分光光度法是对新药、植入性生物医用材料及血液制品进行溶血性评价的常用简便方法, 是针对血红蛋白特征吸收峰进行的定量分析, 因此, 当评价体系对血红蛋白构象产生影响时, 检测波长的正确选择就显得至关重要。本文通过对在细胞培养液、磷酸盐缓冲液(PBS)、生理盐水和库血保存液四种体系中红细胞溶血的上清进行连续波长扫描及其特征峰随时间变化的研究, 提出如下检测波长的选择方案:细胞培养液中, 4 h内检测选415 nm, 4~72 h选408 nm附近; PBS中, 4 h内选541、577或415 nm, 4~72 h选541、577或406 nm附近; 生理盐水中, 4 h内选414 nm, 4~72 h选405 nm附近, 12 h内还可选541或577 nm; 库血保存液中, 72 h内选415、540或576 nm。
引用本文： 张红, 苏宝倡, 叶迅达, 罗曼. 溶血性评价体系中分光光度法检测波长的选择. 生物医学工程学杂志, 2016, 33(2): 368-372. doi: 10.7507/1001-5515.20160062 复制
引言
溶血是血红蛋白从膜破损的红细胞中释放到胞外进入介质的过程[1]。溶血性评价在药物研发、生物医用材料筛选及研制等方面均有重要应用[2]。游离血红蛋白测定是血站全血及成分血质量控制的重要检查项目[3]。在临床上，溶血性疾病和输血反应均需通过检测游离血红蛋白来辅助诊疗[4]。溶血试验检测游离血红蛋白通常是在一定介质体系中进行的，细胞培养液、PBS和生理盐水是体外实验常用的介质；库血保存液是血液制品的储存介质，直接影响血液质量[5]。
溶血试验目前已发展有多种方法，包括分光光度法、氰化高铁法、联苯胺法等。氰化高铁法所用试剂稳定性差，有剧毒，对环境有一定的污染[6]。联苯胺法灵敏度不高，且联苯胺试剂有致癌性，对操作者健康存在潜在威胁[7]。分光光度法在测定游离血红蛋白时比化学法更为安全、简便、准确和精密。该方法用于血红蛋白定量是基于氧合血红蛋白在415、541和576 nm存在吸收峰[8]。其中在415 nm附近的峰为Soret带[9]，表征血红蛋白四级结构的信息[10]；在541和576 nm附近的两个峰分别为β带和α带[11]，表征血红蛋白亚基及血红素口袋[12]的相关信息。在不同的介质体系中由于溶剂组分和环境条件差异可能会对血红蛋白特征吸收峰产生不同程度影响；血红蛋白结构的稳定性不仅与体系组成有关，还可能与其在体系中存在的时间长短有关。然而，虽然有多种检测波长在溶血试验中被选用，但血红蛋白在不同介质体系中持续作用后特征峰变化的比较研究未见报道。本文研究了在细胞培养液、PBS、生理盐水及库血保存液四种体系中红细胞溶血上清的连续吸收光谱特征峰及其随时间变化的规律，为溶血试验检测波长和时间的选择提供依据。
1 材料与方法
1.1 血液样本来源
新鲜血液(来自健康青年志愿者)；库血(来自广州血液中心)
1.2 仪器与试剂
紫外-可见分光光度计(TU-1810系列，北京普析通用仪器有限责任公司)；CO2培养箱(Thermo Scientific HERAcell i系列)；恒温培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；台式离心机(80-2型号，常州市华普达教学仪器有限公司)。
生理盐水(华仁药业股份有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为7.2～7.4)；RPMI-1640粉末(Gibco公司)；胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技有限公司)；青链霉素(Gibco公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 血红蛋白溶液的制备
抗凝管采集20 mL新鲜血液，离心(1 500 r/min，5 min)后取下层富集红细胞，按1:10(v/v)加入三蒸水使其充分溶血，再次离心(3 500 r/min，5 min)后取上层液即为血红蛋白溶液。
1.3.2 细胞培养液体系中血红蛋白的连续吸收光谱扫描
分别取新鲜人血清、胎牛血清、RPMI-1640培养液(不含胎牛血清)和RPMI-1640完全培养液(含10%胎牛血清)到微量比色皿中，用紫外-可见分光光度计进行连续波长扫描(光度方式：Abs，扫描范围：400～800 nm，间隔：1 nm，下同)。
取1.3.1制得的血红蛋白溶液2 mL，按1:5(v/v)与RPMI-1640完全培养液混合均匀后，分装到7个5 mL规格的培养瓶中，每瓶1 mL，置于CO2培养箱(37℃，0.5% CO2)中孵育。分别在第4、12、24、36、48、60、72小时取出其中一个培养瓶，对样液进行连续波长扫描。
1.3.3 PBS体系中血红蛋白的连续吸收光谱扫描
取1.3.1制得的血红蛋白溶液2 mL，按1:5(v/v)与PBS混合均匀后，分装到8个培养瓶中，每瓶1 mL，置于25℃恒温培养箱中孵育。分别在第0、4、12、24、36、48、60、72小时取出其中一个培养瓶，对样液进行连续波长扫描。
1.3.4 生理盐水体系中血红蛋白的连续吸收光谱扫描
方法同1.3.3，将PBS替换成生理盐水。
1.3.5 库血保存液体系中血红蛋白的连续吸收光谱扫描
从血袋中取30 mL库血，离心(1 500 r/min，5 min)后取上层清液到8个培养瓶中，每瓶1 mL，置于25℃恒温培养箱中孵育。光谱扫描方法同1.3.3。
2 结果
2.1 细胞培养液中随时间延长血红蛋白Soret带蓝移且峰强增加，α、β带消失
RPMI-1640完全培养液是体外实验常用的细胞培养液，其主要成分为RPMI-1640培养液和胎牛血清，胎牛血清与人血清吸收光谱相近，如图 1所示，波长为415 nm的强峰是人血清和胎牛血清吸收光谱中共同的特征吸收峰，在人血清的吸收谱线(1)中还有明显可见的α带和β带，而胎牛血清因其含牛血红蛋白不高于0.02%[7]，故α带和β带峰强很弱，并且在RPMI-1640完全培养液中胎牛血清由于RPMI-1640培养液的稀释作用，其Soret带的峰强也十分微弱。而559 nm吸收峰显然为RPMI-1640培养液和RPMI-1640完全培养液的共同特征峰，此峰为细胞培养液中指示剂酚红的特征吸收峰[13]，值得注意的是其恰好介于540～576 nm之间，这会对α和β带吸收峰检测造成干扰，因此在细胞培养液体系进行溶血检测时不宜选择α带和β带，而应选择Soret带。
图1
人血清、胎牛血清、RPMI-1640培养液和RPMI-1640完全培养液的吸收光谱图
Figure1.
Absorption spectra of human serum, FBS, RPMI-1640 medium and RPMI-1640 complete medium
RPMI-1640完全培养液中血红蛋白吸收光谱如图 2所示，随孵育时间推移，血红蛋白Soret带有蓝移变化趋势：4 h时由初始的415 nm位移至412 nm，36 h时移至410 nm，48 h时又移至408 nm；随后一直稳定至72 h。在Soret带蓝移发生的同时，其峰强也随之增加(I412 < I410 < I408)。这是由于随时间延长，血红蛋白变性逐渐递增[14]，铁自旋增加[15]，使得血红蛋白亚基间相互作用增强，四级结构变得致密，故导致Soret带强度增加。细胞培养箱中高CO2浓度致环境pH值变低(559 nm峰强随时间延长下降)，血红素口袋结构改变(被559 nm峰掩盖的α、β带强度下降)。综上所述，在细胞培养液体系中由于血红蛋白的构象随时间和环境变化而改变，所以检测血红蛋白时应选择合适的波长，即4 h之内应选择415 nm附近波长，在4～72 h应选择408 nm附近波长。
图2
RPMI-1640完全培养液中不同时间血红蛋白吸收光谱图
1: 4 h; 2: 12 h; 3: 24 h; 4: 36 h; 5: 48 h; 6: 60 h; 7: 72 h
Figure2. Absorption spectra of hemoglobin in RPMI-1640 complete medium at different times1: 4 h; 2: 12 h; 3: 24 h; 4: 36 h; 5: 48 h; 6: 60 h; 7: 72 h
2.2 PBS体系中随时间延长血红蛋白Soret带蓝移，α、β带峰强下降
PBS体系的血红蛋白吸收光谱如图 3所示，在0～4 h内吸收谱线呈现氧合血红蛋白的三个典型特征吸收峰，即415、541和577 nm，提示此时氧合血红蛋白的构象正常。在12 h时Soret带蓝移至408 nm且峰强下降，24～60 h时移至407 nm，72 h时移至406 nm，这是由于在体外室温条件下，由于温度、离子强度等的改变使血红蛋白的四级结构发生了明显变化，血红蛋白亚基解聚增加，亚基自身的三级构象也发生明显崩解[16]，具体表现为Soret带发生蓝移的同时峰强发生下降，氧合血红蛋白的β和α带在0～4 h时峰强相近，在12 h时峰强显著下降，峰形由陡变缓，两峰相对强度也发生改变，这种变化的差异可能是由于血红蛋白亚基一级结构的不同所致。
图3
PBS体系中不同时间血红蛋白Soret带和α、β带吸收光谱图
1: 0 h; 2: 4 h; 3: 12 h; 4: 24 h; 5: 36 h; 6: 48 h; 7: 60 h; 8: 72 h
Figure3. Absorption spectra of hemoglobin Soret andα, βband in PBS system at different times1: 0 h; 2: 4 h; 3: 12 h; 4: 24 h; 5: 36 h; 6: 48 h; 7: 60 h; 8: 72 h
综上所述，体外PBS体系检测血红蛋白，在4 h之内可选择415、541或577 nm，其中选择415 nm检测更加灵敏且能反映血红蛋白四级结构的整体信息；在4～72 h则不能选择415 nm，而应选择406 nm附近波长，此时选择541或577 nm检测会更加稳定，而且若选择541 nm应在72 h之前进行检测。
2.3 生理盐水体系中随时间延长血红蛋白Soret带蓝移，α、β带峰强显著降低
生理盐水体系的血红蛋白吸收光谱如图 4所示，与PSB情况类似，在0～4 h谱线存在三个吸收峰，分别在414、541和577 nm。在4 h时Soret带即由414 nm蓝移至413 nm，较PBS组提早，在12 h时Soret带发生明显蓝移，并且随着时间的延长峰强度呈下降趋势，72 h时Soret带移至405 nm。由图 4可知，在24 h时α带和β带的峰形即消失，这是由于在生理盐水体系中同样存在着血红蛋白四级构象、亚基三级结构以及血红素口袋疏水微环境的变化，并且这种变化比PBS组更加显著，说明生理盐水的单纯盐溶液体系对血红蛋白结构的保护作用不及磷酸盐缓冲体系。
图4
生理盐水体系中不同时间血红蛋白Soret带和α、β带吸收光谱图
1: 0 h; 2: 4 h; 3: 12 h; 4: 24 h; 5: 36 h; 6: 48 h; 7: 60 h; 8: 72 h
Figure4. Absorption spectra of hemoglobin Soret andα, βband in physiological saline system at different times1: 0 h; 2: 4 h; 3: 12 h; 4: 24 h; 5: 36 h; 6: 48 h; 7: 60 h; 8: 72 h
综上所述，建议体外溶血实验运用PBS体系，若在生理盐水体系检测血红蛋白，在4 h内可选择414、541或577 nm；在4～72 h选择405 nm附近波长；12 h之内还可选择541或577 nm。
2.4 库血保存液体系中血红蛋白3个特征峰随时间延长不发生位移但峰强下降
库血保存液体系的血红蛋白吸收光谱如图 5所示，在0～72 h范围内，谱线在415、540和576 nm处的三个吸收峰均十分明显，其强度随时间延长逐渐降低，与PBS和生理盐水组不同的是，随着时间的延长血红蛋白Soret带不发生蓝移，α带和β带的峰不发生由陡变缓的变化且两峰的相对强度也很稳定。这说明库血保存液对血红蛋白的构象具有显著的保护作用，但由于在离体的环境中，仍然存在着血红蛋白四聚体的解聚和三级结构的消失而导致峰强度下降。因此，在对库血上清进行血红蛋白检测时，72 h内可选择415 nm、540 nm或576 nm。
图5
库血保存液体系中不同时间血红蛋白吸收光谱图
Figure5.
Absorption spectra of hemoglobin in banked blood preservation solution system at different times
3 讨论
氧合血红蛋白在415、541和577 nm附近有特征吸收峰，吸收峰的位置和强度由血红蛋白构象及其卟啉铁自旋状态决定，而其所处介质体系的离子强度、pH值和温度又会对这些因素产生影响啉铁自旋状态决定，而其所处介质体系的离子强度、pH值和温度又会对这些因素产生影响[17]。正常人血红蛋白为四聚体结构，在一定体外介质条件下，血红蛋白四聚体能被解聚成二聚体[18]，乃至单体。一部分亚基之间发生断裂，同时由于pH值可能偏离生理条件范围，导致维系血红蛋白亚基三级结构的部分化学键断裂，造成α和β带吸收峰的强度下降。pH值的变化也会使Soret带发生偏移[19]。在PBS体系下，磷酸盐的缓冲体系对血红蛋白的结构产生一定的保护作用，其效果优于生理盐水的单纯盐溶液体系，而库血保存液中不仅含有枸橼酸与枸橼酸钠形成缓冲对来调节和稳定pH值，而且葡萄糖、腺嘌呤、磷酸二氢钠、甘露醇等的加入更有利于血红蛋白维持其原有的四级构象和三级结构。在细胞培养液体系下，胎牛血清中牛血红蛋白含量不高于0.02%，且经过培养液的稀释，其在415 nm处的峰强度非常弱，因此在溶血试验时对待测血红蛋白的干扰很小，可将完全培养液作为对照组进行检测。然而由于指示剂酚红在559 nm处存在较强的吸收峰，对血红蛋白α、β带的吸收峰检测造成干扰，此时溶血试验应选Soret带的吸收峰，若要检测α和β带吸收峰需用不含酚红的培养基。在4种体系中Soret带和α、β带峰强度均表现出随时间延长而降低的趋势，这可能是由于体外条件下部分血红蛋白的四级结构解聚和亚基三级结构的消失所致。在Soret带和α、β带均可选的情况下，选择Soret带可反映血红蛋白整体四级结构的信息，其变化较α、β带更为显著，可提示蛋白质是否变性，而α、β带则更多地反映血红蛋白三级结构和血红素口袋的信息。另外，由于实验所用的仪器设备和检测条件差异，血红蛋白的吸收峰波长也会略有不同，因此在溶血实验之前建议进行预实验对血红蛋白溶液进行全波长扫描，以确定所用条件下血红蛋白的吸收峰。
引言
溶血是血红蛋白从膜破损的红细胞中释放到胞外进入介质的过程[1]。溶血性评价在药物研发、生物医用材料筛选及研制等方面均有重要应用[2]。游离血红蛋白测定是血站全血及成分血质量控制的重要检查项目[3]。在临床上，溶血性疾病和输血反应均需通过检测游离血红蛋白来辅助诊疗[4]。溶血试验检测游离血红蛋白通常是在一定介质体系中进行的，细胞培养液、PBS和生理盐水是体外实验常用的介质；库血保存液是血液制品的储存介质，直接影响血液质量[5]。
溶血试验目前已发展有多种方法，包括分光光度法、氰化高铁法、联苯胺法等。氰化高铁法所用试剂稳定性差，有剧毒，对环境有一定的污染[6]。联苯胺法灵敏度不高，且联苯胺试剂有致癌性，对操作者健康存在潜在威胁[7]。分光光度法在测定游离血红蛋白时比化学法更为安全、简便、准确和精密。该方法用于血红蛋白定量是基于氧合血红蛋白在415、541和576 nm存在吸收峰[8]。其中在415 nm附近的峰为Soret带[9]，表征血红蛋白四级结构的信息[10]；在541和576 nm附近的两个峰分别为β带和α带[11]，表征血红蛋白亚基及血红素口袋[12]的相关信息。在不同的介质体系中由于溶剂组分和环境条件差异可能会对血红蛋白特征吸收峰产生不同程度影响；血红蛋白结构的稳定性不仅与体系组成有关，还可能与其在体系中存在的时间长短有关。然而，虽然有多种检测波长在溶血试验中被选用，但血红蛋白在不同介质体系中持续作用后特征峰变化的比较研究未见报道。本文研究了在细胞培养液、PBS、生理盐水及库血保存液四种体系中红细胞溶血上清的连续吸收光谱特征峰及其随时间变化的规律，为溶血试验检测波长和时间的选择提供依据。
1 材料与方法
1.1 血液样本来源
新鲜血液(来自健康青年志愿者)；库血(来自广州血液中心)
1.2 仪器与试剂
紫外-可见分光光度计(TU-1810系列，北京普析通用仪器有限责任公司)；CO2培养箱(Thermo Scientific HERAcell i系列)；恒温培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；台式离心机(80-2型号，常州市华普达教学仪器有限公司)。
生理盐水(华仁药业股份有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为7.2～7.4)；RPMI-1640粉末(Gibco公司)；胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技有限公司)；青链霉素(Gibco公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 血红蛋白溶液的制备
抗凝管采集20 mL新鲜血液，离心(1 500 r/min，5 min)后取下层富集红细胞，按1:10(v/v)加入三蒸水使其充分溶血，再次离心(3 500 r/min，5 min)后取上层液即为血红蛋白溶液。
1.3.2 细胞培养液体系中血红蛋白的连续吸收光谱扫描
分别取新鲜人血清、胎牛血清、RPMI-1640培养液(不含胎牛血清)和RPMI-1640完全培养液(含10%胎牛血清)到微量比色皿中，用紫外-可见分光光度计进行连续波长扫描(光度方式：Abs，扫描范围：400～800 nm，间隔：1 nm，下同)。
取1.3.1制得的血红蛋白溶液2 mL，按1:5(v/v)与RPMI-1640完全培养液混合均匀后，分装到7个5 mL规格的培养瓶中，每瓶1 mL，置于CO2培养箱(37℃，0.5% CO2)中孵育。分别在第4、12、24、36、48、60、72小时取出其中一个培养瓶，对样液进行连续波长扫描。
1.3.3 PBS体系中血红蛋白的连续吸收光谱扫描
取1.3.1制得的血红蛋白溶液2 mL，按1:5(v/v)与PBS混合均匀后，分装到8个培养瓶中，每瓶1 mL，置于25℃恒温培养箱中孵育。分别在第0、4、12、24、36、48、60、72小时取出其中一个培养瓶，对样液进行连续波长扫描。
1.3.4 生理盐水体系中血红蛋白的连续吸收光谱扫描
方法同1.3.3，将PBS替换成生理盐水。
1.3.5 库血保存液体系中血红蛋白的连续吸收光谱扫描
从血袋中取30 mL库血，离心(1 500 r/min，5 min)后取上层清液到8个培养瓶中，每瓶1 mL，置于25℃恒温培养箱中孵育。光谱扫描方法同1.3.3。
2 结果
2.1 细胞培养液中随时间延长血红蛋白Soret带蓝移且峰强增加，α、β带消失
RPMI-1640完全培养液是体外实验常用的细胞培养液，其主要成分为RPMI-1640培养液和胎牛血清，胎牛血清与人血清吸收光谱相近，如图 1所示，波长为415 nm的强峰是人血清和胎牛血清吸收光谱中共同的特征吸收峰，在人血清的吸收谱线(1)中还有明显可见的α带和β带，而胎牛血清因其含牛血红蛋白不高于0.02%[7]，故α带和β带峰强很弱，并且在RPMI-1640完全培养液中胎牛血清由于RPMI-1640培养液的稀释作用，其Soret带的峰强也十分微弱。而559 nm吸收峰显然为RPMI-1640培养液和RPMI-1640完全培养液的共同特征峰，此峰为细胞培养液中指示剂酚红的特征吸收峰[13]，值得注意的是其恰好介于540～576 nm之间，这会对α和β带吸收峰检测造成干扰，因此在细胞培养液体系进行溶血检测时不宜选择α带和β带，而应选择Soret带。
图1
人血清、胎牛血清、RPMI-1640培养液和RPMI-1640完全培养液的吸收光谱图
Figure1.
Absorption spectra of human serum, FBS, RPMI-1640 medium and RPMI-1640 complete medium
RPMI-1640完全培养液中血红蛋白吸收光谱如图 2所示，随孵育时间推移，血红蛋白Soret带有蓝移变化趋势：4 h时由初始的415 nm位移至412 nm，36 h时移至410 nm，48 h时又移至408 nm；随后一直稳定至72 h。在Soret带蓝移发生的同时，其峰强也随之增加(I412 < I410 < I408)。这是由于随时间延长，血红蛋白变性逐渐递增[14]，铁自旋增加[15]，使得血红蛋白亚基间相互作用增强，四级结构变得致密，故导致Soret带强度增加。细胞培养箱中高CO2浓度致环境pH值变低(559 nm峰强随时间延长下降)，血红素口袋结构改变(被559 nm峰掩盖的α、β带强度下降)。综上所述，在细胞培养液体系中由于血红蛋白的构象随时间和环境变化而改变，所以检测血红蛋白时应选择合适的波长，即4 h之内应选择415 nm附近波长，在4～72 h应选择408 nm附近波长。
图2
RPMI-1640完全培养液中不同时间血红蛋白吸收光谱图
1: 4 h; 2: 12 h; 3: 24 h; 4: 36 h; 5: 48 h; 6: 60 h; 7: 72 h
Figure2. Absorption spectra of hemoglobin in RPMI-1640 complete medium at different times1: 4 h; 2: 12 h; 3: 24 h; 4: 36 h; 5: 48 h; 6: 60 h; 7: 72 h
2.2 PBS体系中随时间延长血红蛋白Soret带蓝移，α、β带峰强下降
PBS体系的血红蛋白吸收光谱如图 3所示，在0～4 h内吸收谱线呈现氧合血红蛋白的三个典型特征吸收峰，即415、541和577 nm，提示此时氧合血红蛋白的构象正常。在12 h时Soret带蓝移至408 nm且峰强下降，24～60 h时移至407 nm，72 h时移至406 nm，这是由于在体外室温条件下，由于温度、离子强度等的改变使血红蛋白的四级结构发生了明显变化，血红蛋白亚基解聚增加，亚基自身的三级构象也发生明显崩解[16]，具体表现为Soret带发生蓝移的同时峰强发生下降，氧合血红蛋白的β和α带在0～4 h时峰强相近，在12 h时峰强显著下降，峰形由陡变缓，两峰相对强度也发生改变，这种变化的差异可能是由于血红蛋白亚基一级结构的不同所致。
图3
PBS体系中不同时间血红蛋白Soret带和α、β带吸收光谱图
1: 0 h; 2: 4 h; 3: 12 h; 4: 24 h; 5: 36 h; 6: 48 h; 7: 60 h; 8: 72 h
Figure3. Absorption spectra of hemoglobin Soret andα, βband in PBS system at different times1: 0 h; 2: 4 h; 3: 12 h; 4: 24 h; 5: 36 h; 6: 48 h; 7: 60 h; 8: 72 h
综上所述，体外PBS体系检测血红蛋白，在4 h之内可选择415、541或577 nm，其中选择415 nm检测更加灵敏且能反映血红蛋白四级结构的整体信息；在4～72 h则不能选择415 nm，而应选择406 nm附近波长，此时选择541或577 nm检测会更加稳定，而且若选择541 nm应在72 h之前进行检测。
2.3 生理盐水体系中随时间延长血红蛋白Soret带蓝移，α、β带峰强显著降低
生理盐水体系的血红蛋白吸收光谱如图 4所示，与PSB情况类似，在0～4 h谱线存在三个吸收峰，分别在414、541和577 nm。在4 h时Soret带即由414 nm蓝移至413 nm，较PBS组提早，在12 h时Soret带发生明显蓝移，并且随着时间的延长峰强度呈下降趋势，72 h时Soret带移至405 nm。由图 4可知，在24 h时α带和β带的峰形即消失，这是由于在生理盐水体系中同样存在着血红蛋白四级构象、亚基三级结构以及血红素口袋疏水微环境的变化，并且这种变化比PBS组更加显著，说明生理盐水的单纯盐溶液体系对血红蛋白结构的保护作用不及磷酸盐缓冲体系。
图4
生理盐水体系中不同时间血红蛋白Soret带和α、β带吸收光谱图
1: 0 h; 2: 4 h; 3: 12 h; 4: 24 h; 5: 36 h; 6: 48 h; 7: 60 h; 8: 72 h
Figure4. Absorption spectra of hemoglobin Soret andα, βband in physiological saline system at different times1: 0 h; 2: 4 h; 3: 12 h; 4: 24 h; 5: 36 h; 6: 48 h; 7: 60 h; 8: 72 h
综上所述，建议体外溶血实验运用PBS体系，若在生理盐水体系检测血红蛋白，在4 h内可选择414、541或577 nm；在4～72 h选择405 nm附近波长；12 h之内还可选择541或577 nm。
2.4 库血保存液体系中血红蛋白3个特征峰随时间延长不发生位移但峰强下降
库血保存液体系的血红蛋白吸收光谱如图 5所示，在0～72 h范围内，谱线在415、540和576 nm处的三个吸收峰均十分明显，其强度随时间延长逐渐降低，与PBS和生理盐水组不同的是，随着时间的延长血红蛋白Soret带不发生蓝移，α带和β带的峰不发生由陡变缓的变化且两峰的相对强度也很稳定。这说明库血保存液对血红蛋白的构象具有显著的保护作用，但由于在离体的环境中，仍然存在着血红蛋白四聚体的解聚和三级结构的消失而导致峰强度下降。因此，在对库血上清进行血红蛋白检测时，72 h内可选择415 nm、540 nm或576 nm。
图5
库血保存液体系中不同时间血红蛋白吸收光谱图
Figure5.
Absorption spectra of hemoglobin in banked blood preservation solution system at different times
3 讨论
氧合血红蛋白在415、541和577 nm附近有特征吸收峰，吸收峰的位置和强度由血红蛋白构象及其卟啉铁自旋状态决定，而其所处介质体系的离子强度、pH值和温度又会对这些因素产生影响啉铁自旋状态决定，而其所处介质体系的离子强度、pH值和温度又会对这些因素产生影响[17]。正常人血红蛋白为四聚体结构，在一定体外介质条件下，血红蛋白四聚体能被解聚成二聚体[18]，乃至单体。一部分亚基之间发生断裂，同时由于pH值可能偏离生理条件范围，导致维系血红蛋白亚基三级结构的部分化学键断裂，造成α和β带吸收峰的强度下降。pH值的变化也会使Soret带发生偏移[19]。在PBS体系下，磷酸盐的缓冲体系对血红蛋白的结构产生一定的保护作用，其效果优于生理盐水的单纯盐溶液体系，而库血保存液中不仅含有枸橼酸与枸橼酸钠形成缓冲对来调节和稳定pH值，而且葡萄糖、腺嘌呤、磷酸二氢钠、甘露醇等的加入更有利于血红蛋白维持其原有的四级构象和三级结构。在细胞培养液体系下，胎牛血清中牛血红蛋白含量不高于0.02%，且经过培养液的稀释，其在415 nm处的峰强度非常弱，因此在溶血试验时对待测血红蛋白的干扰很小，可将完全培养液作为对照组进行检测。然而由于指示剂酚红在559 nm处存在较强的吸收峰，对血红蛋白α、β带的吸收峰检测造成干扰，此时溶血试验应选Soret带的吸收峰，若要检测α和β带吸收峰需用不含酚红的培养基。在4种体系中Soret带和α、β带峰强度均表现出随时间延长而降低的趋势，这可能是由于体外条件下部分血红蛋白的四级结构解聚和亚基三级结构的消失所致。在Soret带和α、β带均可选的情况下，选择Soret带可反映血红蛋白整体四级结构的信息，其变化较α、β带更为显著，可提示蛋白质是否变性，而α、β带则更多地反映血红蛋白三级结构和血红素口袋的信息。另外，由于实验所用的仪器设备和检测条件差异，血红蛋白的吸收峰波长也会略有不同，因此在溶血实验之前建议进行预实验对血红蛋白溶液进行全波长扫描，以确定所用条件下血红蛋白的吸收峰。
