肺癌死亡率居世界肿瘤首位, 5年生存率不足15%, 顺铂耐药是死亡率居高不下的重要原因, 本文将探讨光敏剂MPPa介导的光动力疗法诱导人非小细胞肺癌顺铂耐药株A549/DDP发生凋亡的现象及其机制。课题组分别给予不同浓度光敏剂MPPa(0、1、2、4、8、16 μmol/L)、不同能量光照(0、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8 J/cm2)处理细胞, CCK-8法检测细胞活性。将细胞分为对照组、MPPa组(2 μmol/L MPPa)、光照组(2.4 J/cm2光能量密度)和MPPa介导光动力组(PDT组)(2 μmol/L MPPa、2.4 J/cm2光能量密度)。应用Anne-V/PI双染流式细胞技术检测细胞凋亡; DCFH-DA染色观察细胞内活性氧产生; 蛋白质印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达。实验结果显示, 单纯光照及MPPa对细胞生长无抑制作用; MPPa介导光动力却对人肺癌耐顺铂细胞A549/DDP有显著杀伤作用, 其杀伤作用呈明显的剂量效应关系(P＜0.05);PDT组发生凋亡率均高于各对照组(P＜0.05);DCFH-DA染色发现PDT组细胞内活性氧明显高于各对照组; Western blot检测发现PDT组Bax蛋白表达升高, Bcl-2蛋白表达降低。实验证实MPPa介导的光动力疗法可抑制肺癌顺铂耐药细胞A549/DDP活性, 并诱导其凋亡。
引用本文： 罗丽, 于廷和, 白定群, 胡丽娜. MPPa光动力疗法诱导人肺癌顺铂耐药细胞凋亡. 生物医学工程学杂志, 2016, 33(4): 729-734. doi: 10.7507/1001-5515.20160119 复制
引言
肺癌发病率及致死率位居全世界癌症之首[1-2], 即使近三十年来靶向治疗等手段用于临床，但其五年生存率仍只有15%[3]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的80％以上，其一线化疗方案是以顺铂为基础的联合化疗[4-5]，但耐药性的产生会导致治疗失败，因此寻找治疗耐药肺癌的手段迫在眉睫。光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是一种物理治疗[6]，其原理是将光敏剂富集于肿瘤细胞后，经过特定波长的光激发，产生具有细胞毒性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，从而导致肿瘤细胞死亡[7]。MPPa(pyropheophorbide-a methyl ester)是第二代光敏剂，性质稳定, 量子产率较高[8]。MPPa介导PDT对顺铂耐药细胞的效应报道较少，本课题将探讨MPPa介导的PDT对顺铂耐药的人非小细胞肺癌细胞A549/DDP的杀伤作用，为其应用于肺癌耐药的治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
半导体发生二极管(light emitting diode, LED)光源由本课题组自行研制(波长630 nm、连续输出方式、光功率密度30 mW/cm2)，光能量密度(J/cm2)=光功率密度(mW/cm2)×光照时间(s)。光敏剂MPPa：美国Sigma-Aldrich公司；RMPI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶：美国HyClone公司；CCK-8：日本同仁公司；Anne-V/PI双染检测试剂盒：美国凯基生物技术有限公司；B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)蛋白、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗体：美国Abcam公司。
1.2 细胞
人非小细胞肺癌顺铂耐药株A549/DDP由重庆医科大学生命科学院廖飞教授惠赠(耐药指数＞4)，采用RPMI 1640细胞培养基(含10%胎牛血清、50 μg/mL青霉素、50 μg/mL链霉素)置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养。培养基中加入2 μg/mL顺铂共同培养以保持耐药性，细胞用于实验前常规脱药7天。
1.3 CCK-8检测细胞活性
1.3.1 检测单纯光照对细胞活性影响
取对数生长期的A549/DDP细胞按5×103个/孔接种于96孔板，细胞贴壁后给予不同能量光照(0、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8 J/cm2)，24 h后加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育1 h，测量细胞活性。
1.3.2 检测单纯MPPa对细胞活性影响
种板同上，细胞贴壁后各孔加入含不同浓度MPPa(0、1、2、4、8、16 μmol/L)的完全培养基，继续培养12 h后换液，培养基中加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育1 h后测量细胞活性。
1.3.3 检测PDT对细胞活性影响
种板同上，细胞贴壁后加入2 μmol/L MPPa孵育12 h后换液，给予2.4 J/cm2能量密度光照，24 h后加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育1 h，测细胞活性。
1.3.4 细胞活性计算方式
应用酶标仪在450 nm处检测各孔光密度值[D(450)]，计算细胞活性。细胞活性=[实验组D(450)值－本底组D(450)值]∕[对照组D(450)值－本底组D(450)值]。本底组仅加入完全培养基，对照组含细胞和完全培养基，实验组分别按上述方法给予光照、MPPa或PDT进行处理。每组重复3次。
1.4 细胞分组
取对数生长期的A549/DDP细胞按5×103个/孔接种于96孔板，贴壁后随机分为对照组、MPPa组、光照组和PDT组，各组设复孔5个。对照组：给予完全培养基常规培养。MPPa组：给予2 μmol/L MPPa处理12 h。光照组：给予2.4 J/cm2光能量密度光照。PDT组：予2 μmol/L MPPa孵育12 h后换液再给予2.4 J/cm2光能量密度光照。
1.5 Anne-V/PI检测细胞凋亡
按1.4节所述细胞分组及处理，24 h后弃去培养液，PBS缓冲液轻柔洗涤细胞两遍，胰酶消化收集细胞。在每个处理组中加入200 μL binding buffer液重悬细胞后，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，再加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)染料，混匀，室温下避光反应15 min，随即用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。
1.6 DCFH-DA染色检测细胞内ROS
按1.4节所述细胞分组及处理，1 h后弃去培养基，PBS洗涤2遍，加入含10 μmol/L DCFH-DA的无血清培养基，避光孵育30 min，PBS漂洗2遍，倒置荧光显微镜下观察并照相。显示绿色荧光则代表产生ROS。
1.7 Western blot检测蛋白表达
按1.4节所述细胞分组及处理，24 h后弃去培养基，4 ℃预冷的PBS轻柔漂洗2遍，加入裂解液(RAPI：PMSF=1：100)冰浴10 min，提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度，绘制标准曲线，计算各个蛋白样品浓度，并配平。按体积比6×蛋白Loading Buffer：蛋白=1：5的比例，将6×蛋白Loading Buffer及蛋白混匀，沸水浴15 min。根据各蛋白分子量选择并配置适宜浓度的分离胶及浓缩胶。加样时第一孔加入Marker 5 μL，再依次加入各组蛋白(等浓度)20μL；恒压电泳(浓缩胶80 V、1 h，分离胶100 V、 1 h)，见溴酚蓝到达分离胶底端，电泳结束。250 mA、 100 V恒压转入PVDF膜，2 h。5%脱脂牛奶常温封闭1 h，加入一抗(1：1 000稀释)4 ℃过夜，TBST漂洗3×10 min，加入二抗(1：1 000稀释)室温孵育2 h，TBST漂洗3×10 min，ECL化学发光法显示条带，GAPDH为内参。
1.8 统计学分析
实验数据以均数±标准差(
2 结果
2.1 光照、MPPa及PDT分别对细胞活性的影响
单纯光照在能量密度为0～28.8 J/cm2范围内对A549/DDP细胞生长无抑制作用。MPPa对细胞活性的抑制作用呈剂量依赖性，当MPPa浓度＜2 μmol/L时，细胞活性＞85%，说明低浓度MPPa无细胞暗毒性。PDT对细胞活性随能量密度增加，细胞活性降低；当能量密度为2.4 J/cm2时，细胞活性为45.51%±0.47%，如图 1所示。
图1
光照、MPPa及PDT对细胞活性的影响
Figure1.
Effects of light, MPPa and PDT on cell viability
2.2 PDT诱导凋亡
如图 2所示，对照组、光照组、MPPa组及PDT组的凋亡率分别为5.91%±2.49%、5.80%±3.81%、6.14%±1.14%、30.60%±3.52%。PDT组凋亡率明显高于对照组、光照组及MPPa组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；对照组、光照组和MPPa组组间差异无统计学意义(P＞0.05)。
图2
流式检测细胞凋亡
Figure2.
Cell apoptotic detected with flow cytometry
2.3 PDT诱导A549/DDP细胞内ROS产生
绿色荧光代表产生ROS，如图 3所示，对照组、光照组、MPPa组几乎无绿色荧光表达，而PDT组绿色荧光较强，明显高于对照组、光照组及MPPa组，说明对照组、光照组、MPPa组无ROS产生，PDT促使A549/DDP细胞内ROS含量明显增加(如图 3所示)。
图3
DCFH-DA染色检测细胞内ROS(绿色荧光标记ROS)
Figure3.
Detection of ROS with DCFH-DA staining
2.4 PDT对凋亡相关蛋白表达的影响
如图 4所示，在对照组、光照组和MPPa组中，促凋亡蛋白Bax呈低表达，PDT组Bax表达明显高于对照组、光照组和MPPa组；Bax表达在对照组、光照组和MPPa组组间差异无统计学意义。抑制凋亡蛋白Bcl-2在对照组、光照组和MPPa组中呈高表达，而在PDT组中表达明显降低；Bcl-2表达在对照组、光照组及MPPa组组间差异无统计学意义(如图 4所示)。
图4
蛋白印迹法检测Bax、Bcl-2的表达
Figure4.
Expression of Bax and Bcl-2 proteins assessed by Western blot analysis
3 讨论
目前肺癌严重威胁着人类生命健康，而传统的治疗方法均存在一定局限性。以铂类为基础的联合化疗是治疗肺癌的标准化疗方案。顺铂通过与DNA发生加合，损伤DNA，诱导细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用。然而NSCLC顺铂耐药发生率高，且顺铂耐药机制复杂，主要包括：细胞内顺铂含量减少、DNA修复能力增强和药物去活作用增加等[9]。基于以上原因，要寻找到合适的耐药修饰剂困难，目前尚无理想的顺铂耐药逆转剂应用于临床。PDT是一种非侵入性的物理疗法，可用于杀伤肿瘤细胞、细菌、病毒和其他微生物，其三大要素是光、光敏剂和氧。本实验旨在探讨PDT对顺铂耐药肺癌细胞增殖的影响及可能的机制，为治疗顺铂耐药肺癌提供实验室依据。
PDT具有安全无毒、副作用小的优点[10]。本实验结果表明单独光照或低剂量MPPa对细胞生长无抑制作用，这就避免了光照和光敏剂对正常组织产生毒性。光敏剂进入体内会相对富集于肿瘤组织，经局部光照激发形成级联反应，产生ROS，导致细胞死亡，从而实现局部靶向性[11]。在本实验中，PDT能有效抑制顺铂耐药细胞增殖，PDT组凋亡率明显高于对照组、光照组及MPPa组。同时我们对PDT诱导凋亡的机制进行了研究。MPPa经光照射后从单线基态(S0)激发到第一激发单重态(S1)并快速回到基态；或激发形成较长时间存在的激发三重态(T1)，通过能量跃迁产生ROS[12]。实验结果显示，PDT组ROS产量明显增加。有研究表明PDT介导的细胞死亡主要是因为具有强氧化性的ROS损伤线粒体，细胞势能下降，细胞色素C释放入胞质，细胞色素C联合Apf-1和procaspase-9产生凋亡小体，激活caspase-9，-2，-3，-6，-7和水解酶，导致细胞蛋白水解、DNA断裂，最终引起细胞死亡[13]。也有研究认为细胞应激时内质网和线粒体接触部位P53增加，通过ER-Ca2+-ATP酶增加Ca2+水平，Ca2+超负荷引起线粒体通透性增加，线粒体发生肿胀、破裂，释放促凋亡因子，激活caspase级联反应，从而诱发凋亡[14]。于是我们检测了线粒体凋亡途径相关蛋白的表达情况，发现PDT组促凋亡蛋白Bax表达增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达降低。Bcl-2与Bax的表达在线粒体凋亡途径中至关重要。在氧化应激状态下，ROS可激活p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK), 氨基端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK), 细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)和Akt通路，从而改变Bcl-2家族成员功能[15]。过氧化氢(H2O2)通过形成Cys-62/Cys-126二硫键诱导Bax形成同型二聚体，增加线粒体通透性，促进细胞色素C及促凋亡因子释放，诱导凋亡[16]。
综上所述，本研究证实MPPa介导的光动力学疗法能够通过产生ROS、激活线粒体凋亡通路从而抑制顺铂耐药的肺癌细胞A549/DDP增殖，诱导其发生凋亡。因光照激发光敏剂产生的ROS半衰期极短，扩散距离＜100 nm，故光损伤的部位取决于所用光敏剂在细胞中的亚定位[17]。有研究认为富集于线粒体和内质网的光敏剂常诱发凋亡, 富集于细胞膜或溶酶体的光敏剂常诱发坏死[18]。PDT还可诱导自噬的发生[19]。细胞的死亡形式不是单因素决定的，它取决于细胞类型、光敏剂浓度、光的类型和剂量[20]。无论何种细胞死亡方式，PDT都为肿瘤治疗提供了一种新方法。研究报道吲哚菁绿介导的PDT与VP-16联用具有协同效应，与铂类药物联用具有加和或协同效应[21]。这表明PDT将有望增敏化疗，对于无法承受常规化疗剂量的病例具有深远的意义。在下一步工作中，我们将对PDT与化疗药物之间的相互作用进行深入探讨，为其在降低治疗副反应、降低化疗药物剂量、克服耐药等方面提供更有力的证据。
引言
肺癌发病率及致死率位居全世界癌症之首[1-2], 即使近三十年来靶向治疗等手段用于临床，但其五年生存率仍只有15%[3]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的80％以上，其一线化疗方案是以顺铂为基础的联合化疗[4-5]，但耐药性的产生会导致治疗失败，因此寻找治疗耐药肺癌的手段迫在眉睫。光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是一种物理治疗[6]，其原理是将光敏剂富集于肿瘤细胞后，经过特定波长的光激发，产生具有细胞毒性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，从而导致肿瘤细胞死亡[7]。MPPa(pyropheophorbide-a methyl ester)是第二代光敏剂，性质稳定, 量子产率较高[8]。MPPa介导PDT对顺铂耐药细胞的效应报道较少，本课题将探讨MPPa介导的PDT对顺铂耐药的人非小细胞肺癌细胞A549/DDP的杀伤作用，为其应用于肺癌耐药的治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
半导体发生二极管(light emitting diode, LED)光源由本课题组自行研制(波长630 nm、连续输出方式、光功率密度30 mW/cm2)，光能量密度(J/cm2)=光功率密度(mW/cm2)×光照时间(s)。光敏剂MPPa：美国Sigma-Aldrich公司；RMPI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶：美国HyClone公司；CCK-8：日本同仁公司；Anne-V/PI双染检测试剂盒：美国凯基生物技术有限公司；B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)蛋白、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗体：美国Abcam公司。
1.2 细胞
人非小细胞肺癌顺铂耐药株A549/DDP由重庆医科大学生命科学院廖飞教授惠赠(耐药指数＞4)，采用RPMI 1640细胞培养基(含10%胎牛血清、50 μg/mL青霉素、50 μg/mL链霉素)置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养。培养基中加入2 μg/mL顺铂共同培养以保持耐药性，细胞用于实验前常规脱药7天。
1.3 CCK-8检测细胞活性
1.3.1 检测单纯光照对细胞活性影响
取对数生长期的A549/DDP细胞按5×103个/孔接种于96孔板，细胞贴壁后给予不同能量光照(0、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8 J/cm2)，24 h后加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育1 h，测量细胞活性。
1.3.2 检测单纯MPPa对细胞活性影响
种板同上，细胞贴壁后各孔加入含不同浓度MPPa(0、1、2、4、8、16 μmol/L)的完全培养基，继续培养12 h后换液，培养基中加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育1 h后测量细胞活性。
1.3.3 检测PDT对细胞活性影响
种板同上，细胞贴壁后加入2 μmol/L MPPa孵育12 h后换液，给予2.4 J/cm2能量密度光照，24 h后加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育1 h，测细胞活性。
1.3.4 细胞活性计算方式
应用酶标仪在450 nm处检测各孔光密度值[D(450)]，计算细胞活性。细胞活性=[实验组D(450)值－本底组D(450)值]∕[对照组D(450)值－本底组D(450)值]。本底组仅加入完全培养基，对照组含细胞和完全培养基，实验组分别按上述方法给予光照、MPPa或PDT进行处理。每组重复3次。
1.4 细胞分组
取对数生长期的A549/DDP细胞按5×103个/孔接种于96孔板，贴壁后随机分为对照组、MPPa组、光照组和PDT组，各组设复孔5个。对照组：给予完全培养基常规培养。MPPa组：给予2 μmol/L MPPa处理12 h。光照组：给予2.4 J/cm2光能量密度光照。PDT组：予2 μmol/L MPPa孵育12 h后换液再给予2.4 J/cm2光能量密度光照。
1.5 Anne-V/PI检测细胞凋亡
按1.4节所述细胞分组及处理，24 h后弃去培养液，PBS缓冲液轻柔洗涤细胞两遍，胰酶消化收集细胞。在每个处理组中加入200 μL binding buffer液重悬细胞后，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，再加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)染料，混匀，室温下避光反应15 min，随即用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。
1.6 DCFH-DA染色检测细胞内ROS
按1.4节所述细胞分组及处理，1 h后弃去培养基，PBS洗涤2遍，加入含10 μmol/L DCFH-DA的无血清培养基，避光孵育30 min，PBS漂洗2遍，倒置荧光显微镜下观察并照相。显示绿色荧光则代表产生ROS。
1.7 Western blot检测蛋白表达
按1.4节所述细胞分组及处理，24 h后弃去培养基，4 ℃预冷的PBS轻柔漂洗2遍，加入裂解液(RAPI：PMSF=1：100)冰浴10 min，提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度，绘制标准曲线，计算各个蛋白样品浓度，并配平。按体积比6×蛋白Loading Buffer：蛋白=1：5的比例，将6×蛋白Loading Buffer及蛋白混匀，沸水浴15 min。根据各蛋白分子量选择并配置适宜浓度的分离胶及浓缩胶。加样时第一孔加入Marker 5 μL，再依次加入各组蛋白(等浓度)20μL；恒压电泳(浓缩胶80 V、1 h，分离胶100 V、 1 h)，见溴酚蓝到达分离胶底端，电泳结束。250 mA、 100 V恒压转入PVDF膜，2 h。5%脱脂牛奶常温封闭1 h，加入一抗(1：1 000稀释)4 ℃过夜，TBST漂洗3×10 min，加入二抗(1：1 000稀释)室温孵育2 h，TBST漂洗3×10 min，ECL化学发光法显示条带，GAPDH为内参。
1.8 统计学分析
实验数据以均数±标准差(
2 结果
2.1 光照、MPPa及PDT分别对细胞活性的影响
单纯光照在能量密度为0～28.8 J/cm2范围内对A549/DDP细胞生长无抑制作用。MPPa对细胞活性的抑制作用呈剂量依赖性，当MPPa浓度＜2 μmol/L时，细胞活性＞85%，说明低浓度MPPa无细胞暗毒性。PDT对细胞活性随能量密度增加，细胞活性降低；当能量密度为2.4 J/cm2时，细胞活性为45.51%±0.47%，如图 1所示。
图1
光照、MPPa及PDT对细胞活性的影响
Figure1.
Effects of light, MPPa and PDT on cell viability
2.2 PDT诱导凋亡
如图 2所示，对照组、光照组、MPPa组及PDT组的凋亡率分别为5.91%±2.49%、5.80%±3.81%、6.14%±1.14%、30.60%±3.52%。PDT组凋亡率明显高于对照组、光照组及MPPa组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；对照组、光照组和MPPa组组间差异无统计学意义(P＞0.05)。
图2
流式检测细胞凋亡
Figure2.
Cell apoptotic detected with flow cytometry
2.3 PDT诱导A549/DDP细胞内ROS产生
绿色荧光代表产生ROS，如图 3所示，对照组、光照组、MPPa组几乎无绿色荧光表达，而PDT组绿色荧光较强，明显高于对照组、光照组及MPPa组，说明对照组、光照组、MPPa组无ROS产生，PDT促使A549/DDP细胞内ROS含量明显增加(如图 3所示)。
图3
DCFH-DA染色检测细胞内ROS(绿色荧光标记ROS)
Figure3.
Detection of ROS with DCFH-DA staining
2.4 PDT对凋亡相关蛋白表达的影响
如图 4所示，在对照组、光照组和MPPa组中，促凋亡蛋白Bax呈低表达，PDT组Bax表达明显高于对照组、光照组和MPPa组；Bax表达在对照组、光照组和MPPa组组间差异无统计学意义。抑制凋亡蛋白Bcl-2在对照组、光照组和MPPa组中呈高表达，而在PDT组中表达明显降低；Bcl-2表达在对照组、光照组及MPPa组组间差异无统计学意义(如图 4所示)。
图4
蛋白印迹法检测Bax、Bcl-2的表达
Figure4.
Expression of Bax and Bcl-2 proteins assessed by Western blot analysis
3 讨论
目前肺癌严重威胁着人类生命健康，而传统的治疗方法均存在一定局限性。以铂类为基础的联合化疗是治疗肺癌的标准化疗方案。顺铂通过与DNA发生加合，损伤DNA，诱导细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用。然而NSCLC顺铂耐药发生率高，且顺铂耐药机制复杂，主要包括：细胞内顺铂含量减少、DNA修复能力增强和药物去活作用增加等[9]。基于以上原因，要寻找到合适的耐药修饰剂困难，目前尚无理想的顺铂耐药逆转剂应用于临床。PDT是一种非侵入性的物理疗法，可用于杀伤肿瘤细胞、细菌、病毒和其他微生物，其三大要素是光、光敏剂和氧。本实验旨在探讨PDT对顺铂耐药肺癌细胞增殖的影响及可能的机制，为治疗顺铂耐药肺癌提供实验室依据。
PDT具有安全无毒、副作用小的优点[10]。本实验结果表明单独光照或低剂量MPPa对细胞生长无抑制作用，这就避免了光照和光敏剂对正常组织产生毒性。光敏剂进入体内会相对富集于肿瘤组织，经局部光照激发形成级联反应，产生ROS，导致细胞死亡，从而实现局部靶向性[11]。在本实验中，PDT能有效抑制顺铂耐药细胞增殖，PDT组凋亡率明显高于对照组、光照组及MPPa组。同时我们对PDT诱导凋亡的机制进行了研究。MPPa经光照射后从单线基态(S0)激发到第一激发单重态(S1)并快速回到基态；或激发形成较长时间存在的激发三重态(T1)，通过能量跃迁产生ROS[12]。实验结果显示，PDT组ROS产量明显增加。有研究表明PDT介导的细胞死亡主要是因为具有强氧化性的ROS损伤线粒体，细胞势能下降，细胞色素C释放入胞质，细胞色素C联合Apf-1和procaspase-9产生凋亡小体，激活caspase-9，-2，-3，-6，-7和水解酶，导致细胞蛋白水解、DNA断裂，最终引起细胞死亡[13]。也有研究认为细胞应激时内质网和线粒体接触部位P53增加，通过ER-Ca2+-ATP酶增加Ca2+水平，Ca2+超负荷引起线粒体通透性增加，线粒体发生肿胀、破裂，释放促凋亡因子，激活caspase级联反应，从而诱发凋亡[14]。于是我们检测了线粒体凋亡途径相关蛋白的表达情况，发现PDT组促凋亡蛋白Bax表达增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达降低。Bcl-2与Bax的表达在线粒体凋亡途径中至关重要。在氧化应激状态下，ROS可激活p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK), 氨基端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK), 细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)和Akt通路，从而改变Bcl-2家族成员功能[15]。过氧化氢(H2O2)通过形成Cys-62/Cys-126二硫键诱导Bax形成同型二聚体，增加线粒体通透性，促进细胞色素C及促凋亡因子释放，诱导凋亡[16]。
综上所述，本研究证实MPPa介导的光动力学疗法能够通过产生ROS、激活线粒体凋亡通路从而抑制顺铂耐药的肺癌细胞A549/DDP增殖，诱导其发生凋亡。因光照激发光敏剂产生的ROS半衰期极短，扩散距离＜100 nm，故光损伤的部位取决于所用光敏剂在细胞中的亚定位[17]。有研究认为富集于线粒体和内质网的光敏剂常诱发凋亡, 富集于细胞膜或溶酶体的光敏剂常诱发坏死[18]。PDT还可诱导自噬的发生[19]。细胞的死亡形式不是单因素决定的，它取决于细胞类型、光敏剂浓度、光的类型和剂量[20]。无论何种细胞死亡方式，PDT都为肿瘤治疗提供了一种新方法。研究报道吲哚菁绿介导的PDT与VP-16联用具有协同效应，与铂类药物联用具有加和或协同效应[21]。这表明PDT将有望增敏化疗，对于无法承受常规化疗剂量的病例具有深远的意义。在下一步工作中，我们将对PDT与化疗药物之间的相互作用进行深入探讨，为其在降低治疗副反应、降低化疗药物剂量、克服耐药等方面提供更有力的证据。
