鉴于丙型肝炎病毒(HCV)危害着人类健康, 本研究拟用反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)建立一种简易检测方法。收集并用FQ-PCR(金标准)检测临床样本。根据HCV保守5'非编码区设计4条通用引物, 然后用Taq DNA聚合酶优化传统RT-LAMP体系, 通过酶切和交叉实验以评价RT-LAMP的特异性, 通过和反转录PCR(RT-PCR)同时检测倍比稀释的模板以评价RT-LAMP的灵敏度。同时判断钙黄绿素和羟基萘芬蓝(HNB)染色法是否与电泳法的结果相同。结果显示, Taq DNA聚合酶可提高扩增效率, RT-LAMP的特异性好, 酶切片段与预期相一致(216 bp)且只有HCV被扩增, 灵敏度为10 IU/tube, 比RT-PCR高10倍。另外, 两种染料和电泳法的检测结果相同。RT-LAMP和RT-PCR检测75例临床样本的一致性差(P＜0.05, Kappa=0.375), 和FQ-PCR的一致性好(P＞0.05, Kappa=0.762)。综上所述, RT-LAMP简易、特异、灵敏, 适用于基层医疗机构。
引用本文： 赵娜, 刘金霞, 孙殿兴. 利用反转录环介导等温扩增技术检测丙型肝炎病毒. 生物医学工程学杂志, 2016, 33(4): 712-718. doi: 10.7507/1001-5515.20160117 复制
0 引言
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染呈世界分布，全球丙肝感染人数达1.3～1.7亿，我国HCV感染人数经推算有1 000万，并有部分患者可发展为肝硬化甚至肝癌[1]。目前丙型肝炎(简称丙肝)的疗效不佳，并且患者使用干扰素或利巴韦林的副作用较明显，如失眠、抑郁、脱发、贫血等[2]，因此早期防控丙肝具有重要的临床意义。目前检测HCV的方法主要有两类：一是免疫学方法，如胶体金法、ELISA法，优点是操作简单、检测快速，缺点是灵敏度较低[3-4]，阴性结果也不能排除感染可能；二是分子生物学方法检测核酸，如荧光定量PCR(fluorescence quantitative-PCR，FQ-PCR)，优点是灵敏度和特异性均较好[5-6]，缺点是步骤繁琐、对操作环境和操作人员要求高，因此限制了其在基层医疗机构的应用。
近年来，环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification，LAMP)因其操作易学、灵敏、特异性高等特点，已受到广泛关注[7-8]。所谓反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription-loop mediated isothermal amplification, RT-LAMP)，就是在传统LAMP体系中加入反转录酶，将RNA的反转录和互补DNA(cDNA)的扩增同时完成。本研究基于传统的RT-LAMP反应体系，向其中加入Taq DNA聚合酶以提高扩增效率，并比较评价几种简易的产物检测方法，以期建立简易、灵敏、特异的RT-LAMP技术。
1 材料与方法
1.1 收集模板并定量
1.1.1 模板来源
收集白求恩国际和平医院75例疑似感染HCV的受检者血清样本，按照RNA提取试剂盒(Viral RNA Mini Kit，QIAamp公司)的说明提取血清中的HCV RNA。本研究经过医学伦理审查，获得受检者的知情同意。三种用于特异性实验的DNA病毒：巨细胞病毒(cytomegaoviyns，CMV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)均由本实验室保存。
1.1.2 FQ-PCR检测
FQ-PCR试剂盒购自上海之江公司。①简要操作步骤：取FQ-PCR检测混合液19 μL与1 μL RT-PCR酶，震荡混匀数秒，3 000 r/min离心数秒。加入5 μL已提取样本(包括临床样本、对照品、标准品)，离心数秒后上机。②参数设置：45 ℃×10 min，95 ℃×15 min，循环一次；95 ℃×15 s，60 ℃×60 s，循环40次，荧光检测在60 ℃，荧光通道FAM。③以FQ-PCR为“金标准”，结果75例样本中有阳性65例(1×103～1×104 IU/mL 8例、1×104～1×105 IU/mL 16例、1×105～1×106 IU/mL 18例、1×106～1×107 IU/mL 23例)，阴性10例(＜1×103 IU/mL)。
1.2 RT-PCR
1.2.1 反转录步骤
cDNA合成试剂盒(TIANS sript DNA第一链合成试剂盒)购自Qingen公司。操作步骤：①在冰浴的无核酸酶的离心管中，配制约5 μg总RNA，2 μL Random引物和2 μL Super Pure dNTP(各2.5 mmol/L)反应体系14.5 μL。②在70 ℃加热5 min后迅速冷却2 min。简短离心后加入4 μL 5×First-Strand Buffer和0.5 μL RNasin。③加1 μL(200 U)TIANS script M-MLV(Vazyme公司)，轻轻混匀，将反应管置25 ℃温浴10 min，42 ℃温浴50 min。④在95 ℃加热5 min终止反应。⑤加RNase H 2 U，37 ℃温浴20 min以降解RNA，然后95 ℃加热5 min灭活酶。⑥用双蒸水(ddH2O)将反应体系稀释到50 μL。
1.2.2 PCR试剂配制
上下游引物(F3和B3)各1.0 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，10×Taq Buffer 2.5 μL，dNTPs各0.2 mmol/L，MgCl2 4 mmol/L，2 μL经反转录的cDNA，用双蒸水补足50 μL。
1.2.3 参数设置
95 ℃×3 min，循环一次；95 ℃×30 s，55 ℃×30 s，72 ℃×30 s，循环35次；72 ℃×5 min，循环一次。
1.3 设计RT-LAMP引物
根据NCBI网站公布的HCV 5＇端非编码区(5＇UTR区)的保守区，用专业引物设计软件Primer Explorer V4设计RT-LAMP引物。引物和靶序列的相对位置如图 1所示。如表 1所示，以5种基因型的参考序列(GenBank号：KC844048.1、JQ065709.1、GU451222.1、EU798760.1、KM252792.1)示意通用引物，引物序列如表 1所示，表中F3和B3为RT-LAMP外引物，FIP(由F1c和F2组成)和BIP(由B1c和B2组成)为RT-LAMP内引物。所有引物由上海生工公司合成。
图1
RT-LAMP引物和靶序列的相对位置
Figure1.
Relative positions of RT-LAMP primers and target sequences
表1
检测HCV的RT-LAMP引物
Table1.
RT-LAMP primers for detection of HCV
1.4 RT-LAMP
1.4.1 传统反应体系
内引物(FIP和BIP)各1.6 μmol/L，外引物(F3和B3)各0.2 μmol/L，甜菜碱0.8 mol/L(Sigma公司)，Mg2SO4 6 mmol/L，dNTPs各1.4 mmol/L，模板RNA 2 μL，Bst DNA聚合酶8 U(NEB公司)、反应缓冲液2.5 μL，重组核糖核酸酶抑制剂40 U(Invitrogen公司)，M-MLV 1 μL，加双蒸水补足25 μL。用ddH2O代替模板设立阴性对照。65 ℃恒温反应60 min后取出反应管进行产物检测。
1.4.2 产物检测
①电泳法:取扩增产物5 μL上样于2 %琼脂糖凝胶中电泳30～40 min并观察扩增条带。②浊度观察法反应完成后见到反应管内的白色浑浊为阳性，保持透明为阴性。③钙黄绿素染色法:在反应前向体系中加入1 μL钙黄绿素和MnCl2混合液(终浓度分别为5 mmol/L和10 mmol/L)。反应结束后，见到体系呈绿色为阳性，橙色为阴性。④HNB染色法:在反应前向体系加入1 mol/L HNB溶液(终浓度120 μmol/L)。反应结束后，见到体系呈天蓝色为阳性，紫色为阴性。
1.5 Taq DNA聚合酶优化实验
比较在向体系中加入和不加入Taq DNA聚合酶的两种条件下，在10、30、50和70 min后对扩增效率的影响，根据电泳后的RT-LAMP特有的梯状条带评价该酶的优化效果。
1.6 特异性和灵敏度实验
1.6.1 特异性实验
①以3例丙肝RNA为模板进行RT-LAMP扩增，用特异性内切酶Nru Ⅰ(tcg|cga)对扩增产物进行酶切，根据片段大小定性判断扩增产物的存在。②以CMV、HBV和HSV-1为模板加入体系进行扩增以进一步验证特异性。
1.6.2 灵敏度实验
选择RNA含量约为5×107 IU/mL的4例HCV样本，用ddH2O进行一系列10倍稀释，以此系列稀释度的HCV为模板，分别进行RT-LAMP和RT-PCR扩增。按照反应管量(tube)换算，实际反应量分别为1×104、1×103、100、10和1 IU/tube。
1.7 统计分析
应用SPSS 17.0软件，对RT-LAMP和RT-PCR检测的75例样本检测结果分别和金标准(FQ-PCR)结果进行χ2检验。计算P值和Kappa值。Kappa值＜0.4，一致性较差；Kappa值0.4～0.7，一致性一般；Kappa＞0.7，则一致性较好。
2 结果
2.1 酶优化实验
Taq DNA聚合酶对传统RT-LAMP扩增效率影响的实验结果如图 2所示。图 2(a)表明未加入Taq DNA聚合酶的情况下，反应50 min后才可见明显的条带；图 2(b)表明加入Taq DNA聚合酶后，在反应30 min后就可见较清晰的扩增条带。说明传统的RT-LAMP体系在加入这种酶之后，对其扩增效率产生了促进作用，可使扩增效率提高20 min。
图2
体系中未加入和加入Taq DNA聚合酶的RT-LAMP电泳图
(a)未加入Taq DNA聚合酶的传统RT-LAMP电泳图；(b)加入Taq DNA聚合酶后的RT-LAMP电泳图。1～4：10、30、50和70 min；M：100 bp DNA marker；N：阴性对照
Figure2. Electrophoresis pattern of RT-LAMP before and after adding Taq DNA polymerase to the system(a) conventional electrophoresis pattern of RT-LAMP before adding Taq DNA polymerase; (b) electrophoresis pattern of RT-LAMP after adding Taq DNA polymerase. 1-4: 10, 30, 50 and 70 min; M: 100 bp DNA marker; N: negative control
2.2 特异性实验
RT-LAMP特异性实验结果如图 3(a)所示，只有以HCV为模板的扩增产物在电泳后呈现特征性的梯状条带，CMV、HBV和HSV-1病毒未被扩增，而且扩增产物经Nru Ⅰ内切酶酶切后，电泳指示的条带和预计主带大小相一致(216 bp)。上述两种实验均说明RT-LAMP具有较好的特异性。三种方法对扩增产物检测的比较结果如图 3(b)、(c)和(d)所示，图 3(b)中HCV阳性反应体系中见微弱的白色浑浊，图 3(c)中HCV阳性反应体系中由橙色变为绿色，图 3(d)中HCV阳性体系中由紫色变为蓝色。对含有非特异模板的体系，3种检测结果相同，说明均未发生非特异扩增。然而浊度观察法(b)的可视性不如钙黄绿素(c)和HNB染色法(d)的好。
图3
RT-LAMP的特异性实验
(a)RT-LAMP特异性实验电泳图。1：以HCV为模板；2：酶切片段；3～5：以CMV、HBV和HSV-1为模板。(b)浊度观察图。1：HCV为模板；2～4：分别为以CMV、HBV和HSV-1为模板。(c)钙黄绿素染色图。1：HCV为模板；2～4：分别为以CMV、HBV和HSV-1为模板。(d)HNB染色图。1：HCV为模板；2～4：分别为以CMV、HBV和HSV-1为模板。M：100 bp DNA marker；N：阴性对照
Figure3. Specificity assay of RT-LAMP(a) specificity assay of electrophoresis pattern by RT-LAMP. 1: HCV as template; 2: the endonuclease digestion fragment; 3-5: CMV, HBV and HSV-1 as templates. (b) pattern by turbidity observation. 1: HCV as template; 2-4: CMV, HBV and HSV-1 as templates. (c) pattern by calcein stain. (d) pattern by HNB stain. 1: HCV as template; 2-4: CMV, HBV and HSV-1 as templates. M: 100 bp DNA marker; N: negative control
2.3 灵敏度实验
RT-PCR的灵敏度实验结果如图 4(a)所示，随着模板稀释度的逐渐增大，模板量从1×104～100 IU/tube的扩增条带逐渐减弱，检测极限为100 IU/tube，所以RT-PCR的灵敏度为100 IU/tube。RT-LAMP的灵敏度实验结果如图 4(b)所示，随着模板稀释度的逐渐增大，扩增条带逐渐减弱，检测极限为10 IU/tube，所以RT-LAMP的灵敏度为10 IU/tube。浊度观察结果如图 4(c)所示，模板量从高到低的反应管内白色沉淀逐渐减少，而HCV含量为10 IU/tube所产生的白色沉淀较难用肉眼判定，所以浊度观察法的可视性较差。使用钙黄绿素和HNB染色法后，如图 4(d)和4(e)所示，反应管内均呈现相应的颜色改变，而且所示灵敏度和图 4(b)的电泳法结果相同，均可达到10 IU/tube。
图4
RT-PCR和RT-LAMP的灵敏度实验
(a)RT-PCR电泳图；(b)RT-LAMP电泳图；(c)浊度观察图；(d)钙黄绿素染色图；(e)HNB染色图。1-5：1×104、1×103、100、10和1 IU/tube；M：100 bp DNA marker；N：阴性对照
Figure4. Sensitivity assay of RT-PCR and RT-LAMP(a) electrophoresis pattern of RT-PCR; (b) electrophoresis pattern of RT-LAMP; (c) pattern by turbidity observation; (d) pattern by calcein stain; (e) pattern by HNB stain. 1-5: 1×104, 1×103, 100, 10 and 1 IU/tube; M: 100 bp DNA marker; N: negative control
2.4 临床样本的检测
以FQ-PCR为金标准，分别用RT-LAMP和RT-PCR对75例临床样本进行检测(如表 2所示)。结果RT-PCR可以检测到全部HCV含量在1×105 IU/mL以上的41例阳性样本。按照单管反应量换算，这和上述稀释实验的灵敏度(100 IU/tube)相一致。然而RT-PCR在检测HCV含量为1×104～1×105 IU/mL样本的重复性较差，有20例样本为假阴性，所以RT-PCR的灵敏度为69.23%。
表2
RT-LAMP、RT-PCR和FQ-PCR的临床样本检测结果
Table2.
Detection results of clinical samples by RT-LAMP, RT-PCR and FQ-PCR
RT-LAMP可以检测到HCV含量在1×104 IU/mL以上的57例阳性样本。按照单管反应量换算，这和上述稀释实验的灵敏度(10 IU/tube)相一致。然而RT-LAMP在检测HCV含量为1×103～1×104 IU/mL样本时重复性不好，有5例样本为假阴性，所以RT-LAMP的检测灵敏度为92.31%。另外，阴性样本的RT-PCR和RT-LAMP检测结果均与金标准(FQ-PCR)相一致，特异性均为100%。
用χ2检验分别判断RT-PCR和RT-LAMP与金标准的一致性(如表 3所示)，按照0.05检验水准，可知RT-LAMP和FQ-PCR差异没有统计学意义(P＞0.05)，一致性也较好(Kappa＞0.7)；而RT-PCR和FQ-PCR差异有统计学意义(P＜0.05), 一致性差(Kappa＜0.4)。
表3
RT-PCR和RT-LAMP与金标准的一致性
Table3.
Consistency of RT-LAMP and RT-PCR comparing to gold standard
3 讨论
目前PCR或FQ-PCR是主要的核酸检测手段[9-11]，但是这种方法存在设备昂贵、操作繁琐等缺点，不利于向基层医院推广。本研究利用RT-LAMP技术在等温条件下扩增HCV，不但省却了RT-PCR操作过程中的升温、降温等过程，在一定程度上降低了核酸以气溶胶形式对实验室的污染，而且通过向传统RT-LAMP体系中加入用于普通PCR扩增的Taq DNA聚合酶，启动了DNA合成的另一条途径，从而进一步提高了扩增效率。
虽然检测HCV的RT-LAMP技术也曾被研究过[12-15]，但是某些研究报道创新性差，尚存在需改进之处。例如李启明等[15]的RT-LAMP检测虽然也具有较好的灵敏度(接近10 IU/tube)，但是该方法的扩增效率低(90 min)，并且只靠裸眼观察浊度进行产物检测，而本研究和相关报道已证实这种方法不具有可靠性[16-17]。后来Kargar等使用可视性染料SYBR Green I进行结果检测[12-14]，然而SYBR Green I是非特异性双链DNA染色剂，无论是体系中扩增的、还是污染造成的DNA双链分子，都能嵌入其中而发出绿色荧光，因此假阳性率高。另外，SYBR Green I在体系中需具有较高的浓度才有利于肉眼判定结果，而高浓度的SYBR Green I会抑制扩增反应，故要在反应结束后开盖加入，开盖就会有气溶胶污染的可能，因此也会导致假阳性率升高。本研究使用钙黄绿素和HNB两种检测染料，不但不用开盖，避免了气溶胶污染，而且在特异性和灵敏度方面和电泳法的检测结果相一致。经临床样本检测，RT-LAMP与FQ-PCR的差异没有统计学意义，这是因为四条RT-LAMP引物需同时识别出靶序列上的6个特定区段才启动扩增反应，从而使特异性和灵敏度得到保证。由于仅需一台具有恒温功能的水浴箱即可完成操作，而且该技术的操作流程在很大程度上被简化，因此本研究建立的RT-LAMP技术具有应用于基层医疗机构的理论基础和实验经验。今后，如果基于该技术进行大规模临床样本的检测、自动化装置的开发和定量试剂盒的研制，增强其推广性和简易性，将会在防控疾病方面成为必不可少的有力工具。
0 引言
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染呈世界分布，全球丙肝感染人数达1.3～1.7亿，我国HCV感染人数经推算有1 000万，并有部分患者可发展为肝硬化甚至肝癌[1]。目前丙型肝炎(简称丙肝)的疗效不佳，并且患者使用干扰素或利巴韦林的副作用较明显，如失眠、抑郁、脱发、贫血等[2]，因此早期防控丙肝具有重要的临床意义。目前检测HCV的方法主要有两类：一是免疫学方法，如胶体金法、ELISA法，优点是操作简单、检测快速，缺点是灵敏度较低[3-4]，阴性结果也不能排除感染可能；二是分子生物学方法检测核酸，如荧光定量PCR(fluorescence quantitative-PCR，FQ-PCR)，优点是灵敏度和特异性均较好[5-6]，缺点是步骤繁琐、对操作环境和操作人员要求高，因此限制了其在基层医疗机构的应用。
近年来，环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification，LAMP)因其操作易学、灵敏、特异性高等特点，已受到广泛关注[7-8]。所谓反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription-loop mediated isothermal amplification, RT-LAMP)，就是在传统LAMP体系中加入反转录酶，将RNA的反转录和互补DNA(cDNA)的扩增同时完成。本研究基于传统的RT-LAMP反应体系，向其中加入Taq DNA聚合酶以提高扩增效率，并比较评价几种简易的产物检测方法，以期建立简易、灵敏、特异的RT-LAMP技术。
1 材料与方法
1.1 收集模板并定量
1.1.1 模板来源
收集白求恩国际和平医院75例疑似感染HCV的受检者血清样本，按照RNA提取试剂盒(Viral RNA Mini Kit，QIAamp公司)的说明提取血清中的HCV RNA。本研究经过医学伦理审查，获得受检者的知情同意。三种用于特异性实验的DNA病毒：巨细胞病毒(cytomegaoviyns，CMV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)均由本实验室保存。
1.1.2 FQ-PCR检测
FQ-PCR试剂盒购自上海之江公司。①简要操作步骤：取FQ-PCR检测混合液19 μL与1 μL RT-PCR酶，震荡混匀数秒，3 000 r/min离心数秒。加入5 μL已提取样本(包括临床样本、对照品、标准品)，离心数秒后上机。②参数设置：45 ℃×10 min，95 ℃×15 min，循环一次；95 ℃×15 s，60 ℃×60 s，循环40次，荧光检测在60 ℃，荧光通道FAM。③以FQ-PCR为“金标准”，结果75例样本中有阳性65例(1×103～1×104 IU/mL 8例、1×104～1×105 IU/mL 16例、1×105～1×106 IU/mL 18例、1×106～1×107 IU/mL 23例)，阴性10例(＜1×103 IU/mL)。
1.2 RT-PCR
1.2.1 反转录步骤
cDNA合成试剂盒(TIANS sript DNA第一链合成试剂盒)购自Qingen公司。操作步骤：①在冰浴的无核酸酶的离心管中，配制约5 μg总RNA，2 μL Random引物和2 μL Super Pure dNTP(各2.5 mmol/L)反应体系14.5 μL。②在70 ℃加热5 min后迅速冷却2 min。简短离心后加入4 μL 5×First-Strand Buffer和0.5 μL RNasin。③加1 μL(200 U)TIANS script M-MLV(Vazyme公司)，轻轻混匀，将反应管置25 ℃温浴10 min，42 ℃温浴50 min。④在95 ℃加热5 min终止反应。⑤加RNase H 2 U，37 ℃温浴20 min以降解RNA，然后95 ℃加热5 min灭活酶。⑥用双蒸水(ddH2O)将反应体系稀释到50 μL。
1.2.2 PCR试剂配制
上下游引物(F3和B3)各1.0 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，10×Taq Buffer 2.5 μL，dNTPs各0.2 mmol/L，MgCl2 4 mmol/L，2 μL经反转录的cDNA，用双蒸水补足50 μL。
1.2.3 参数设置
95 ℃×3 min，循环一次；95 ℃×30 s，55 ℃×30 s，72 ℃×30 s，循环35次；72 ℃×5 min，循环一次。
1.3 设计RT-LAMP引物
根据NCBI网站公布的HCV 5＇端非编码区(5＇UTR区)的保守区，用专业引物设计软件Primer Explorer V4设计RT-LAMP引物。引物和靶序列的相对位置如图 1所示。如表 1所示，以5种基因型的参考序列(GenBank号：KC844048.1、JQ065709.1、GU451222.1、EU798760.1、KM252792.1)示意通用引物，引物序列如表 1所示，表中F3和B3为RT-LAMP外引物，FIP(由F1c和F2组成)和BIP(由B1c和B2组成)为RT-LAMP内引物。所有引物由上海生工公司合成。
图1
RT-LAMP引物和靶序列的相对位置
Figure1.
Relative positions of RT-LAMP primers and target sequences
表1
检测HCV的RT-LAMP引物
Table1.
RT-LAMP primers for detection of HCV
1.4 RT-LAMP
1.4.1 传统反应体系
内引物(FIP和BIP)各1.6 μmol/L，外引物(F3和B3)各0.2 μmol/L，甜菜碱0.8 mol/L(Sigma公司)，Mg2SO4 6 mmol/L，dNTPs各1.4 mmol/L，模板RNA 2 μL，Bst DNA聚合酶8 U(NEB公司)、反应缓冲液2.5 μL，重组核糖核酸酶抑制剂40 U(Invitrogen公司)，M-MLV 1 μL，加双蒸水补足25 μL。用ddH2O代替模板设立阴性对照。65 ℃恒温反应60 min后取出反应管进行产物检测。
1.4.2 产物检测
①电泳法:取扩增产物5 μL上样于2 %琼脂糖凝胶中电泳30～40 min并观察扩增条带。②浊度观察法反应完成后见到反应管内的白色浑浊为阳性，保持透明为阴性。③钙黄绿素染色法:在反应前向体系中加入1 μL钙黄绿素和MnCl2混合液(终浓度分别为5 mmol/L和10 mmol/L)。反应结束后，见到体系呈绿色为阳性，橙色为阴性。④HNB染色法:在反应前向体系加入1 mol/L HNB溶液(终浓度120 μmol/L)。反应结束后，见到体系呈天蓝色为阳性，紫色为阴性。
1.5 Taq DNA聚合酶优化实验
比较在向体系中加入和不加入Taq DNA聚合酶的两种条件下，在10、30、50和70 min后对扩增效率的影响，根据电泳后的RT-LAMP特有的梯状条带评价该酶的优化效果。
1.6 特异性和灵敏度实验
1.6.1 特异性实验
①以3例丙肝RNA为模板进行RT-LAMP扩增，用特异性内切酶Nru Ⅰ(tcg|cga)对扩增产物进行酶切，根据片段大小定性判断扩增产物的存在。②以CMV、HBV和HSV-1为模板加入体系进行扩增以进一步验证特异性。
1.6.2 灵敏度实验
选择RNA含量约为5×107 IU/mL的4例HCV样本，用ddH2O进行一系列10倍稀释，以此系列稀释度的HCV为模板，分别进行RT-LAMP和RT-PCR扩增。按照反应管量(tube)换算，实际反应量分别为1×104、1×103、100、10和1 IU/tube。
1.7 统计分析
应用SPSS 17.0软件，对RT-LAMP和RT-PCR检测的75例样本检测结果分别和金标准(FQ-PCR)结果进行χ2检验。计算P值和Kappa值。Kappa值＜0.4，一致性较差；Kappa值0.4～0.7，一致性一般；Kappa＞0.7，则一致性较好。
2 结果
2.1 酶优化实验
Taq DNA聚合酶对传统RT-LAMP扩增效率影响的实验结果如图 2所示。图 2(a)表明未加入Taq DNA聚合酶的情况下，反应50 min后才可见明显的条带；图 2(b)表明加入Taq DNA聚合酶后，在反应30 min后就可见较清晰的扩增条带。说明传统的RT-LAMP体系在加入这种酶之后，对其扩增效率产生了促进作用，可使扩增效率提高20 min。
图2
体系中未加入和加入Taq DNA聚合酶的RT-LAMP电泳图
(a)未加入Taq DNA聚合酶的传统RT-LAMP电泳图；(b)加入Taq DNA聚合酶后的RT-LAMP电泳图。1～4：10、30、50和70 min；M：100 bp DNA marker；N：阴性对照
Figure2. Electrophoresis pattern of RT-LAMP before and after adding Taq DNA polymerase to the system(a) conventional electrophoresis pattern of RT-LAMP before adding Taq DNA polymerase; (b) electrophoresis pattern of RT-LAMP after adding Taq DNA polymerase. 1-4: 10, 30, 50 and 70 min; M: 100 bp DNA marker; N: negative control
2.2 特异性实验
RT-LAMP特异性实验结果如图 3(a)所示，只有以HCV为模板的扩增产物在电泳后呈现特征性的梯状条带，CMV、HBV和HSV-1病毒未被扩增，而且扩增产物经Nru Ⅰ内切酶酶切后，电泳指示的条带和预计主带大小相一致(216 bp)。上述两种实验均说明RT-LAMP具有较好的特异性。三种方法对扩增产物检测的比较结果如图 3(b)、(c)和(d)所示，图 3(b)中HCV阳性反应体系中见微弱的白色浑浊，图 3(c)中HCV阳性反应体系中由橙色变为绿色，图 3(d)中HCV阳性体系中由紫色变为蓝色。对含有非特异模板的体系，3种检测结果相同，说明均未发生非特异扩增。然而浊度观察法(b)的可视性不如钙黄绿素(c)和HNB染色法(d)的好。
图3
RT-LAMP的特异性实验
(a)RT-LAMP特异性实验电泳图。1：以HCV为模板；2：酶切片段；3～5：以CMV、HBV和HSV-1为模板。(b)浊度观察图。1：HCV为模板；2～4：分别为以CMV、HBV和HSV-1为模板。(c)钙黄绿素染色图。1：HCV为模板；2～4：分别为以CMV、HBV和HSV-1为模板。(d)HNB染色图。1：HCV为模板；2～4：分别为以CMV、HBV和HSV-1为模板。M：100 bp DNA marker；N：阴性对照
Figure3. Specificity assay of RT-LAMP(a) specificity assay of electrophoresis pattern by RT-LAMP. 1: HCV as template; 2: the endonuclease digestion fragment; 3-5: CMV, HBV and HSV-1 as templates. (b) pattern by turbidity observation. 1: HCV as template; 2-4: CMV, HBV and HSV-1 as templates. (c) pattern by calcein stain. (d) pattern by HNB stain. 1: HCV as template; 2-4: CMV, HBV and HSV-1 as templates. M: 100 bp DNA marker; N: negative control
2.3 灵敏度实验
RT-PCR的灵敏度实验结果如图 4(a)所示，随着模板稀释度的逐渐增大，模板量从1×104～100 IU/tube的扩增条带逐渐减弱，检测极限为100 IU/tube，所以RT-PCR的灵敏度为100 IU/tube。RT-LAMP的灵敏度实验结果如图 4(b)所示，随着模板稀释度的逐渐增大，扩增条带逐渐减弱，检测极限为10 IU/tube，所以RT-LAMP的灵敏度为10 IU/tube。浊度观察结果如图 4(c)所示，模板量从高到低的反应管内白色沉淀逐渐减少，而HCV含量为10 IU/tube所产生的白色沉淀较难用肉眼判定，所以浊度观察法的可视性较差。使用钙黄绿素和HNB染色法后，如图 4(d)和4(e)所示，反应管内均呈现相应的颜色改变，而且所示灵敏度和图 4(b)的电泳法结果相同，均可达到10 IU/tube。
图4
RT-PCR和RT-LAMP的灵敏度实验
(a)RT-PCR电泳图；(b)RT-LAMP电泳图；(c)浊度观察图；(d)钙黄绿素染色图；(e)HNB染色图。1-5：1×104、1×103、100、10和1 IU/tube；M：100 bp DNA marker；N：阴性对照
Figure4. Sensitivity assay of RT-PCR and RT-LAMP(a) electrophoresis pattern of RT-PCR; (b) electrophoresis pattern of RT-LAMP; (c) pattern by turbidity observation; (d) pattern by calcein stain; (e) pattern by HNB stain. 1-5: 1×104, 1×103, 100, 10 and 1 IU/tube; M: 100 bp DNA marker; N: negative control
2.4 临床样本的检测
以FQ-PCR为金标准，分别用RT-LAMP和RT-PCR对75例临床样本进行检测(如表 2所示)。结果RT-PCR可以检测到全部HCV含量在1×105 IU/mL以上的41例阳性样本。按照单管反应量换算，这和上述稀释实验的灵敏度(100 IU/tube)相一致。然而RT-PCR在检测HCV含量为1×104～1×105 IU/mL样本的重复性较差，有20例样本为假阴性，所以RT-PCR的灵敏度为69.23%。
表2
RT-LAMP、RT-PCR和FQ-PCR的临床样本检测结果
Table2.
Detection results of clinical samples by RT-LAMP, RT-PCR and FQ-PCR
RT-LAMP可以检测到HCV含量在1×104 IU/mL以上的57例阳性样本。按照单管反应量换算，这和上述稀释实验的灵敏度(10 IU/tube)相一致。然而RT-LAMP在检测HCV含量为1×103～1×104 IU/mL样本时重复性不好，有5例样本为假阴性，所以RT-LAMP的检测灵敏度为92.31%。另外，阴性样本的RT-PCR和RT-LAMP检测结果均与金标准(FQ-PCR)相一致，特异性均为100%。
用χ2检验分别判断RT-PCR和RT-LAMP与金标准的一致性(如表 3所示)，按照0.05检验水准，可知RT-LAMP和FQ-PCR差异没有统计学意义(P＞0.05)，一致性也较好(Kappa＞0.7)；而RT-PCR和FQ-PCR差异有统计学意义(P＜0.05), 一致性差(Kappa＜0.4)。
表3
RT-PCR和RT-LAMP与金标准的一致性
Table3.
Consistency of RT-LAMP and RT-PCR comparing to gold standard
3 讨论
目前PCR或FQ-PCR是主要的核酸检测手段[9-11]，但是这种方法存在设备昂贵、操作繁琐等缺点，不利于向基层医院推广。本研究利用RT-LAMP技术在等温条件下扩增HCV，不但省却了RT-PCR操作过程中的升温、降温等过程，在一定程度上降低了核酸以气溶胶形式对实验室的污染，而且通过向传统RT-LAMP体系中加入用于普通PCR扩增的Taq DNA聚合酶，启动了DNA合成的另一条途径，从而进一步提高了扩增效率。
虽然检测HCV的RT-LAMP技术也曾被研究过[12-15]，但是某些研究报道创新性差，尚存在需改进之处。例如李启明等[15]的RT-LAMP检测虽然也具有较好的灵敏度(接近10 IU/tube)，但是该方法的扩增效率低(90 min)，并且只靠裸眼观察浊度进行产物检测，而本研究和相关报道已证实这种方法不具有可靠性[16-17]。后来Kargar等使用可视性染料SYBR Green I进行结果检测[12-14]，然而SYBR Green I是非特异性双链DNA染色剂，无论是体系中扩增的、还是污染造成的DNA双链分子，都能嵌入其中而发出绿色荧光，因此假阳性率高。另外，SYBR Green I在体系中需具有较高的浓度才有利于肉眼判定结果，而高浓度的SYBR Green I会抑制扩增反应，故要在反应结束后开盖加入，开盖就会有气溶胶污染的可能，因此也会导致假阳性率升高。本研究使用钙黄绿素和HNB两种检测染料，不但不用开盖，避免了气溶胶污染，而且在特异性和灵敏度方面和电泳法的检测结果相一致。经临床样本检测，RT-LAMP与FQ-PCR的差异没有统计学意义，这是因为四条RT-LAMP引物需同时识别出靶序列上的6个特定区段才启动扩增反应，从而使特异性和灵敏度得到保证。由于仅需一台具有恒温功能的水浴箱即可完成操作，而且该技术的操作流程在很大程度上被简化，因此本研究建立的RT-LAMP技术具有应用于基层医疗机构的理论基础和实验经验。今后，如果基于该技术进行大规模临床样本的检测、自动化装置的开发和定量试剂盒的研制，增强其推广性和简易性，将会在防控疾病方面成为必不可少的有力工具。
