人类可移植器官短缺的问题一直未能解决, 体外再造人体器官的探索也一直没有停止。目前人们已可以在体外通过立体培养方法得到有功能的器官或是类器官。不同于传统的平面培养, 立体培养可以使细胞与周围细胞或组织环境产生联系, 形成立体的、相互紧密连接并通信协作的组织结构, 进而共同发育形成器官。这为人类器官的体外再造提供了新思路。本文对现有的立体培养方案进行了分类叙述、分析及总结, 并对下一步的发展进行了展望。
引用本文： 杜潇, 李君, 周晓囡, 吴嫣爽, 雷蕾. 立体培养技术制造器官. 生物医学工程学杂志, 2016, 33(2): 382-387. doi: 10.7507/1001-5515.20160065 复制
引言
相较于传统平面培养方式(即在培养皿等平面容器内进行的体外培养方式)，立体培养主要是指能够在物理空间中自发地向平面外的纵轴进行增殖与生长的细胞培养方式，并在此种模式下培育出立体的器官或是类器官。组织中的细胞之间不再仅仅是物理接触关系，而是形成更紧密的细胞间生物通信，相互影响、诱导、反馈[1]，协作式发育并形成具有功能的器官。传统培养模式可以在体外培养近乎所有已知类型的细胞，但不能建立有效的细胞间通信，因而未能向器官体外培养更近一步。现有的立体培养模式已经能够培养出具有功能的器官，然而不同立体培养方法都有各自的针对性与特点。例如：细胞外基质立体培养方法是目前唯一培养出功能较健全的器官的方法；无支架立体培养模式可以培养出芽器官或是类器官；人工材料支架的培养方式应用前景广泛，在创伤及骨修复方面有较好效果[2]。在此我们对立体培养方案进行总结和分析。
1 细胞外基质支架立体培养模式
人体内的每种器官中都有能支持器官形态的生物支架[3]，其主要构成是细胞外基质[4]。利用去细胞化技术去除器官内的细胞并保留其生物支架，再将细胞注入支架内进行立体培养可达到再生器官的目的。这就是细胞外基质支架进行立体培养的基本思路，如图 1所示。
图1
生物支架立体培养基本思路示意图
Figure1.
Schematic of decellularized and repopulation strategy
1.1 器官支架制取
目前制取特定器官的支架需要依靠同种器官进行去细胞化操作。去细胞化的方法大致可分为物理法、酶消化法和化学法三种[5]。由于大多数用去细胞化培养器官的培养装置都具有灌流功能，所以直接通过化学制剂灌注的方法比较常见。化学制剂中非离子性洗涤剂聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)以及离子性洗涤剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfonate, SDS)交替使用效果较好[6]，尽管不同方案所采用的方法差距很大，但是都可以达到去除细胞和纯化细胞外基质的效果，并且取得的生物支架通常也会经过机械强度测试以及显微镜下观察等方法来保证支架的质量[6]。目前取得的支架涵盖心、肺、肝、肾等主要器官，然而实现器官再生的仅有大鼠器官支架，大型动物器官的支架尚无成功再生器官的案例[7-8]。
1.2 细胞灌注培养
由于去除细胞的生物支架保留了原器官的所有结构，所以细胞灌注通常利用培养装置从原器官支架的动脉注入并从静脉口将溢出的液体回收进行再灌注。而灌注的细胞种类则需根据支架来源器官进行选择以确保细胞能够在“正确”的结构中行使自身的功能。由于细胞外基质与种植的细胞之间未见明显的排斥反应，所以可以实现将异体细胞或是异种细胞在支架内进行种植[6]。在大鼠肺脏与心脏支架上已经有种植人源细胞的案例，且可以得到有功能的再生器官。
灌注细胞通常采用包含目的器官体细胞在内的几种相关细胞共同灌注(如表 1所示)，而细胞灌注液则为对应细胞的培养液，需要与灌注细胞种类相匹配，同时也会加入一些辅助因子参与成体祖细胞的诱导，以使主功能细胞可以更快地建立细胞与细胞以及细胞与支架间的连接，形成具有整体功能的再生器官。也有直接将大鼠肾脏细胞外基质支架嫁接到同种大鼠肾脏上，利用宿主肾脏细胞爬附增殖的方式[9]，这种再生方式耗时更长(达56天)，但是在后续培养上却相对简单。
表1
部分器官支架灌注混合细胞案例
Table1.
Cases of repopulation with mixed-cells perfusion
1.3 离体培养器官装置
器官培养装置依据器官不同会有各自的特殊设计，但是基本会满足这样几个条件：①培养装置通常是完全密闭的培养空间，以达到医用无菌环境。特殊器官如肺脏需要与空气接触时则会用抗生素进行抑菌。②有器官内的血管网循环通路和器官外的培养液循环通路，两个通路共同完成组织培养液循环工作。③配备必要的检测设备及数据采集系统[14]。比如Langendorff离体心脏灌流系统[15]，它的双循环通道不仅可连接离体心脏动、静脉口，通道上的检测调节阀还可以实时调节流量模拟体内循环，配套的信息采集系统则可记录心脏的收缩功能等指标。更多离体心脏监测技术都是在这个系统基础之上进行设计，如可同时监测心电及pH值等多项指标的心脏金属外膜检测网等[16]。肺脏则需要有血管及气管两套循环通道，后期进行的气血交换检测也要在肺脏立体培养的装置中进行[12]。
1.4 目前的成果与限制
利用大鼠肺脏细胞外基质支架再生的肺脏器官是目前唯一能够回植同种动物体内并行使基本功能的再生器官[13]，在替换宿主半只肺脏的情形下可以保证同步呼吸频率以及气血交换，维持血内氧饱和度。鼠和人异种细胞再植的心脏器官尽管能够保证心脏所有细胞同频率跳动[11]，但是力度较弱，尚不能完成正常泵血功能，具体原因还有待进一步探讨。肾脏[9]与肝脏[6]的再植实验是建立在将支架嫁接在宿主同种器官上实现的，尽管完成了修复器官功能的目的，尚不能确认能否用于脏器衰竭的治疗。
细胞外基质的应用因为未出现免疫排斥现象，为人类的器官再生开启了一条新思路，如在神经损伤修复、皮肤修复，甚至是肌肉修复上都可以采用人源或是猪等大型动物源的组织细胞外基质来促进功能修复。但是在重要脏器，尤其是针对脏器衰竭的问题，细胞外基质是否能直接用于修复，暂没有数据支持。在脏器立体培养的研究中所采用的器官大部分来源于大鼠，但是这种体积的器官对于人体来说不足以胜任，从大型动物脏器获取生物支架进行再生也尚无有效数据，如何突破细胞外基质支架进行的离体器官再生所面临的体积限制，是今后研究需要深入探索的方向。
2 无支架立体培养模式
无支架培养模式主要是利用细胞培养微环境的变化诱导细胞自发地形成组织或是类器官。随着诱导多潜能干细胞技术的出现[17]，获得多潜能干细胞途径丰富且高效。干细胞定向诱导为特定的成体细胞或祖细胞技术方案日渐成熟[1]，这为细胞诱导立体培养技术提供了良好的基础。目前利用细胞诱导方式培养出的类器官主要集中在外胚层和内胚层衍生器官。
2.1 外胚层器官诱导
利用无血清培养基可以将多潜能干细胞聚合培养形成拟胚体，并可以向三个胚层分化，但是更倾向于分化成外胚层[18]，目前所有的外胚层诱导器官案例大多是采用拟胚体诱导方法。Lancaster等[18]利用拟胚体诱导方法培育了脑样类器官，在得到拟胚体后用添加了N2因子的培养液将其诱导成神经外胚层，继而在生物效应器中用分化培养液进行立体培养，30 d后得到表层分布着包括前脑、海马体、背侧皮层和前额叶等结构的脑样类器官，并在此基础上取小脑症患者细胞诱导的多潜能干细胞用相同方法模拟了小脑畸形的病理特征。Koehler等[19]则在拟胚体形成定型外胚层后用骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)因子将其诱导成非神经外胚层，继而在成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)诱导成前原基外胚层后自发发育成内耳。Suga等[20]用高细胞量的拟胚体添加BMP4因子模拟了头外胚层发育，并最终体外培育了小鼠垂体，在回植体内后可以使切除原垂体的小鼠恢复垂体分泌功能。类似的其他器官组织还有视杯与视网膜[21]等。
2.2 内胚层器官诱导
内胚层器官不如拟胚体形成的外胚层自发分化性强，基本都采用了将细胞诱导至成体祖细胞阶段后再进行立体培养的方式[1]，但是方法则依器官不同而各不相同。如Takebe等[22]利用细胞共培养的方式，将人源的肝脏细胞与脐静脉内皮细胞和间充质干细胞按5:5:1比例进行共培养，培育了能够自发形成立体结构的肝芽组织，将其植入小鼠脑内可在48 h内形成组织血管网并融入宿主血循环网内，成活并能够行使肝脏分泌功能。McCracken等[23]所培养的人胃芽组织是在将多潜能干细胞诱导为前肠细胞后利用人工基底膜特制的液滴内进行立体培养。Watson等[24]培养的肠芽组织则是将诱导的小肠内皮细胞移植在肾被膜下培育。
2.3 限制与发展
细胞诱导模式基本思路是模拟器官发育过程，因而对立体培养过程中的诱导环境要求很高，任何一个细胞诱导立体培养案例都会有一个非常复杂而精确的诱导方案。诱导因子及天数都很明确，出现细微差错就可能将细胞命运诱导至另一途径(如图 2所示)。也是因为器官发育过程复杂，诸多因素并未完全清楚，故而所得都是器官的初级阶段如类器官或是芽器官，大多并不能用于器官修复或替代，但是作为疾病模型探索其他方向的研究则意义重大，如遗传学、新药开发等。所以，对细胞命运、器官命运控制因素的探索极具前景。
图2
细胞诱导立体培养外胚层和内胚层类器官模式图
NOG:骨形成蛋白抑制蛋白(antagonist noggin); RA：视黄酸(retinoic acid); EGF：表皮生长因子(epidermal growth factor); GSK-3i：糖原合成酶激酶抑制剂(glycogen synthase kinase-3 inhibitors); TGFβi：转化生长因子β抑制剂(transforming growth factorβinhibitors); BMPi：骨形成蛋白抑制剂(bone morphogenetic protein inhibitors)
Figure2. Schematic of endodermal and ectodermal tissues generation from embryonic stem cells/induced pluripotent stem cells in 3D culture3 人工生物材料应用于立体培养
人工生物材料有成分明确、结构可控的优点，已被广泛应用于再生医学的研究。有学者认为凝胶材料对细胞立体培养的微环境起到了类似细胞外基质的作用[25]，其不仅可以在生长空间上对细胞给予支持[26]，同时也可以在凝胶培养中动态地更改环境因素以操控细胞的命运走向[27]。在创伤修复中凝胶材料与细胞外基质的应用都非常有效[28]，但是在立体培养中凝胶支架的应用还在初步探索中。曲晓丽等[29]用凝胶支架培养肝脏组织，可以见到肝细胞聚团倾向，但没有最终得到离体肝脏。凝胶支架不会像去细胞化的细胞外基质一样保留器官的所有微结构，那么如何确保凝胶中的细胞之间以及细胞与凝胶之间建立正确的联系？近些年兴起的立体打印技术在生物应用的发展开启了新的思路[30]。比如可将细胞与相应的诱导体系凝胶混合喷涂，而将配套的其他细胞叠加于其涂层之上，人为地制造细胞与环境间的相互关联[31]。未来凝胶支架的应用能否开启器官立体培养的新途径值得期待。
4 展望
器官和组织的体外立体培养是一个系统而复杂的工程。我们对细胞培养的观念从以前的给予细胞生长营养环境要转变成给予细胞生长发育的微生态，要增强细胞与细胞之间、细胞与环境之间的互动与“交流”，引导细胞向组织形态演变。这就需要给予细胞立体生长的支撑结构，以及诱导细胞正确分化的微环境。当我们用这样的观点去执行器官体外诱导培养的时候，细胞共培养就不再是一个方法，而是一个基本理念，目前不仅在去细胞化方法中得到很好的应用，在人工凝胶支架培养中依然非常有效。相应地，细胞外基质对于细胞成长组织化的微环境起到举足轻重的作用，如何将细胞外基质的功能与人工凝胶支架不受体积限制的特点相融合，以解决目前器官生物支架来源体积限制的问题，是一个值得探索的问题。
另一方面，器官与组织的体外培养面临无法模拟生物体内血循环式的整体营养代谢问题，尽管通过去细胞化生物支架再生的器官可以利用其原有的血管系统进行营养液的灌注与更换，但是尚无法在大型动物器官中实现，这就与供给人用移植器官的最终目的尚有距离。而人为细胞共建的芽器官或类器官由于并没有生成有效的血管系统而无法加以利用，也就意味着如果组织过大就无法供给组织中心细胞营养，无法实现组织的体外培育。而生物体内发育来的器官则有这样天然的血管系统优势。如目前利用人源肝脏细胞注入肝损伤小鼠体内，利用新注入细胞替代受损肝脏细胞来“再生”人源肝脏的思路[32]，就很好地利用了体内优势，相关技术替代率可达80%以上。如果将同样的思路在大型动物上试用，是否可以替代式地得到与人体器官体积近似的人源器官呢？由于大型动物器官质量较大所需细胞数多，是否也可以将立体培养技术结合应用于体内器官替代以得到人源器官呢？这些问题需要我们进一步的研究。
生命工程不是用单一方法来解决所有的问题，而是将诸多的方法相结合来解决某一个问题，在人类器官再造的问题上也应如此。器官发育过程中关键因子的研究保障了由干细胞诱导成各种器官成体细胞的可能性，多样的立体培养方案保证了细胞向组织和芽器官的过渡，是否能利用大型动物体内培育的方法得到真正可用于移植的人类器官值得期待。未来医学的解决方案一定是融合的方案。希望在科技发展迅速的今天，器官再生能取得新突破。
引言
相较于传统平面培养方式(即在培养皿等平面容器内进行的体外培养方式)，立体培养主要是指能够在物理空间中自发地向平面外的纵轴进行增殖与生长的细胞培养方式，并在此种模式下培育出立体的器官或是类器官。组织中的细胞之间不再仅仅是物理接触关系，而是形成更紧密的细胞间生物通信，相互影响、诱导、反馈[1]，协作式发育并形成具有功能的器官。传统培养模式可以在体外培养近乎所有已知类型的细胞，但不能建立有效的细胞间通信，因而未能向器官体外培养更近一步。现有的立体培养模式已经能够培养出具有功能的器官，然而不同立体培养方法都有各自的针对性与特点。例如：细胞外基质立体培养方法是目前唯一培养出功能较健全的器官的方法；无支架立体培养模式可以培养出芽器官或是类器官；人工材料支架的培养方式应用前景广泛，在创伤及骨修复方面有较好效果[2]。在此我们对立体培养方案进行总结和分析。
1 细胞外基质支架立体培养模式
人体内的每种器官中都有能支持器官形态的生物支架[3]，其主要构成是细胞外基质[4]。利用去细胞化技术去除器官内的细胞并保留其生物支架，再将细胞注入支架内进行立体培养可达到再生器官的目的。这就是细胞外基质支架进行立体培养的基本思路，如图 1所示。
图1
生物支架立体培养基本思路示意图
Figure1.
Schematic of decellularized and repopulation strategy
1.1 器官支架制取
目前制取特定器官的支架需要依靠同种器官进行去细胞化操作。去细胞化的方法大致可分为物理法、酶消化法和化学法三种[5]。由于大多数用去细胞化培养器官的培养装置都具有灌流功能，所以直接通过化学制剂灌注的方法比较常见。化学制剂中非离子性洗涤剂聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)以及离子性洗涤剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfonate, SDS)交替使用效果较好[6]，尽管不同方案所采用的方法差距很大，但是都可以达到去除细胞和纯化细胞外基质的效果，并且取得的生物支架通常也会经过机械强度测试以及显微镜下观察等方法来保证支架的质量[6]。目前取得的支架涵盖心、肺、肝、肾等主要器官，然而实现器官再生的仅有大鼠器官支架，大型动物器官的支架尚无成功再生器官的案例[7-8]。
1.2 细胞灌注培养
由于去除细胞的生物支架保留了原器官的所有结构，所以细胞灌注通常利用培养装置从原器官支架的动脉注入并从静脉口将溢出的液体回收进行再灌注。而灌注的细胞种类则需根据支架来源器官进行选择以确保细胞能够在“正确”的结构中行使自身的功能。由于细胞外基质与种植的细胞之间未见明显的排斥反应，所以可以实现将异体细胞或是异种细胞在支架内进行种植[6]。在大鼠肺脏与心脏支架上已经有种植人源细胞的案例，且可以得到有功能的再生器官。
灌注细胞通常采用包含目的器官体细胞在内的几种相关细胞共同灌注(如表 1所示)，而细胞灌注液则为对应细胞的培养液，需要与灌注细胞种类相匹配，同时也会加入一些辅助因子参与成体祖细胞的诱导，以使主功能细胞可以更快地建立细胞与细胞以及细胞与支架间的连接，形成具有整体功能的再生器官。也有直接将大鼠肾脏细胞外基质支架嫁接到同种大鼠肾脏上，利用宿主肾脏细胞爬附增殖的方式[9]，这种再生方式耗时更长(达56天)，但是在后续培养上却相对简单。
表1
部分器官支架灌注混合细胞案例
Table1.
Cases of repopulation with mixed-cells perfusion
1.3 离体培养器官装置
器官培养装置依据器官不同会有各自的特殊设计，但是基本会满足这样几个条件：①培养装置通常是完全密闭的培养空间，以达到医用无菌环境。特殊器官如肺脏需要与空气接触时则会用抗生素进行抑菌。②有器官内的血管网循环通路和器官外的培养液循环通路，两个通路共同完成组织培养液循环工作。③配备必要的检测设备及数据采集系统[14]。比如Langendorff离体心脏灌流系统[15]，它的双循环通道不仅可连接离体心脏动、静脉口，通道上的检测调节阀还可以实时调节流量模拟体内循环，配套的信息采集系统则可记录心脏的收缩功能等指标。更多离体心脏监测技术都是在这个系统基础之上进行设计，如可同时监测心电及pH值等多项指标的心脏金属外膜检测网等[16]。肺脏则需要有血管及气管两套循环通道，后期进行的气血交换检测也要在肺脏立体培养的装置中进行[12]。
1.4 目前的成果与限制
利用大鼠肺脏细胞外基质支架再生的肺脏器官是目前唯一能够回植同种动物体内并行使基本功能的再生器官[13]，在替换宿主半只肺脏的情形下可以保证同步呼吸频率以及气血交换，维持血内氧饱和度。鼠和人异种细胞再植的心脏器官尽管能够保证心脏所有细胞同频率跳动[11]，但是力度较弱，尚不能完成正常泵血功能，具体原因还有待进一步探讨。肾脏[9]与肝脏[6]的再植实验是建立在将支架嫁接在宿主同种器官上实现的，尽管完成了修复器官功能的目的，尚不能确认能否用于脏器衰竭的治疗。
细胞外基质的应用因为未出现免疫排斥现象，为人类的器官再生开启了一条新思路，如在神经损伤修复、皮肤修复，甚至是肌肉修复上都可以采用人源或是猪等大型动物源的组织细胞外基质来促进功能修复。但是在重要脏器，尤其是针对脏器衰竭的问题，细胞外基质是否能直接用于修复，暂没有数据支持。在脏器立体培养的研究中所采用的器官大部分来源于大鼠，但是这种体积的器官对于人体来说不足以胜任，从大型动物脏器获取生物支架进行再生也尚无有效数据，如何突破细胞外基质支架进行的离体器官再生所面临的体积限制，是今后研究需要深入探索的方向。
2 无支架立体培养模式
无支架培养模式主要是利用细胞培养微环境的变化诱导细胞自发地形成组织或是类器官。随着诱导多潜能干细胞技术的出现[17]，获得多潜能干细胞途径丰富且高效。干细胞定向诱导为特定的成体细胞或祖细胞技术方案日渐成熟[1]，这为细胞诱导立体培养技术提供了良好的基础。目前利用细胞诱导方式培养出的类器官主要集中在外胚层和内胚层衍生器官。
2.1 外胚层器官诱导
利用无血清培养基可以将多潜能干细胞聚合培养形成拟胚体，并可以向三个胚层分化，但是更倾向于分化成外胚层[18]，目前所有的外胚层诱导器官案例大多是采用拟胚体诱导方法。Lancaster等[18]利用拟胚体诱导方法培育了脑样类器官，在得到拟胚体后用添加了N2因子的培养液将其诱导成神经外胚层，继而在生物效应器中用分化培养液进行立体培养，30 d后得到表层分布着包括前脑、海马体、背侧皮层和前额叶等结构的脑样类器官，并在此基础上取小脑症患者细胞诱导的多潜能干细胞用相同方法模拟了小脑畸形的病理特征。Koehler等[19]则在拟胚体形成定型外胚层后用骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)因子将其诱导成非神经外胚层，继而在成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)诱导成前原基外胚层后自发发育成内耳。Suga等[20]用高细胞量的拟胚体添加BMP4因子模拟了头外胚层发育，并最终体外培育了小鼠垂体，在回植体内后可以使切除原垂体的小鼠恢复垂体分泌功能。类似的其他器官组织还有视杯与视网膜[21]等。
2.2 内胚层器官诱导
内胚层器官不如拟胚体形成的外胚层自发分化性强，基本都采用了将细胞诱导至成体祖细胞阶段后再进行立体培养的方式[1]，但是方法则依器官不同而各不相同。如Takebe等[22]利用细胞共培养的方式，将人源的肝脏细胞与脐静脉内皮细胞和间充质干细胞按5:5:1比例进行共培养，培育了能够自发形成立体结构的肝芽组织，将其植入小鼠脑内可在48 h内形成组织血管网并融入宿主血循环网内，成活并能够行使肝脏分泌功能。McCracken等[23]所培养的人胃芽组织是在将多潜能干细胞诱导为前肠细胞后利用人工基底膜特制的液滴内进行立体培养。Watson等[24]培养的肠芽组织则是将诱导的小肠内皮细胞移植在肾被膜下培育。
2.3 限制与发展
细胞诱导模式基本思路是模拟器官发育过程，因而对立体培养过程中的诱导环境要求很高，任何一个细胞诱导立体培养案例都会有一个非常复杂而精确的诱导方案。诱导因子及天数都很明确，出现细微差错就可能将细胞命运诱导至另一途径(如图 2所示)。也是因为器官发育过程复杂，诸多因素并未完全清楚，故而所得都是器官的初级阶段如类器官或是芽器官，大多并不能用于器官修复或替代，但是作为疾病模型探索其他方向的研究则意义重大，如遗传学、新药开发等。所以，对细胞命运、器官命运控制因素的探索极具前景。
图2
细胞诱导立体培养外胚层和内胚层类器官模式图
NOG:骨形成蛋白抑制蛋白(antagonist noggin); RA：视黄酸(retinoic acid); EGF：表皮生长因子(epidermal growth factor); GSK-3i：糖原合成酶激酶抑制剂(glycogen synthase kinase-3 inhibitors); TGFβi：转化生长因子β抑制剂(transforming growth factorβinhibitors); BMPi：骨形成蛋白抑制剂(bone morphogenetic protein inhibitors)
Figure2. Schematic of endodermal and ectodermal tissues generation from embryonic stem cells/induced pluripotent stem cells in 3D culture3 人工生物材料应用于立体培养
人工生物材料有成分明确、结构可控的优点，已被广泛应用于再生医学的研究。有学者认为凝胶材料对细胞立体培养的微环境起到了类似细胞外基质的作用[25]，其不仅可以在生长空间上对细胞给予支持[26]，同时也可以在凝胶培养中动态地更改环境因素以操控细胞的命运走向[27]。在创伤修复中凝胶材料与细胞外基质的应用都非常有效[28]，但是在立体培养中凝胶支架的应用还在初步探索中。曲晓丽等[29]用凝胶支架培养肝脏组织，可以见到肝细胞聚团倾向，但没有最终得到离体肝脏。凝胶支架不会像去细胞化的细胞外基质一样保留器官的所有微结构，那么如何确保凝胶中的细胞之间以及细胞与凝胶之间建立正确的联系？近些年兴起的立体打印技术在生物应用的发展开启了新的思路[30]。比如可将细胞与相应的诱导体系凝胶混合喷涂，而将配套的其他细胞叠加于其涂层之上，人为地制造细胞与环境间的相互关联[31]。未来凝胶支架的应用能否开启器官立体培养的新途径值得期待。
4 展望
器官和组织的体外立体培养是一个系统而复杂的工程。我们对细胞培养的观念从以前的给予细胞生长营养环境要转变成给予细胞生长发育的微生态，要增强细胞与细胞之间、细胞与环境之间的互动与“交流”，引导细胞向组织形态演变。这就需要给予细胞立体生长的支撑结构，以及诱导细胞正确分化的微环境。当我们用这样的观点去执行器官体外诱导培养的时候，细胞共培养就不再是一个方法，而是一个基本理念，目前不仅在去细胞化方法中得到很好的应用，在人工凝胶支架培养中依然非常有效。相应地，细胞外基质对于细胞成长组织化的微环境起到举足轻重的作用，如何将细胞外基质的功能与人工凝胶支架不受体积限制的特点相融合，以解决目前器官生物支架来源体积限制的问题，是一个值得探索的问题。
另一方面，器官与组织的体外培养面临无法模拟生物体内血循环式的整体营养代谢问题，尽管通过去细胞化生物支架再生的器官可以利用其原有的血管系统进行营养液的灌注与更换，但是尚无法在大型动物器官中实现，这就与供给人用移植器官的最终目的尚有距离。而人为细胞共建的芽器官或类器官由于并没有生成有效的血管系统而无法加以利用，也就意味着如果组织过大就无法供给组织中心细胞营养，无法实现组织的体外培育。而生物体内发育来的器官则有这样天然的血管系统优势。如目前利用人源肝脏细胞注入肝损伤小鼠体内，利用新注入细胞替代受损肝脏细胞来“再生”人源肝脏的思路[32]，就很好地利用了体内优势，相关技术替代率可达80%以上。如果将同样的思路在大型动物上试用，是否可以替代式地得到与人体器官体积近似的人源器官呢？由于大型动物器官质量较大所需细胞数多，是否也可以将立体培养技术结合应用于体内器官替代以得到人源器官呢？这些问题需要我们进一步的研究。
生命工程不是用单一方法来解决所有的问题，而是将诸多的方法相结合来解决某一个问题，在人类器官再造的问题上也应如此。器官发育过程中关键因子的研究保障了由干细胞诱导成各种器官成体细胞的可能性，多样的立体培养方案保证了细胞向组织和芽器官的过渡，是否能利用大型动物体内培育的方法得到真正可用于移植的人类器官值得期待。未来医学的解决方案一定是融合的方案。希望在科技发展迅速的今天，器官再生能取得新突破。
