通过超声造影时间信号曲线获得人肺腺癌异位移植瘤血流灌注参数, 进一步探究肿瘤不同生长时间微血管生成特点。本文选取21只裸鼠, 建立人肺腺癌异位移植瘤模型, 于7d、14 d及28 d进行超声造影(CEUS), 获得肿瘤血流灌注图像及时间信号参数, 包括上升时间(RT)、峰值强度(PI)和曲线下面积(AUC)。CD34免疫组化染色获得肿瘤微血管密度(MVD)。实验结果显示, 7 d、14 d及28 d的PI与AUC逐渐降低(P < 0.05)。RT随着肿瘤生长时间延长逐渐增高(P < 0.05)。在有坏死的肿瘤中, 非坏死区域的PI、AUC比坏死区域大(P < 0.05)。CD34染色发现坏死肿瘤的MVD较无坏死肿瘤低[(7.50±3.44)条vs. (12.44±5.74)条, P=0.034]。MVD与PI呈正相关(r=0.668, P=0.008)。本文研究结果表明, 超声造影对人肺腺癌异位移植瘤血流灌注研究具有一定价值。时间信号曲线的PI、AUC及RT可以反映肿瘤的微血管生成情况。
引用本文： 许华燕, 庄华, 杨志刚, 李媛, 师轲. 超声造影时间信号强度曲线对人肺腺癌裸鼠异位移植瘤微血管生成特点的定量研究. 生物医学工程学杂志, 2016, 33(2): 332-336. doi: 10.7507/1001-5515.20160056 复制
引言
肺癌是全球发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。近年来，肺癌的诊疗水平有较大提高，但以外科手术为主的多学科综合治疗效果仍不理想，肺癌总的5年生存率仍然很低。随着肿瘤分子生物学及细胞生物学的发展，肺癌靶向治疗特别是以血管生成为靶点的血管靶向治疗发展迅速。对于血管靶向治疗的疗效，即治疗前后血管生成的变化，目前国内外仍然缺乏有效的评价手段。因此，借助生物建模等研究手段探索和建立更为有效的检查方法和检测指标，了解靶向治疗前后肿瘤血管生成情况的变化，对肿瘤靶向治疗的疗效评价具有重要意义。超声造影(contrast enhanced ultrasonography，CEUS)是一种理想的实质组织微循环血流灌注定量技术，与计算机断层扫描(computed tomography，CT)及磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技术比较，具有无创、无辐射、可多次重复、实时成像等显著优点，已被运用于多种器官及肿瘤组织的微循环血流灌注研究[1]。
本研究采用超声造影系统获得人肺腺癌异位移植瘤血流灌注图像，通过图像后处理获得超声造影时间信号曲线及灌注参数，以了解肺癌治疗前不同时间点的微血管生长及演变趋势。
1 材料与方法
1.1 人肺腺癌裸鼠异位移植瘤模型建立
选用4周龄、15～20 g重BALB/C裸鼠作为载体，将人肺腺癌A549细胞悬液按接种量5×106个细胞/只注入裸鼠背部皮下，鼓起皮丘为接种成功。最终接种成功瘤鼠21只，每两天观察一次肿瘤生长情况。接种成功后的瘤鼠平均分为3组，分别于3个不同时间点即7 d、14 d及28 d进行超声造影检查。
1.2 超声造影检查
使用Philips iU22 unit (Philips，Bothell，WA，USA)超声系统，首先常规定位肿瘤并观察肿瘤的形态及大小；将粉末状管腔内造影剂(Tianxia，HuZhou，China)用0.9%生理盐水按照1 000:50比例进行稀释，以2.5 μL/g从鼠尾静脉在2～4 s内注入造影剂，同时通过超声探头采集人肺腺癌异位移植瘤血流灌注动态图像。
1.3 免疫组化染色及微血管密度计数方法
进行超声造影检查后，取肿瘤组织进行CD34免疫组化染色。在光学显微镜(100×)下观察每张组织切片，并人工计数肿瘤的微血管密度(Microvessel density，MVD)。MVD计数参照Weidnerd等计数方法，以染成棕黄色的内细胞簇或单个内皮细胞作为一根可计数血管，位置不同的血管内皮细胞均作为独立血管进行计数；与邻近微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织成分不相连、标记为棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇均作为1根可计数血管。每张切片在光镜(100×)下寻找MVD最高的区域，即为热点，然后在光学显微镜(200×)下对热点进行血管计数，记录6个视野内的微血管数，计算平均数值，取平均值作为该例标本的MVD数值[2-3]。
1.4 超声造影图像分析
采用离线软件Q lab(Philips medical system，Bothell，WA，USA)对不同时间点的肺癌血流灌注图像进行分析，选取肿瘤区域勾画感兴趣区，避开瘤鼠自身组织，采用y(t)=A×(t-t0)×exp(-alpha×(t-t0))+C进行曲线拟合，拟合过程中同时对运动干扰进行校正，最后软件自动计算时间信号曲线如图 1所示，得到血流灌注参数包括上升时间(Rise time，RT)、峰值强度(Peak intensity，PI)、曲线下面积(Area under the curve，AUC)。接下来，采用同样的拟合曲线，在灌注图片上同时勾画坏死区域及非坏死区域两个感兴趣区，获得坏死与非坏死区域灌注参数，其中坏死区域定义为超声造影图像上呈灌注缺损的区域[4]。
图1
人肺腺癌异位移植瘤CEUS图像及其时间信号曲线
Figure1.
CEUS of lung adenocarcinoma xenograft in nude mouse
1.5 统计分析
所有测量值以均数±标准差(
2 结果
2.1 不同时间点超声造影及MVD结果
所有瘤鼠均成功进行超声造影检查。通过后处理软件获得所有肿瘤超声灌注时间信号曲线及其参数，如表 1所示。14 d及28 d组肿瘤组织内出现不同程度坏死。不同时间组肿瘤的灌注参数均存在统计学差异(P < 0.05)。7 d组肿瘤的AUC和PI最高[分别为(1 011.39±125.15) dBs和(18.94±7.50) dB]。随着肿瘤生长，瘤体发生不同程度坏死，14 d及28 d组的AUC [(955.52±368.72) dBs vs. (315.00±178.53) dBs，P=0.003]及PI [(15.26±3.90) dB vs. (10.94±3.65) dB，P=0.008]值逐渐降低。随着肿瘤生长，其RT逐渐延长(P < 0.05)。CD34免疫组化染色可显示肿瘤不同时间点的微血管生成情况如图 2所示，并获得不同时期肿瘤的MVD。MVD结果显示，28 d组的MVD最小，而7d组MVD最大(P < 0.05)，如表 1所示。
表1
人肺腺癌异位移植瘤不同时间点CEUS时间信号曲线参数及MVD结果
Table1.
Time-intensity curve parameters of CEUS and MVD of lung adenocarcinoma xenograft model.
图2
7 d组、14 d组及28 d组CD34免疫组化染色(200×)。箭头：肿瘤内血管
Figure2.
CD34 immunohistochemisty stain for MVD. Arrow shows the microvessels of tumor
2.2 坏死区域与非坏死区域超声造影结果比较
在坏死的肿瘤中，肉眼观察非坏死区域的超声显影信号较强，而坏死区域成灌注缺损；两个区域时间信号曲线比较发现，坏死区域的时间信号曲线比非坏死区域低，如图 3所示。时间信号参数显示非坏死部分的AUC[(328.19±182.45) dBs vs.(172.13±114.63) dBs，P=0.039]及PI[(17.08±3.38) dB vs. (11.03±6.55) dB，P=0.029]值高于坏死部分。通过计数肿瘤的MVD发现，CD34染色发现坏死肿瘤的MVD较非坏死肿瘤低[(7.50±3.44)条vs.(12.44±5.74)条，P=0.034]。
图3
坏死肿瘤的超声灌注成像。红色：坏死区域；黄色：非坏死区域
Figure3.
Contrast enhanced ultrasonography of lung adenocarcinoma xenograft nude mouse with necrosis. Red:necrotic part; Yellow:Non-necrotic part
2.3 肿瘤MVD与PI值得相关性分析
Pearson积矩相关性分析显示肿瘤的MVD与PI成正相关(r=0.668，P=0.008)，如图 4所示。
图4
MVD与PI Pearson积矩相关性分析
Figure4.
Pearson correlation between MVD and PI
3 讨论
超声造影运用微泡造影剂进行组织显像，可通过测定组织的信号强度直接反应其微血管灌注量，是测定肿瘤微血管灌注程度常用方法。超声后处理软件通过逻辑算法获得时间信号曲线，可反应组织的微血管灌注状态。时间信号曲线参数包括PI、RT及AUC[5]。PI为肿瘤显影最明显时的信号强度，可由肿瘤血管床中的微泡总量反应。RT指从肿瘤开始显影到显影达最大值所需时间。AUC是时间信号曲线下的面积[6]。
肺癌是一种富血供恶性肿瘤。有研究表明，恶性肿瘤的生长、侵袭性及转移与肿瘤血管生成密切相关。虽然肺癌的诊断多依赖CT检查，但是超声对于靠近胸膜的周围型肺癌及合并肺不张的中央型肺癌具有良好的诊断价值[4, 7-8]。与常规的CT检查相比，超声造影是一种无辐射、可重复性强、能实时显像的辅助检查技术，且超声造影剂不进入组织间隙，能较好反应肿瘤的微血管生长情况，已广泛运用于胃肠道、肝脏、乳腺及甲状腺肿瘤等恶性肿瘤的科研及临床诊断[9-13]。本研究采用超声造影技术探究不同时间点人肺腺癌裸鼠异位移植瘤微血管灌注情况，从而获得人肺腺癌裸鼠异位移植瘤中微血管随时间的生长趋势，为临床抗血管药物治疗提供前期研究基础。本研究发现7d组人肺腺癌裸鼠异位移植瘤的PI及AUC最大，随着肿瘤的生长及坏死，14 d及28 d组肿瘤的PI和AUC逐渐降低，而RT呈逐渐延长趋势。在有坏死的肿瘤中，肉眼观察，非坏死区域的超声显影信号较强，根据量化结果表明坏死区域的PI和AUC均低于非坏死区域。本研究结果可表明早期人肺腺癌裸鼠异位移植瘤的微血管灌注较晚期强，也间接反映肿瘤的早期微血管生成情况较好。反映微血管密度的CD34染色发现早期肿瘤的MVD比晚期肿瘤丰富，坏死区域的MVD明显低于非坏死区域，且7 d组、14 d组、28 d组的MVD逐渐降低。Pearson积矩相关显示MVD与PI成正相关，即PI越大肿瘤MVD越高。CD34免疫组化染色是反映微血管生成的“金标准”，有研究表明CD34染色所得MVD与超声造影参数成正相关，并证明超声造影时间信号曲线的PI可以间接反映微血管生成情况[14]，这与本研究结果相似。由于CD34测定MVD不能多次反复进行，且为有创检查，其在多个时间进行肿瘤血管生成监测及血管靶向药物疗效的评估存在一定限制，而超声造影可较好地弥补这一不足，因而对于检测肿瘤不同生长时期肿瘤血管生成以及血管靶向药物疗效的实时评估有极大的优势。
综上所述，超声造影对人肺腺癌微血管灌注特点的研究具有一定价值。超声灌注参数可以一定程度上反应肿瘤血管生成情况，早期肿瘤的微血管生成较晚期肿瘤好。虽然本实验只是对人肺腺癌异位移植瘤3个时间点的血管生成情况进行监测，但由此获得的人肺腺癌异位移植瘤血管生长趋势，可为临床抗血管靶向药物治疗肺腺癌提供一定指导作用。随着超声造影在肺癌领域的逐步运用，临床上可运用超声造影对肺癌患者血管生成情况进行检测，并使抗血管生成靶向药物疗效的实时评价成为可能。
引言
肺癌是全球发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。近年来，肺癌的诊疗水平有较大提高，但以外科手术为主的多学科综合治疗效果仍不理想，肺癌总的5年生存率仍然很低。随着肿瘤分子生物学及细胞生物学的发展，肺癌靶向治疗特别是以血管生成为靶点的血管靶向治疗发展迅速。对于血管靶向治疗的疗效，即治疗前后血管生成的变化，目前国内外仍然缺乏有效的评价手段。因此，借助生物建模等研究手段探索和建立更为有效的检查方法和检测指标，了解靶向治疗前后肿瘤血管生成情况的变化，对肿瘤靶向治疗的疗效评价具有重要意义。超声造影(contrast enhanced ultrasonography，CEUS)是一种理想的实质组织微循环血流灌注定量技术，与计算机断层扫描(computed tomography，CT)及磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技术比较，具有无创、无辐射、可多次重复、实时成像等显著优点，已被运用于多种器官及肿瘤组织的微循环血流灌注研究[1]。
本研究采用超声造影系统获得人肺腺癌异位移植瘤血流灌注图像，通过图像后处理获得超声造影时间信号曲线及灌注参数，以了解肺癌治疗前不同时间点的微血管生长及演变趋势。
1 材料与方法
1.1 人肺腺癌裸鼠异位移植瘤模型建立
选用4周龄、15～20 g重BALB/C裸鼠作为载体，将人肺腺癌A549细胞悬液按接种量5×106个细胞/只注入裸鼠背部皮下，鼓起皮丘为接种成功。最终接种成功瘤鼠21只，每两天观察一次肿瘤生长情况。接种成功后的瘤鼠平均分为3组，分别于3个不同时间点即7 d、14 d及28 d进行超声造影检查。
1.2 超声造影检查
使用Philips iU22 unit (Philips，Bothell，WA，USA)超声系统，首先常规定位肿瘤并观察肿瘤的形态及大小；将粉末状管腔内造影剂(Tianxia，HuZhou，China)用0.9%生理盐水按照1 000:50比例进行稀释，以2.5 μL/g从鼠尾静脉在2～4 s内注入造影剂，同时通过超声探头采集人肺腺癌异位移植瘤血流灌注动态图像。
1.3 免疫组化染色及微血管密度计数方法
进行超声造影检查后，取肿瘤组织进行CD34免疫组化染色。在光学显微镜(100×)下观察每张组织切片，并人工计数肿瘤的微血管密度(Microvessel density，MVD)。MVD计数参照Weidnerd等计数方法，以染成棕黄色的内细胞簇或单个内皮细胞作为一根可计数血管，位置不同的血管内皮细胞均作为独立血管进行计数；与邻近微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织成分不相连、标记为棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇均作为1根可计数血管。每张切片在光镜(100×)下寻找MVD最高的区域，即为热点，然后在光学显微镜(200×)下对热点进行血管计数，记录6个视野内的微血管数，计算平均数值，取平均值作为该例标本的MVD数值[2-3]。
1.4 超声造影图像分析
采用离线软件Q lab(Philips medical system，Bothell，WA，USA)对不同时间点的肺癌血流灌注图像进行分析，选取肿瘤区域勾画感兴趣区，避开瘤鼠自身组织，采用y(t)=A×(t-t0)×exp(-alpha×(t-t0))+C进行曲线拟合，拟合过程中同时对运动干扰进行校正，最后软件自动计算时间信号曲线如图 1所示，得到血流灌注参数包括上升时间(Rise time，RT)、峰值强度(Peak intensity，PI)、曲线下面积(Area under the curve，AUC)。接下来，采用同样的拟合曲线，在灌注图片上同时勾画坏死区域及非坏死区域两个感兴趣区，获得坏死与非坏死区域灌注参数，其中坏死区域定义为超声造影图像上呈灌注缺损的区域[4]。
图1
人肺腺癌异位移植瘤CEUS图像及其时间信号曲线
Figure1.
CEUS of lung adenocarcinoma xenograft in nude mouse
1.5 统计分析
所有测量值以均数±标准差(
2 结果
2.1 不同时间点超声造影及MVD结果
所有瘤鼠均成功进行超声造影检查。通过后处理软件获得所有肿瘤超声灌注时间信号曲线及其参数，如表 1所示。14 d及28 d组肿瘤组织内出现不同程度坏死。不同时间组肿瘤的灌注参数均存在统计学差异(P < 0.05)。7 d组肿瘤的AUC和PI最高[分别为(1 011.39±125.15) dBs和(18.94±7.50) dB]。随着肿瘤生长，瘤体发生不同程度坏死，14 d及28 d组的AUC [(955.52±368.72) dBs vs. (315.00±178.53) dBs，P=0.003]及PI [(15.26±3.90) dB vs. (10.94±3.65) dB，P=0.008]值逐渐降低。随着肿瘤生长，其RT逐渐延长(P < 0.05)。CD34免疫组化染色可显示肿瘤不同时间点的微血管生成情况如图 2所示，并获得不同时期肿瘤的MVD。MVD结果显示，28 d组的MVD最小，而7d组MVD最大(P < 0.05)，如表 1所示。
表1
人肺腺癌异位移植瘤不同时间点CEUS时间信号曲线参数及MVD结果
Table1.
Time-intensity curve parameters of CEUS and MVD of lung adenocarcinoma xenograft model.
图2
7 d组、14 d组及28 d组CD34免疫组化染色(200×)。箭头：肿瘤内血管
Figure2.
CD34 immunohistochemisty stain for MVD. Arrow shows the microvessels of tumor
2.2 坏死区域与非坏死区域超声造影结果比较
在坏死的肿瘤中，肉眼观察非坏死区域的超声显影信号较强，而坏死区域成灌注缺损；两个区域时间信号曲线比较发现，坏死区域的时间信号曲线比非坏死区域低，如图 3所示。时间信号参数显示非坏死部分的AUC[(328.19±182.45) dBs vs.(172.13±114.63) dBs，P=0.039]及PI[(17.08±3.38) dB vs. (11.03±6.55) dB，P=0.029]值高于坏死部分。通过计数肿瘤的MVD发现，CD34染色发现坏死肿瘤的MVD较非坏死肿瘤低[(7.50±3.44)条vs.(12.44±5.74)条，P=0.034]。
图3
坏死肿瘤的超声灌注成像。红色：坏死区域；黄色：非坏死区域
Figure3.
Contrast enhanced ultrasonography of lung adenocarcinoma xenograft nude mouse with necrosis. Red:necrotic part; Yellow:Non-necrotic part
2.3 肿瘤MVD与PI值得相关性分析
Pearson积矩相关性分析显示肿瘤的MVD与PI成正相关(r=0.668，P=0.008)，如图 4所示。
图4
MVD与PI Pearson积矩相关性分析
Figure4.
Pearson correlation between MVD and PI
3 讨论
超声造影运用微泡造影剂进行组织显像，可通过测定组织的信号强度直接反应其微血管灌注量，是测定肿瘤微血管灌注程度常用方法。超声后处理软件通过逻辑算法获得时间信号曲线，可反应组织的微血管灌注状态。时间信号曲线参数包括PI、RT及AUC[5]。PI为肿瘤显影最明显时的信号强度，可由肿瘤血管床中的微泡总量反应。RT指从肿瘤开始显影到显影达最大值所需时间。AUC是时间信号曲线下的面积[6]。
肺癌是一种富血供恶性肿瘤。有研究表明，恶性肿瘤的生长、侵袭性及转移与肿瘤血管生成密切相关。虽然肺癌的诊断多依赖CT检查，但是超声对于靠近胸膜的周围型肺癌及合并肺不张的中央型肺癌具有良好的诊断价值[4, 7-8]。与常规的CT检查相比，超声造影是一种无辐射、可重复性强、能实时显像的辅助检查技术，且超声造影剂不进入组织间隙，能较好反应肿瘤的微血管生长情况，已广泛运用于胃肠道、肝脏、乳腺及甲状腺肿瘤等恶性肿瘤的科研及临床诊断[9-13]。本研究采用超声造影技术探究不同时间点人肺腺癌裸鼠异位移植瘤微血管灌注情况，从而获得人肺腺癌裸鼠异位移植瘤中微血管随时间的生长趋势，为临床抗血管药物治疗提供前期研究基础。本研究发现7d组人肺腺癌裸鼠异位移植瘤的PI及AUC最大，随着肿瘤的生长及坏死，14 d及28 d组肿瘤的PI和AUC逐渐降低，而RT呈逐渐延长趋势。在有坏死的肿瘤中，肉眼观察，非坏死区域的超声显影信号较强，根据量化结果表明坏死区域的PI和AUC均低于非坏死区域。本研究结果可表明早期人肺腺癌裸鼠异位移植瘤的微血管灌注较晚期强，也间接反映肿瘤的早期微血管生成情况较好。反映微血管密度的CD34染色发现早期肿瘤的MVD比晚期肿瘤丰富，坏死区域的MVD明显低于非坏死区域，且7 d组、14 d组、28 d组的MVD逐渐降低。Pearson积矩相关显示MVD与PI成正相关，即PI越大肿瘤MVD越高。CD34免疫组化染色是反映微血管生成的“金标准”，有研究表明CD34染色所得MVD与超声造影参数成正相关，并证明超声造影时间信号曲线的PI可以间接反映微血管生成情况[14]，这与本研究结果相似。由于CD34测定MVD不能多次反复进行，且为有创检查，其在多个时间进行肿瘤血管生成监测及血管靶向药物疗效的评估存在一定限制，而超声造影可较好地弥补这一不足，因而对于检测肿瘤不同生长时期肿瘤血管生成以及血管靶向药物疗效的实时评估有极大的优势。
综上所述，超声造影对人肺腺癌微血管灌注特点的研究具有一定价值。超声灌注参数可以一定程度上反应肿瘤血管生成情况，早期肿瘤的微血管生成较晚期肿瘤好。虽然本实验只是对人肺腺癌异位移植瘤3个时间点的血管生成情况进行监测，但由此获得的人肺腺癌异位移植瘤血管生长趋势，可为临床抗血管靶向药物治疗肺腺癌提供一定指导作用。随着超声造影在肺癌领域的逐步运用，临床上可运用超声造影对肺癌患者血管生成情况进行检测，并使抗血管生成靶向药物疗效的实时评价成为可能。
