流动室堵塞是流式细胞仪使用中常见的问题，可造成检测误差或检测失败。本文根据流动聚焦原理，分析了流动室堵塞时的压力变化情况，据此提出了通过检测样本流压力升高判断流动室堵塞，并利用液体反冲疏通被堵塞流动室的方法，设计并搭建了实验系统。实验表明，该方法可以有效解决流动室堵塞问题。
引用本文： 王海军, 郭阳宽, 祝连庆, 孟晓辰. 流式细胞仪液流自洁系统设计. 生物医学工程学杂志, 2016, 33(3): 570-574. doi: 10.7507/1001-5515.20160095 复制
引言
流式细胞仪是基于流式细胞术原理对单细胞或微颗粒进行定量分析的仪器，具有检测速度快、准确性好、精度高等优点[1-3]。流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、信号收集与转换系统、分析系统等组成[4]。其中液流系统的作用是将含有待测细胞或微颗粒的样本液与不含细胞或微颗粒的缓冲液即鞘液按照一定的压力比注入到流动室中，利用液流聚焦原理使样本液中的细胞或微颗粒依次通过流动室检测区域。 由于样本液中可能有血液和荧光试剂的反应物，也可能有采血过程中带入的棉签丝、皮肤组织及细胞碎片等杂物，容易导致系统流动不畅甚至堵塞，以致于两种溶液不能进行聚焦作用，无法获得稳定的样本液层流，进一步导致散射光及荧光检测信号都会出现失真，从而产生错误的临床诊断信息，可能出现误诊等医疗事故[5]。
流式细胞液流系统堵塞是目前亟待解决的问题，通用做法是在鞘液回路中增加过滤器和压力开关进行报警，一旦发生堵塞，需要停机、拆机、人工使用注射器回吸等方式进行排堵[6]。这种方法存在成本高、效率低以及可能会产生二次污染等问题。 本文研究了堵塞问题并提出了解决方案。在流式细胞仪原有的液流系统的基础上设计了自洁系统液路，通过对管路内的压力进行实时监测，可判断堵塞问题并及时报警、自动清洗液路以保证仪器的正常工作，提高了液流系统的可靠性。
1 流式细胞仪堵塞的原理分析
流式细胞仪原理如图 1所示。利用稳定的液流系统将鞘液和样本液按照一定的压力比压入流动室中，形成稳定的单细胞层流，在检测区域，用激光垂直照射单细胞层流激发产生荧光信号和散射光信号[7-9]。分别会被90°方向的光电倍增管(photomultiplier,PMT)和激光前方的光电二极管接收，并将光学信号转换为电信号，对电信号进行处理转换成数字信号传输到计算机进行数据分析和存储。
图1
流式细胞仪原理图
Figure1.
Schematic diagram of flow cytometry
其中液流系统包括流动室、泵组、电磁阀、调压阀、压力传感器、过滤器等。由于整个液流系统管路的直径以及流动室鞘液入口直径均在1.5~2.5 mm之间，而为了实现“聚焦”形成稳定的单细胞层流，流动室检测区通径设计得很小，一般在0.1~0.4 mm[10]。 液流中的杂物在聚焦过程中由于流动室缩径会引起“涡流”现象，从而在窄小的喷嘴出口处形成堵塞。
2 液流自洁系统设计
2.1 流动室堵塞的压力检测原理
流动室由样本液入口、鞘液入口和喷嘴等组成，通常用石英、光学玻璃、特殊金属等稳定的材料制作而成。流动室液流聚焦原理如图 2所示。
图2
流动室液流聚焦原理图
Figure2.
Schematic diagram of hydrodynamic focus in flow cell
流动室内的样本管和鞘液管呈共轴圆柱环式布局结构[10]，对样本液由质量守恒定律可得：
| ${{V}_{2}}{{D}_{2}}={{V}_{c}}d\] |
式中：V2为样本液平均流速，Vc为聚焦后样本液平均流速，D2为样本管内直径，d为样本液聚焦稳定后的直径。
根据质量守恒定律可知聚焦后混合流体的平均流速：
| $V=\frac{{{\rho }_{1}}{{V}_{1}}\left( {{D}_{1}}-{{D}_{2}} \right)+{{\rho }_{2}}{{V}_{2}}{{D}_{2}}}{\rho {{D}_{3}}}\] |
式中：ρ1、ρ2分别为鞘液和样本液密度，ρ为聚焦后流体的平均密度，D1为鞘液管内径，V1为鞘液平均流速。
由于聚焦后的样本液与管路同轴且直径远小于管路直径，可认为聚焦后样本液平均流速与管路轴中心流速相等，根据抛物面性质[11]，可得：
| ${{V}_{c}}=1.5V\] |
由式(1)、(2)、(3) 可得样本液聚焦后直径为：
| $d=\frac{{{D}_{2}}\times \rho {{D}_{3}}}{1.5\left| {{\rho }_{1}}\frac{{{V}_{1}}}{{{V}_{2}}}\left( {{D}_{1}}-{{D}_{2}} \right)+{{\rho }_{2}}{{D}_{2}} \right|}\] |
由液体流动的Bernoulli方程可知，流体中的任一点流速V和该点的压力(实指压强，下同)P、该点相对于参考点高度差H之间的关系为：
| $\frac{P}{\rho g}+H+\frac{{{v}^{2}}}{2g}=C\left( C为常数 \right)\] |
样本液聚焦后直径太小或太大将不能形成稳定的单细胞层流[12]。由式(4) 、(5) 可知，在不考虑高度变化情况的条件下，保持恒定的压力能够得到恒定的鞘液和样本液流速比，聚焦后的直径d也就保持恒定，可以得到稳定的单细胞层流。但是，当流动室中液流流动不畅或堵塞时，样本液的速度V2会发生变化，对应的压力P也随之变化，流速比发生改变，单细胞层流将变得不稳定。因此可以通过实时监测液路中的压力值来判断单细胞层流的稳定性。
2.2 流动室阻塞判定方法
流动室内部狭小通道的堵塞会造成液流系统压力变化，通过分析流动室内部压力变化程度可实现对其内部流动不畅及堵塞的判定。流动室阻塞判定及反冲原理如图 3所示，压力传感器对流动室内压力进行监测，并将压力数据转换成电压信号；信号调理模块对电压信号进行滤波、幅值调理等操作；调理后的电压信号经ADC等处理后送至主控模块；主控模块根据压力值范围判断流动室是否发生阻塞，并控制相应的液流系统进行排堵。
图3
阻塞判定原理图
Figure3.
Schematic diagram of clogging determination
大量实验结果表明，流动室正常工作时压力传感器输出电压值为1~1.5 V，完全阻塞时为2.6 V；当流动室通道阻塞达到直径的20%时，层流稳定性受到影响，其对应的压力值为2.2 V。基于以上分析，本文将判定流动室发生堵塞的阈值设定为2.2 V。 即，当压力传感器输出电压值超过2.2 V时，则认为流动室内部通道堵塞超过喷嘴出口直径的20%，需要执行反冲操作进行排堵。
2.3 反冲
反冲排堵是通过控制排堵液路的压力，利用正压对流动室进行反向冲洗。如图 3所示，当主控模块根据传感器输出结果判定流动室发生堵塞时，通过控制排堵液路和清洗液路的冲洗时间对流动室进行间歇反冲疏通，并将废液通过流动室侧面的管路排出，防止二次阻塞。利用反向流对流动室进行反冲的过程中，传感器对流动室内压力进行实时监控，从而避免在反冲过程中由于反向流流速过大对流动室造成损害。
2.4 技术实现
液流系统中压力传感器、电磁阀等器件较多，为了减少液路的复杂性，利用液流系统的动力源，对流动室的液流自洁系统进行设计，原理图如图 4所示。
图4
流式细胞仪液流自洁系统
1：正压泵；2：电气比例阀；3：二位二通电磁阀；4：压力传感器；5：过滤器；6：二位三通电磁阀；7：流动室；8：缓冲装置；9：试管；10：试管提升装置
Figure4. Flow cytometry fluid self-cleaning system1: positive pressure pump; 2: electrical proportional valve; 3: two two-way solenoid valve; 4: pressure sensor; 5: filter; 6: two three-way solenoid; 7: flow cell; 8: buffer device; 9: tube; 10: tubes lifting device
电气比例阀RG1~RG4作为调压阀，为清洗液、鞘液、样本液和排堵调节合适正压力，压力传感器U1~U4分别监测四条支路的压力值，U5检测流动室压力。
(1) 正常工作液流回路：电磁阀1YA、2YA、3YA通电后变成通路状态，压力分别进入清洗液桶、鞘液桶和样本液试管中，电磁阀6YA和8YA均通电动作，此时鞘液和样本液按照一定的流速比在流动中聚焦后由电磁阀8YA流入到废液桶中构成整个工作回路。当样本检测完成后3YA断电变成常闭状态，同时5YA由通电动作对流动室及其管路进行清洗，构成了清洗回路。
(2) 液流自洁回路：电气比例阀RG4、电磁阀4YA、7YA、9YA构成液流自洁系统回路，压力传感器U3、U5实时监测样本液和流动室的压力，当流动室堵塞时可立即启动排堵回路，利用正压反向冲洗流动室。其工作流程图如图 5所示。
图5
液流系统工作流程图
Figure5.
Work flow chart of flow system
3 液流自洁系统搭建及数据分析
3.1 液流自洁系统搭建
设计并搭建流式细胞仪液流自洁系统如图 6所示。采用直径0.3 mm标准塑料微球模拟流动室堵塞现象。
图6
液流自洁系统实物照片
Figure6.
Real photo of self-cleaning system
3.2 数据分析
流动室主要结构参数D1=4.5 mm，D2=0.25 mm，D3=0.28 mm。由式(4) 可知V1/V2=4时d=0.025 mm，V1/V2=2时 d=0.045 mm。当d＞0.045 mm时层流宽度已不能满足测量要求，其对应的压力传感器输出电压值设置为阈值。在正常工作时，压力传感器U5实时检测管路中的压力，压力对应的电压值如图 7(a)所示。当发生流动室堵塞时，压力传感器检测管路的压力会发生变化，压力对应的电压值如图 7(b)所示。
图7
流动室工作时压力传感器输出
(a)正常工作时压力传感器输出；(b)发生堵塞压力传感器输出
Figure7. Pressure sensor output of flow cell working(a) normal operating pressure sensor output; (b) clogging operating pressure sensor output
如图 7所示，流动室处于正常的工作状态时传感器U5输出电压为1 V左右，当压力传感器检测的电压值上升到2.6 V左右时，流动室处于完全堵塞状态。当压力传感器检测到的电压值高于阈值(2.2 V)时，系统会自动启动反冲程序。反冲时序过程如图 8所示。
图8
液路反冲时序图
Figure8.
Hydraulic recoil path timing chart
(1) 正常数据采集时电磁阀1YA、2YA、3YA、6YA、8YA上电动作；
(2) 堵塞时0~1 s，电磁阀3YA和6YA立即关闭，同时5YA、9YA、10YA动作，利用清洗液清洗流动室和加样针。
(3) 1~5 s关闭电磁阀5YA，打开电磁阀4YA，在正压力的作用下从流动室废液出口对其进行气体反冲排堵；
(4) 5~15 s与步骤(2) 的功能一样，关闭电磁阀4YA，电磁阀5YA动作清洗液流入流动室的鞘液管中并通过电磁阀7YA流入废液桶，清洗鞘液管；
(5) 15~20 s间歇清洗流动室和用正压对其进行排堵，清洗时利用电磁阀8YA将清洗液排出；
(6) 最后打开电磁阀6YA，将鞘液压入流动室进行冲洗，并让其充满鞘液。
通过上面的排堵时序，压力传感器检测的压力会回到初始正常的压力值，如图 9所示，压力传感器输出电压从2.6 V下降回到正常工作时的电压1 V左右。
图9
反冲时压力传感器输出
Figure9.
Recoil operating pressure sensor output
将该系统用于所研制的流式细胞仪表明，系统能保证正常工作，没有再发生液流不畅甚至堵塞现象。
4 结论
本文对流式细胞仪核心部件流动室的液流聚焦原理进行了分析，确定了根据流动室液流压力判断流动室是否发生堵塞的思路，并设计了液流自洁系统，采用压力传感器对管路中的压力进行实时检测。实验表明：设计的液流系统能及时检测出堵塞发生并对其成功排堵，使样本液在流动室形成稳定的样本液单细胞层流，避免散射光及荧光检测信号失真所导致的误诊等医疗事故。
引言
流式细胞仪是基于流式细胞术原理对单细胞或微颗粒进行定量分析的仪器，具有检测速度快、准确性好、精度高等优点[1-3]。流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、信号收集与转换系统、分析系统等组成[4]。其中液流系统的作用是将含有待测细胞或微颗粒的样本液与不含细胞或微颗粒的缓冲液即鞘液按照一定的压力比注入到流动室中，利用液流聚焦原理使样本液中的细胞或微颗粒依次通过流动室检测区域。 由于样本液中可能有血液和荧光试剂的反应物，也可能有采血过程中带入的棉签丝、皮肤组织及细胞碎片等杂物，容易导致系统流动不畅甚至堵塞，以致于两种溶液不能进行聚焦作用，无法获得稳定的样本液层流，进一步导致散射光及荧光检测信号都会出现失真，从而产生错误的临床诊断信息，可能出现误诊等医疗事故[5]。
流式细胞液流系统堵塞是目前亟待解决的问题，通用做法是在鞘液回路中增加过滤器和压力开关进行报警，一旦发生堵塞，需要停机、拆机、人工使用注射器回吸等方式进行排堵[6]。这种方法存在成本高、效率低以及可能会产生二次污染等问题。 本文研究了堵塞问题并提出了解决方案。在流式细胞仪原有的液流系统的基础上设计了自洁系统液路，通过对管路内的压力进行实时监测，可判断堵塞问题并及时报警、自动清洗液路以保证仪器的正常工作，提高了液流系统的可靠性。
1 流式细胞仪堵塞的原理分析
流式细胞仪原理如图 1所示。利用稳定的液流系统将鞘液和样本液按照一定的压力比压入流动室中，形成稳定的单细胞层流，在检测区域，用激光垂直照射单细胞层流激发产生荧光信号和散射光信号[7-9]。分别会被90°方向的光电倍增管(photomultiplier,PMT)和激光前方的光电二极管接收，并将光学信号转换为电信号，对电信号进行处理转换成数字信号传输到计算机进行数据分析和存储。
图1
流式细胞仪原理图
Figure1.
Schematic diagram of flow cytometry
其中液流系统包括流动室、泵组、电磁阀、调压阀、压力传感器、过滤器等。由于整个液流系统管路的直径以及流动室鞘液入口直径均在1.5~2.5 mm之间，而为了实现“聚焦”形成稳定的单细胞层流，流动室检测区通径设计得很小，一般在0.1~0.4 mm[10]。 液流中的杂物在聚焦过程中由于流动室缩径会引起“涡流”现象，从而在窄小的喷嘴出口处形成堵塞。
2 液流自洁系统设计
2.1 流动室堵塞的压力检测原理
流动室由样本液入口、鞘液入口和喷嘴等组成，通常用石英、光学玻璃、特殊金属等稳定的材料制作而成。流动室液流聚焦原理如图 2所示。
图2
流动室液流聚焦原理图
Figure2.
Schematic diagram of hydrodynamic focus in flow cell
流动室内的样本管和鞘液管呈共轴圆柱环式布局结构[10]，对样本液由质量守恒定律可得：
| ${{V}_{2}}{{D}_{2}}={{V}_{c}}d\] |
式中：V2为样本液平均流速，Vc为聚焦后样本液平均流速，D2为样本管内直径，d为样本液聚焦稳定后的直径。
根据质量守恒定律可知聚焦后混合流体的平均流速：
| $V=\frac{{{\rho }_{1}}{{V}_{1}}\left( {{D}_{1}}-{{D}_{2}} \right)+{{\rho }_{2}}{{V}_{2}}{{D}_{2}}}{\rho {{D}_{3}}}\] |
式中：ρ1、ρ2分别为鞘液和样本液密度，ρ为聚焦后流体的平均密度，D1为鞘液管内径，V1为鞘液平均流速。
由于聚焦后的样本液与管路同轴且直径远小于管路直径，可认为聚焦后样本液平均流速与管路轴中心流速相等，根据抛物面性质[11]，可得：
| ${{V}_{c}}=1.5V\] |
由式(1)、(2)、(3) 可得样本液聚焦后直径为：
| $d=\frac{{{D}_{2}}\times \rho {{D}_{3}}}{1.5\left| {{\rho }_{1}}\frac{{{V}_{1}}}{{{V}_{2}}}\left( {{D}_{1}}-{{D}_{2}} \right)+{{\rho }_{2}}{{D}_{2}} \right|}\] |
由液体流动的Bernoulli方程可知，流体中的任一点流速V和该点的压力(实指压强，下同)P、该点相对于参考点高度差H之间的关系为：
| $\frac{P}{\rho g}+H+\frac{{{v}^{2}}}{2g}=C\left( C为常数 \right)\] |
样本液聚焦后直径太小或太大将不能形成稳定的单细胞层流[12]。由式(4) 、(5) 可知，在不考虑高度变化情况的条件下，保持恒定的压力能够得到恒定的鞘液和样本液流速比，聚焦后的直径d也就保持恒定，可以得到稳定的单细胞层流。但是，当流动室中液流流动不畅或堵塞时，样本液的速度V2会发生变化，对应的压力P也随之变化，流速比发生改变，单细胞层流将变得不稳定。因此可以通过实时监测液路中的压力值来判断单细胞层流的稳定性。
2.2 流动室阻塞判定方法
流动室内部狭小通道的堵塞会造成液流系统压力变化，通过分析流动室内部压力变化程度可实现对其内部流动不畅及堵塞的判定。流动室阻塞判定及反冲原理如图 3所示，压力传感器对流动室内压力进行监测，并将压力数据转换成电压信号；信号调理模块对电压信号进行滤波、幅值调理等操作；调理后的电压信号经ADC等处理后送至主控模块；主控模块根据压力值范围判断流动室是否发生阻塞，并控制相应的液流系统进行排堵。
图3
阻塞判定原理图
Figure3.
Schematic diagram of clogging determination
大量实验结果表明，流动室正常工作时压力传感器输出电压值为1~1.5 V，完全阻塞时为2.6 V；当流动室通道阻塞达到直径的20%时，层流稳定性受到影响，其对应的压力值为2.2 V。基于以上分析，本文将判定流动室发生堵塞的阈值设定为2.2 V。 即，当压力传感器输出电压值超过2.2 V时，则认为流动室内部通道堵塞超过喷嘴出口直径的20%，需要执行反冲操作进行排堵。
2.3 反冲
反冲排堵是通过控制排堵液路的压力，利用正压对流动室进行反向冲洗。如图 3所示，当主控模块根据传感器输出结果判定流动室发生堵塞时，通过控制排堵液路和清洗液路的冲洗时间对流动室进行间歇反冲疏通，并将废液通过流动室侧面的管路排出，防止二次阻塞。利用反向流对流动室进行反冲的过程中，传感器对流动室内压力进行实时监控，从而避免在反冲过程中由于反向流流速过大对流动室造成损害。
2.4 技术实现
液流系统中压力传感器、电磁阀等器件较多，为了减少液路的复杂性，利用液流系统的动力源，对流动室的液流自洁系统进行设计，原理图如图 4所示。
图4
流式细胞仪液流自洁系统
1：正压泵；2：电气比例阀；3：二位二通电磁阀；4：压力传感器；5：过滤器；6：二位三通电磁阀；7：流动室；8：缓冲装置；9：试管；10：试管提升装置
Figure4. Flow cytometry fluid self-cleaning system1: positive pressure pump; 2: electrical proportional valve; 3: two two-way solenoid valve; 4: pressure sensor; 5: filter; 6: two three-way solenoid; 7: flow cell; 8: buffer device; 9: tube; 10: tubes lifting device
电气比例阀RG1~RG4作为调压阀，为清洗液、鞘液、样本液和排堵调节合适正压力，压力传感器U1~U4分别监测四条支路的压力值，U5检测流动室压力。
(1) 正常工作液流回路：电磁阀1YA、2YA、3YA通电后变成通路状态，压力分别进入清洗液桶、鞘液桶和样本液试管中，电磁阀6YA和8YA均通电动作，此时鞘液和样本液按照一定的流速比在流动中聚焦后由电磁阀8YA流入到废液桶中构成整个工作回路。当样本检测完成后3YA断电变成常闭状态，同时5YA由通电动作对流动室及其管路进行清洗，构成了清洗回路。
(2) 液流自洁回路：电气比例阀RG4、电磁阀4YA、7YA、9YA构成液流自洁系统回路，压力传感器U3、U5实时监测样本液和流动室的压力，当流动室堵塞时可立即启动排堵回路，利用正压反向冲洗流动室。其工作流程图如图 5所示。
图5
液流系统工作流程图
Figure5.
Work flow chart of flow system
3 液流自洁系统搭建及数据分析
3.1 液流自洁系统搭建
设计并搭建流式细胞仪液流自洁系统如图 6所示。采用直径0.3 mm标准塑料微球模拟流动室堵塞现象。
图6
液流自洁系统实物照片
Figure6.
Real photo of self-cleaning system
3.2 数据分析
流动室主要结构参数D1=4.5 mm，D2=0.25 mm，D3=0.28 mm。由式(4) 可知V1/V2=4时d=0.025 mm，V1/V2=2时 d=0.045 mm。当d＞0.045 mm时层流宽度已不能满足测量要求，其对应的压力传感器输出电压值设置为阈值。在正常工作时，压力传感器U5实时检测管路中的压力，压力对应的电压值如图 7(a)所示。当发生流动室堵塞时，压力传感器检测管路的压力会发生变化，压力对应的电压值如图 7(b)所示。
图7
流动室工作时压力传感器输出
(a)正常工作时压力传感器输出；(b)发生堵塞压力传感器输出
Figure7. Pressure sensor output of flow cell working(a) normal operating pressure sensor output; (b) clogging operating pressure sensor output
如图 7所示，流动室处于正常的工作状态时传感器U5输出电压为1 V左右，当压力传感器检测的电压值上升到2.6 V左右时，流动室处于完全堵塞状态。当压力传感器检测到的电压值高于阈值(2.2 V)时，系统会自动启动反冲程序。反冲时序过程如图 8所示。
图8
液路反冲时序图
Figure8.
Hydraulic recoil path timing chart
(1) 正常数据采集时电磁阀1YA、2YA、3YA、6YA、8YA上电动作；
(2) 堵塞时0~1 s，电磁阀3YA和6YA立即关闭，同时5YA、9YA、10YA动作，利用清洗液清洗流动室和加样针。
(3) 1~5 s关闭电磁阀5YA，打开电磁阀4YA，在正压力的作用下从流动室废液出口对其进行气体反冲排堵；
(4) 5~15 s与步骤(2) 的功能一样，关闭电磁阀4YA，电磁阀5YA动作清洗液流入流动室的鞘液管中并通过电磁阀7YA流入废液桶，清洗鞘液管；
(5) 15~20 s间歇清洗流动室和用正压对其进行排堵，清洗时利用电磁阀8YA将清洗液排出；
(6) 最后打开电磁阀6YA，将鞘液压入流动室进行冲洗，并让其充满鞘液。
通过上面的排堵时序，压力传感器检测的压力会回到初始正常的压力值，如图 9所示，压力传感器输出电压从2.6 V下降回到正常工作时的电压1 V左右。
图9
反冲时压力传感器输出
Figure9.
Recoil operating pressure sensor output
将该系统用于所研制的流式细胞仪表明，系统能保证正常工作，没有再发生液流不畅甚至堵塞现象。
4 结论
本文对流式细胞仪核心部件流动室的液流聚焦原理进行了分析，确定了根据流动室液流压力判断流动室是否发生堵塞的思路，并设计了液流自洁系统，采用压力传感器对管路中的压力进行实时检测。实验表明：设计的液流系统能及时检测出堵塞发生并对其成功排堵，使样本液在流动室形成稳定的样本液单细胞层流，避免散射光及荧光检测信号失真所导致的误诊等医疗事故。
