离子通道参与麻醉药的作用与不良反应机制，麻醉药对离子通道相关基因的转录和表达具有一定的调控作用。临床应用中，持续输注依托咪酯（etomidate）对机体造成的不利影响已受到关注，但其对离子通道基因表达的影响目前尚不清楚。本实验将水蚤持续暴露在250 μmol/L依托咪酯中240 min，观察水蚤心率、趋光行为、血糖在实验期间的变化及120个离子通道基因在实验结束时的表达情况。与空白对照组相比，250 μmol/L依托咪酯不会影响水蚤的心率、趋光行为和血糖浓度，定量PCR检测结果显示持续应用250 μmol/L依托咪酯处理240 min后会影响18个水蚤基因表达：其中2个基因表达上调，16个基因表达下调。本研究结果表明依托咪酯在转录水平影响多种离子通道基因的表达，而本文这种采用系统观察离子通道相关基因的转录改变的方法，有助于了解依托咪酯的药理作用机制。
引用本文： 胡安民, 江叶, 高鸿, 张伟义, 杜桂芝. 依托咪酯对水蚤离子通道基因表达的影响. 生物医学工程学杂志, 2016, 33(3): 488-492. doi: 10.7507/1001-5515.20160082 复制
引言
依托咪酯(etomidate)作为一线麻醉药物在临床中已广泛使用[1]。大量研究报道指出依托咪酯具有独特的药理学特点，比如：全麻诱导时对心血管功能影响较小，持续输注时可能抑制肾上腺皮质功能，同时增加危重症患者术后死亡率[2-5]，可见依托咪酯对机体的影响机制较为复杂。
药物稳态理论认为机体通过适应性变化来降低对外源性药物的反应[6]，即有可能机体在细胞水平上通过改变药物作用靶蛋白的表达来降低对药物的反应。麻醉药物能直接调节离子通道功能从而影响细胞兴奋性[7-9]，也能通过调节基因表达和蛋白合成的方式来可持续性调节机体功能[10]。
离子通道是贯穿细胞膜或质膜的大分子蛋白，通过选择性透过特定离子，使细胞对外界刺激作出快速反应。某些信号通路的通道蛋白受特定离子影响，可通过复杂的机制在转录水平上调节基因表达从而影响神经功能[11]。离子通道根据功能不同，可分为许多不同的超家族[12-13]。其中某些离子通道主要通过感受跨膜电压差进行通道的开闭，称为电压门控离子通道，包括：电压门控钾通道 (voltage-gated potassium channels,KV)、电压门控钙通道 (voltage-gated calcium channels,CaV)、电压门控钠通道 (voltage-gated sodium channels,NaV)、电压门控氯通道 (voltage-gated chlorine channels,ClC)。某些离子通道能结合特定物质达到通道的激活或失活，称为配体门控离子通道，比如：超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)、环核苷酸门控离子通道 (cyclic nucleotide-regulated ion channel,CNG)、谷氨酸门控离子通道 (glutamate-gated ion channels,iGluRs)、嘌呤受体 (purinergic receptor,P2XR)、乙酰胆碱能受体 (nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)、γ-氨基丁酸A受体 (gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha,GABAARs)、谷氨酸门控氯(glutamate-gated chloride,GluCl)通道、 组胺门控氯(histamine-gated chloride,HisCl) 通道、钙释放激活钙 (calcium release-activated calcium,CRAC) 通道、三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R)、兰尼碱受体(ryanodine receptor,RyR)以及经由钙激活的氯通道(Ca2+-activated Cl- channels,CLCA)。此外，还有某些离子通道既能感受电压变化也能被某些特定物质激活，比如瞬时感受器电位(transient receptor potential,TRP)通道超家族等。
离子通道在整个生物进化中是相对保守的[13]。本课题组曾经报道过水蚤离子通道种类和人类离子通道种类相似且相关结构域保守，而且其基因表达的改变与麻醉药作用机制相关[14]。因此系统观察水蚤离子通道相关基因的mRNA改变有助于了解依托咪酯的药理作用的分子机制。
根据以前的研究[2-5]，我们猜测小剂量依托咪酯即能影响机体器官功能和离子通道相关基因的表达。本实验将水蚤持续暴露在250 μmol/L依托咪酯中240 min，通过观察水蚤心率、 趋光行为、血糖在实验期间的变化及120个离子通道基因在实验结束时的表达情况来进一步了解依托咪酯作用机体的药理机制。
1 材料和方法
1.1 水蚤培养和药品准备
水蚤培养方法如文献[15]所述，在恒温 (20±1) ℃和可控光照周期 (16:8 h的光-暗周期)水缸内，用酵母菌和螺旋藻混合喂养水蚤。每天清晨更换1/5水量。实验选用第3代或第4代纯化的8～12 d的水蚤进行实验。实验方案遵守动物保护准则，经四川大学伦理委员会审核批准。
本课题组曾报道过依托咪酯对水蚤制动的EC50为667 μmol/L[15]，本次实验依托咪酯浓度为250 μmol/L。水蚤随机分为2组：对照组(C)和依托咪酯组(E)。对照组是将水蚤放入曝光自来水(pH 7.8，含食物)中处理240 min，依托咪酯组是将水蚤放入含250 μmol/L依托咪酯的曝光自来水(pH 7.8，含食物)中处理240 min。实验过程中对照组和处理组有着等量食物供给。
1.2 心率测定
水蚤的心率通过数字目镜的显微镜录像记录，然后用VitualDub-1.9.7 软件来计算心率[16]。
1.3 趋光性分析
趋光行为分析是基于Martins等[17]报道过的研究方法。实验选用紫外灯(120 V,60 W)在玻璃量杯(高20 cm，内径2.5 cm)上方垂直照射。对照组和处理组量杯内依次加入70 mL曝光自来水和70 mL含250 μmol/L依托咪酯的曝光自来水。为对趋光行为进行定量分析，将量杯溶液人为分为2个部分：第1部分为距上层液面14 cm区域；第2部分为距杯底2.5 cm区域。趋光系数则定义为第1部分水蚤数目占量杯中总水蚤数目的比例。趋光系数的范围为1(所有水蚤均在第1部分)到0(所有水蚤均在第2部分)之间。在持续紫外光照射期间，每次量杯中放入10只水蚤，间隔20 min目测计算1次趋光系数。
1.4 血糖测定
50只水蚤放在500 μL双蒸水中匀浆后，经5 000 rpm/min离心5 min后取出100 μL上清液。上清液选用葡萄糖检测试剂盒(GAGO-20,Sigma Aldrich)检测水蚤组织中葡萄糖浓度。
1.5 RNA提取、逆转录和多重PCR
总RNA提取、逆转录和PCR方法如文献[15]所述。每次从50只水蚤中分离、沉淀和纯化提取总RNA。选用PrimeScriptTM RT reagent Kit DRR037A (TaKaRa)逆转录cDNA。经本课题组实验已测定出的特异性水蚤离子通道引物[15]，观察药物对水蚤离子通道mRNA表达的影响。在iQ5 system (Bio-Rad) 中，选用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ KIT DRR081A (TaKaRa)进行扩增。每个反应体系均为20 μL，包含2 mL cDNA和0.8 μmol/L引物。反应条件包括3步：① 95 ℃激活DNA聚合酶30 s。② 重复反应40个循环，每个循环包括 95 ℃ (5 s),55 ℃ (30 s)和72 ℃ (30 s)。③ 从55 ℃升温至95 ℃，每升高0.5 ℃后检测荧光信号30 s。根据2-ΔΔCT理论进行数据分析[18]。 实时定量PCR(quantitative PCR,qPCR)实验数据均经过β-actin基因标准化后计算水蚤离子通道相关基因转录水平的相对表达。
1.6 统计分析
基因相对表达的结果用均数±标准差 (x±s)表示。实验数据来自独立的5次实验。心率、趋光系数和血糖用单因素方差分析统计。基因的相对表达选择配对t检验(n=5) 进行统计学分析。
2 结果
实验首先在依托咪酯处理10 min和240 min后2个时间点分别测定水蚤的心率，与对照组相比，依托咪酯组没有引起水蚤心率的改变；依托咪酯组处理240 min期间水蚤的趋光行为和对照组相似；在依托咪酯(250 μmol/L)处理10 min和240 min后2个时间点两组水蚤的血糖浓度没有改变，如图 1所示。
图1
依托咪酯对水蚤心率、趋光行为及血糖的影响
Figure1.
Effects of etomidate on heart rate,the phototactic behavior and blood glucose of Daphnia
依托咪酯 (250 μmol/L)处理240 min后，120个水蚤离子通道基因通过qPCR检测。依托咪酯影响18个水蚤基因表达，其中上调2个基因，下调16个基因，如图 2所示。上调基因包括：1个钾通道基因(shawl1) 和1个CNG通道基因(cngl)。下调基因包括：4个钾通道基因(shab、kcnq、twik和task6) ，2个电压门控钙通道基因(ca-alpha1d和tag-180) ，3个TRP通道基因(trp、trpm_1和trpml)，1个谷氨酸门控离子通道基因(kair2) ，1个γ-氨基丁酸A受体(rdl_1) ，1个DEG/ENaC通道基因(deg/enac-10) ，1个IP3R基因，1个RYR基因，2个钙激活的氯通道基因(clca2和clca7) 。依托咪酯不影响基因表达的离子通道包括：2TM钾通道、HCN通道、电压门控钠通道、NALCN通道(sodium-leak channel non-selective,NALCN)、双孔钙通道(two-pore calcium channel,TPC)、瞬时受体电位辣椒素亚型(transient receptor potential vanilloid type,TPRV)、瞬时受体电位通道香草酸亚型(transient receptor potential ankyrin type,TRPA)、非机械感受器电位C(no mechanoreceptor potential C,nompC)、AMPA受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor,AMPAR)、NMDA受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)、谷氨酸门控氯通道(glutamate-gated chloride ion channels,GluCl)、组胺门控氯通道(histamine-gated chloride,HisCl)、P2XR、钙释放激活钙通道(calcium release-activated calcium channel,ORAI)、电压门控氯离子通道(voltage-gated chloride channel,ClC)、细胞内氯通道(chloride intracellular channel,CLIC)、Bestrophin氯通道(bestrophin,BEST)、Tweety氯通道(tweey,TTYH)和Anoctamin氯通道(anoctamin,ANO)。
图2
依托咪酯对水蚤离子通道基因表达的影响
*
3 讨论
全麻药物可以通过调节离子通道基因的表达从而持续调节机体功能[10]。稳态理论指出机体可以通过改变蛋白功能或表达来降低药物的影响，最终产生药物耐受[6]。GABAARs在全身麻醉和药物耐受中扮演着重要角色[19]。依托咪酯能增强GABAAR抑制性电流同时延长通道开放的时间[20]。本课题组发现依托咪酯能使GABAARs亚基rdl_1基因表达降低，如图 2所示。rdl_1基因表达下降的现象在麻醉镇静药物咪唑安定和戊巴比妥作用后也会出现[14]。这种药物耐受的现象在依托咪酯作用阳离子通道后同样存在。Takahashi等[9]报道依托咪酯通过降低L-型钙通道动力学达到减少该通道开放的机率。我们发现依托咪酯下调L-型钙通道基因表达，包括有ca-alpha1d和tag-180，这一现象再次侧面印证机体可能通过调控某些离子通道的基因表达降低药物产生的影响。
依托咪酯对心血管系统、神经系统以及内分泌系统都会产生影响[1, 3, 20]，然而本次实验中依托咪酯没有改变水蚤心率，趋光行为和血糖浓度，我们认为这可能与药物浓度及处理时间有关。
由于缺乏特异性抗体试剂，本文没有进一步对已发生转录水平改变的离子通道进行蛋白质水平研究。机体在mRNA水平和蛋白质水平的调节存在密切相关性[21-22]，因此或许不会影响对结论的推断。
药物和机体的相互作用关系复杂，依托咪酯作用机体的报道尚有限，而临床研究更为受限。本课题组发现依托咪酯在转录水平影响多种离子通道基因的表达，而本实验中所检测的离子通道与依托咪酯相互关系的报道尚缺，比如KaiR2、TRP、TRPM、TRPML、IP3R、RyR及CLCA，这些离子通道与依托咪酯的作用关系有待进一步的研究。
总之，我们的实验研究表明持续小剂量依托咪酯仍能改变机体离子通道相关基因的表达，这也为以后大家进一步研究依托咪酯的药理作用机制提供帮助。
引言
依托咪酯(etomidate)作为一线麻醉药物在临床中已广泛使用[1]。大量研究报道指出依托咪酯具有独特的药理学特点，比如：全麻诱导时对心血管功能影响较小，持续输注时可能抑制肾上腺皮质功能，同时增加危重症患者术后死亡率[2-5]，可见依托咪酯对机体的影响机制较为复杂。
药物稳态理论认为机体通过适应性变化来降低对外源性药物的反应[6]，即有可能机体在细胞水平上通过改变药物作用靶蛋白的表达来降低对药物的反应。麻醉药物能直接调节离子通道功能从而影响细胞兴奋性[7-9]，也能通过调节基因表达和蛋白合成的方式来可持续性调节机体功能[10]。
离子通道是贯穿细胞膜或质膜的大分子蛋白，通过选择性透过特定离子，使细胞对外界刺激作出快速反应。某些信号通路的通道蛋白受特定离子影响，可通过复杂的机制在转录水平上调节基因表达从而影响神经功能[11]。离子通道根据功能不同，可分为许多不同的超家族[12-13]。其中某些离子通道主要通过感受跨膜电压差进行通道的开闭，称为电压门控离子通道，包括：电压门控钾通道 (voltage-gated potassium channels,KV)、电压门控钙通道 (voltage-gated calcium channels,CaV)、电压门控钠通道 (voltage-gated sodium channels,NaV)、电压门控氯通道 (voltage-gated chlorine channels,ClC)。某些离子通道能结合特定物质达到通道的激活或失活，称为配体门控离子通道，比如：超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)、环核苷酸门控离子通道 (cyclic nucleotide-regulated ion channel,CNG)、谷氨酸门控离子通道 (glutamate-gated ion channels,iGluRs)、嘌呤受体 (purinergic receptor,P2XR)、乙酰胆碱能受体 (nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)、γ-氨基丁酸A受体 (gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha,GABAARs)、谷氨酸门控氯(glutamate-gated chloride,GluCl)通道、 组胺门控氯(histamine-gated chloride,HisCl) 通道、钙释放激活钙 (calcium release-activated calcium,CRAC) 通道、三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R)、兰尼碱受体(ryanodine receptor,RyR)以及经由钙激活的氯通道(Ca2+-activated Cl- channels,CLCA)。此外，还有某些离子通道既能感受电压变化也能被某些特定物质激活，比如瞬时感受器电位(transient receptor potential,TRP)通道超家族等。
离子通道在整个生物进化中是相对保守的[13]。本课题组曾经报道过水蚤离子通道种类和人类离子通道种类相似且相关结构域保守，而且其基因表达的改变与麻醉药作用机制相关[14]。因此系统观察水蚤离子通道相关基因的mRNA改变有助于了解依托咪酯的药理作用的分子机制。
根据以前的研究[2-5]，我们猜测小剂量依托咪酯即能影响机体器官功能和离子通道相关基因的表达。本实验将水蚤持续暴露在250 μmol/L依托咪酯中240 min，通过观察水蚤心率、 趋光行为、血糖在实验期间的变化及120个离子通道基因在实验结束时的表达情况来进一步了解依托咪酯作用机体的药理机制。
1 材料和方法
1.1 水蚤培养和药品准备
水蚤培养方法如文献[15]所述，在恒温 (20±1) ℃和可控光照周期 (16:8 h的光-暗周期)水缸内，用酵母菌和螺旋藻混合喂养水蚤。每天清晨更换1/5水量。实验选用第3代或第4代纯化的8～12 d的水蚤进行实验。实验方案遵守动物保护准则，经四川大学伦理委员会审核批准。
本课题组曾报道过依托咪酯对水蚤制动的EC50为667 μmol/L[15]，本次实验依托咪酯浓度为250 μmol/L。水蚤随机分为2组：对照组(C)和依托咪酯组(E)。对照组是将水蚤放入曝光自来水(pH 7.8，含食物)中处理240 min，依托咪酯组是将水蚤放入含250 μmol/L依托咪酯的曝光自来水(pH 7.8，含食物)中处理240 min。实验过程中对照组和处理组有着等量食物供给。
1.2 心率测定
水蚤的心率通过数字目镜的显微镜录像记录，然后用VitualDub-1.9.7 软件来计算心率[16]。
1.3 趋光性分析
趋光行为分析是基于Martins等[17]报道过的研究方法。实验选用紫外灯(120 V,60 W)在玻璃量杯(高20 cm，内径2.5 cm)上方垂直照射。对照组和处理组量杯内依次加入70 mL曝光自来水和70 mL含250 μmol/L依托咪酯的曝光自来水。为对趋光行为进行定量分析，将量杯溶液人为分为2个部分：第1部分为距上层液面14 cm区域；第2部分为距杯底2.5 cm区域。趋光系数则定义为第1部分水蚤数目占量杯中总水蚤数目的比例。趋光系数的范围为1(所有水蚤均在第1部分)到0(所有水蚤均在第2部分)之间。在持续紫外光照射期间，每次量杯中放入10只水蚤，间隔20 min目测计算1次趋光系数。
1.4 血糖测定
50只水蚤放在500 μL双蒸水中匀浆后，经5 000 rpm/min离心5 min后取出100 μL上清液。上清液选用葡萄糖检测试剂盒(GAGO-20,Sigma Aldrich)检测水蚤组织中葡萄糖浓度。
1.5 RNA提取、逆转录和多重PCR
总RNA提取、逆转录和PCR方法如文献[15]所述。每次从50只水蚤中分离、沉淀和纯化提取总RNA。选用PrimeScriptTM RT reagent Kit DRR037A (TaKaRa)逆转录cDNA。经本课题组实验已测定出的特异性水蚤离子通道引物[15]，观察药物对水蚤离子通道mRNA表达的影响。在iQ5 system (Bio-Rad) 中，选用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ KIT DRR081A (TaKaRa)进行扩增。每个反应体系均为20 μL，包含2 mL cDNA和0.8 μmol/L引物。反应条件包括3步：① 95 ℃激活DNA聚合酶30 s。② 重复反应40个循环，每个循环包括 95 ℃ (5 s),55 ℃ (30 s)和72 ℃ (30 s)。③ 从55 ℃升温至95 ℃，每升高0.5 ℃后检测荧光信号30 s。根据2-ΔΔCT理论进行数据分析[18]。 实时定量PCR(quantitative PCR,qPCR)实验数据均经过β-actin基因标准化后计算水蚤离子通道相关基因转录水平的相对表达。
1.6 统计分析
基因相对表达的结果用均数±标准差 (x±s)表示。实验数据来自独立的5次实验。心率、趋光系数和血糖用单因素方差分析统计。基因的相对表达选择配对t检验(n=5) 进行统计学分析。
2 结果
实验首先在依托咪酯处理10 min和240 min后2个时间点分别测定水蚤的心率，与对照组相比，依托咪酯组没有引起水蚤心率的改变；依托咪酯组处理240 min期间水蚤的趋光行为和对照组相似；在依托咪酯(250 μmol/L)处理10 min和240 min后2个时间点两组水蚤的血糖浓度没有改变，如图 1所示。
图1
依托咪酯对水蚤心率、趋光行为及血糖的影响
Figure1.
Effects of etomidate on heart rate,the phototactic behavior and blood glucose of Daphnia
依托咪酯 (250 μmol/L)处理240 min后，120个水蚤离子通道基因通过qPCR检测。依托咪酯影响18个水蚤基因表达，其中上调2个基因，下调16个基因，如图 2所示。上调基因包括：1个钾通道基因(shawl1) 和1个CNG通道基因(cngl)。下调基因包括：4个钾通道基因(shab、kcnq、twik和task6) ，2个电压门控钙通道基因(ca-alpha1d和tag-180) ，3个TRP通道基因(trp、trpm_1和trpml)，1个谷氨酸门控离子通道基因(kair2) ，1个γ-氨基丁酸A受体(rdl_1) ，1个DEG/ENaC通道基因(deg/enac-10) ，1个IP3R基因，1个RYR基因，2个钙激活的氯通道基因(clca2和clca7) 。依托咪酯不影响基因表达的离子通道包括：2TM钾通道、HCN通道、电压门控钠通道、NALCN通道(sodium-leak channel non-selective,NALCN)、双孔钙通道(two-pore calcium channel,TPC)、瞬时受体电位辣椒素亚型(transient receptor potential vanilloid type,TPRV)、瞬时受体电位通道香草酸亚型(transient receptor potential ankyrin type,TRPA)、非机械感受器电位C(no mechanoreceptor potential C,nompC)、AMPA受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor,AMPAR)、NMDA受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)、谷氨酸门控氯通道(glutamate-gated chloride ion channels,GluCl)、组胺门控氯通道(histamine-gated chloride,HisCl)、P2XR、钙释放激活钙通道(calcium release-activated calcium channel,ORAI)、电压门控氯离子通道(voltage-gated chloride channel,ClC)、细胞内氯通道(chloride intracellular channel,CLIC)、Bestrophin氯通道(bestrophin,BEST)、Tweety氯通道(tweey,TTYH)和Anoctamin氯通道(anoctamin,ANO)。
图2
依托咪酯对水蚤离子通道基因表达的影响
*
3 讨论
全麻药物可以通过调节离子通道基因的表达从而持续调节机体功能[10]。稳态理论指出机体可以通过改变蛋白功能或表达来降低药物的影响，最终产生药物耐受[6]。GABAARs在全身麻醉和药物耐受中扮演着重要角色[19]。依托咪酯能增强GABAAR抑制性电流同时延长通道开放的时间[20]。本课题组发现依托咪酯能使GABAARs亚基rdl_1基因表达降低，如图 2所示。rdl_1基因表达下降的现象在麻醉镇静药物咪唑安定和戊巴比妥作用后也会出现[14]。这种药物耐受的现象在依托咪酯作用阳离子通道后同样存在。Takahashi等[9]报道依托咪酯通过降低L-型钙通道动力学达到减少该通道开放的机率。我们发现依托咪酯下调L-型钙通道基因表达，包括有ca-alpha1d和tag-180，这一现象再次侧面印证机体可能通过调控某些离子通道的基因表达降低药物产生的影响。
依托咪酯对心血管系统、神经系统以及内分泌系统都会产生影响[1, 3, 20]，然而本次实验中依托咪酯没有改变水蚤心率，趋光行为和血糖浓度，我们认为这可能与药物浓度及处理时间有关。
由于缺乏特异性抗体试剂，本文没有进一步对已发生转录水平改变的离子通道进行蛋白质水平研究。机体在mRNA水平和蛋白质水平的调节存在密切相关性[21-22]，因此或许不会影响对结论的推断。
药物和机体的相互作用关系复杂，依托咪酯作用机体的报道尚有限，而临床研究更为受限。本课题组发现依托咪酯在转录水平影响多种离子通道基因的表达，而本实验中所检测的离子通道与依托咪酯相互关系的报道尚缺，比如KaiR2、TRP、TRPM、TRPML、IP3R、RyR及CLCA，这些离子通道与依托咪酯的作用关系有待进一步的研究。
总之，我们的实验研究表明持续小剂量依托咪酯仍能改变机体离子通道相关基因的表达，这也为以后大家进一步研究依托咪酯的药理作用机制提供帮助。
