调查分析后发现，突尼斯心肌梗死患者与其NOS3内含子4a4b多态性存在联系，其患病者等位基因为4a的概率显著高于健康的对照组[27]。同时，在妊娠高血压患者分析中，早期妊娠高血压患者出现aa的频率显著高于对照组，晚期妊娠高血压中单体b出现的频率较高[23]。在T-786C多态性位点的个体中，由于其位于基因的启动子区域，突变有可能会调节NOS3基因的表达。研究发现，在等位基因位置核苷酸为C的个体出现动脉粥样硬化疾病及冠心病的概率要显著高于T的个体[28]，TC杂合及CC纯合的个体更容易发生偏头痛[25]，且此多态性与高血压及心肌梗死等均相关[28]。
由于NOS3的多态性，其突变也会造成多种癌症的发生。小儿急性淋巴细胞白血病容易复发也与NOS3多态性有密切关系，由于NOS3具有多个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点，这为NOS3基因的多种突变提供了极大可能。
2 基于NOS3靶点治疗的展望
关于心血管疾病的治疗，目前已有一些治疗手段通过临床前动物实验，也有一些正在临床试验中鉴定。以前的治疗方法包括直接吸入NO或者用可以释放NO的药物来短暂、快速地促进动脉血管舒张。分析NOS3参与心血管疾病的分子机制以及一些信号途径相关的靶点，或许可以作为相关疾病治疗的依据。
首先，氧化应激可以导致血管系统中NO被快速氧化，通过S-谷胱甘肽化、S-亚硝基化等途径导致NOS3二聚体解离。缓解氧化应激反应可以作为治疗内皮功能紊乱的靶点之一。由此可以从以下方面来考虑治疗靶点设计：①通过还原剂来中和血管系统中多余的超氧化物，使NO功能恢复正常，起到保护血管的作用；也可以通过抑制S-谷胱甘肽化、S-亚硝基化等还原反应来抑制氧化应激对于NOS3酶系统造成的进一步破坏[29]。②抑制NOS3二聚体解离可成为一个靶点，其中包括抑制BH4的氧化或者补充一定量的BH4，或者补充L-精氨酸的含量，使其保持足够浓度来参与NOS3二聚体形成，保持其NOS3生成NO的能力，进而保护血管系统[30]。
同时，NOS3基因的表观遗传修饰机制也有待深入研究。NOS3基因的多态性尤其是单核苷酸多态性很有可能在NOS3基因启动子区域产生额外的甲基化位点，使得基因多态性与表观遗传变化建立联系。表观遗传学修饰会在转录水平调节NOS3基因的表达，进而调控下游NOS3蛋白表达，影响NO的生成，进而参与各种生理病理过程。在某些疾病易感人群中研究人员发现了其NOS3甲基化水平的不同，这一点可以为相关疾病风险预测提供有力工具，以期从源头上避免疾病的产生。同时，通过定点甲基化或者去甲基化工具来调节NOS3的表达也可作为相关疾病治疗可以考虑的因素。
关于NOS3多态性与各类疾病的关系是一个非常值得深入研究的问题。目前的研究还在统计分析阶段，由于各个群体基因的不同，也由于每个研究选取的标准不同，研究人员得出的结论大多存在争议。且由于NOS3多态性与各类疾病关系的具体机制还未阐明，这将是探究心血管疾病发生机制的一个重要研究方向。
3 结语
NOS3在生物体中是至关重要的调节基因，其不仅与高血压、动脉粥样硬化、糖尿病及冠心病等疾病相关，还与多种肿瘤、肥胖症及胎儿宫内生长受限等多种疾病有一定关联。NOS3蛋白解离、NOS3基因表观遗传学修饰及其多态性与各类疾病关系的机制还未阐明，关于NOS3多态性、表观遗传机制等与心血管疾病的关系还需要科学家们更深入的研究，同时基于各类调控机制的药物靶点设计也是未来相关研究发展的方向。