为了解决当前纳米银抗菌凝胶体外细胞毒性大、用光引发法制备纳米银时其颗粒尺寸和尺寸分布范围大的问题，本研究采用了物理交联法制备壳聚糖凝胶，由于采用泊洛沙姆作为制备纳米银的分散剂，制备出生物相容性更好且抗菌效果良好的纳米银抗菌凝胶。本研究加入泊洛沙姆作为纳米银分散剂以光引发法制备纳米银，并对制备的纳米银混合液与烘干后颗粒分别进行紫外可见吸收光谱实验和扫描电镜（SEM）实验。研究采用以碳酸氢钠对凝胶pH值进行调节的方法形成凝胶，并对其进行pH值测试、凝胶断面的SEM测试、溶胀率测试、黏度测试、抑菌圈实验以及体外细胞毒性实验。测试结果显示，当以超纯水为溶剂时，以泊洛沙姆为分散剂所制备出的纳米银的最大吸收波长为414 nm，平均粒径约为60 nm，相比于以聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为分散剂或以蒸馏水为溶剂时所制备出的纳米银具有更小的粒径以及更窄的粒径分布。所制备出的凝胶的pH值介于5.8~6.1之间，呈弱酸性。干燥后的凝胶断面具有较多孔洞，凝胶的吸水性良好，且黏度适宜，易于涂布于纱布上。此外，所制备出的凝胶在24、18、12 μg/mL的纳米银浓度下具有较好的抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的能力，且在纳米银浓度为24 μg/mL以下时均具有良好的生物相容性。基于以上特性，该纳米银抗菌凝胶有望应用于烧创伤口的治疗。
引用本文： 李达恒, 余学飞, 胡云睿, 奚廷斐, 陈嘉, 张志雄. 壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶的制备与表征. 生物医学工程学杂志, 2016, 33(6): 1124-1132. doi: 10.7507/1001-5515.20160179 复制
引言
纳米银通常指粒径小于100 nm的金属银单质。由于纳米银的表面效应，同等浓度下其抑菌能力要明显好于大颗粒的银单质。此外，纳米尺度的银单质比银离子具有更好的抑菌效果。在医疗领域使用的过程中，银单质不会像抗生素那样因为细菌的耐药性而导致药效丧失。正因如此，纳米银在医疗卫生领域的应用成为了近年来研究的热点。目前，已有纳米银抗菌纤维、纳米银抗菌凝胶和纳米银抗菌敷料等医疗产品相继问世,其应用范围包括了痤疮、前列腺炎、癣、妇科疾病以及烧伤、创伤等的治疗。
纳米银抗菌凝胶因其具有广谱抗菌、吸附组织渗出液等优点，常用于皮肤烧伤[1]、妇科疾病[2-3]等的治疗，目前已经有多种纳米银抗菌凝胶产品面世。然而，中国市场上大多数纳米银抗菌凝胶产品都具有3级及以上的细胞毒性[4]，其毒性主要来自过高的纳米银浓度以及凝胶基质本身[5]。一般来说，当纳米银剂量大于25 μg/mL时，会有比较大的细胞毒性(≥3级)[6]。因此，除了在制备过程中要保证纳米银颗粒的均匀分散外，控制纳米银的剂量、降低凝胶基质细胞毒性也是改进纳米银抗菌凝胶的重要方面。本研究一方面以保证纳米银的抗菌效果为前提，控制纳米银的浓度和粒径分布；另一方面使用物理交联法制备抗菌凝胶，降低凝胶基质的体外细胞毒性。
抗菌凝胶的基质材料主要有明胶、海藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素钠、果胶、壳聚糖等[7-8]。与其他基质材料不同，壳聚糖除了具备形成凝胶基质的能力，其本身还具有一定抗菌活性[9-10]，因此本研究选用壳聚糖为凝胶基质。形成壳聚糖凝胶的方法有戊二醛法[11]、物理交联法[12](可通过调节pH值来实现)等。戊二醛法中的戊二醛细胞毒性较大，且不易去除。故本研究采用物理交联法形成壳聚糖凝胶，不引入有毒的交联剂，从而减少凝胶整体的细胞毒性。另外，在制备纳米银的过程中，如何均匀分散纳米银颗粒，是稳定发挥纳米银抗菌性能的关键。一般用作纳米银分散剂的试剂为聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)[13]等，而本研究采用了泊洛沙姆作为一种新的纳米银分散剂。因为泊洛沙姆是聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，在眼用凝胶等方面具有广泛应用，且具有良好的生物相容性[14]。此外它还是一种表面活性剂，它能更好地把纳米银颗粒均匀分散，进而充分发挥纳米银的抑菌效果。因此，在制备纳米银和制备含纳米银抗菌凝胶两个过程中，都添加了泊洛沙姆，分别作为形成纳米银所需的分散剂和形成抗菌凝胶的基质。
本研究首先通过光引发法制备出了纳米银，并对其混合液和烘干后的颗粒进行表征。其次，将制备好的纳米银分散液引入到凝胶体系中，分别制备出以壳聚糖和以壳聚糖-泊洛沙姆为基质的纳米银抗菌凝胶，并对其进行干凝胶断面的扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)实验和溶胀率(swelling ratio,SR)实验，选出最佳的基质。之后，分别制备不同纳米银浓度的抗菌凝胶，并通过测试不同浓度(24、18、12、6、3、0 μg/mL)纳米银凝胶的体外细胞毒性与抑菌效果，选出最佳浓度的纳米银抗菌凝胶。最后，将选出的最佳浓度的凝胶样品进行pH值测试和黏度测试。
1 材料与方法
1.1 材料
壳聚糖购自成都西亚化工股份有限公司，高黏度，分子量为100~300 kD。硝酸银购自国药集团化学试剂有限公司。泊洛沙姆407购自德国巴斯夫公司。柠檬酸三钠购自广东汕头市西陇化工厂。药用级聚维酮K-30(PVP)购自杭州普修生物科技有限公司。冰醋酸、碳酸氢钠、丙三醇购自广东光华科技股份有限公司。
1.2 纳米银分散液的制备
纳米银分散液的制备基于和俊等[15]的制备方法。取400 mg硝酸银加入1 L蒸馏水或超纯水中，充分搅拌均匀。磁力搅拌下(1 600 r/min)，加入300 mg PVP或300 mg泊洛沙姆407作为分散剂。搅拌均匀后，加入300 mg柠檬酸三钠，打开紫外灯，在紫外灯照射以及磁力搅拌下反应4~5 h即可得到纳米银混合液。一方面，将所得混合液用于紫外可见吸收光谱实验。另一方面，将所得液体进行离心，弃去上清液，用蒸馏水或超纯水稀释后离心。重复上述步骤2次以洗去未反应的硝酸银和分散剂。最后，将离心得到的纳米银沉淀进行烘干。称取适量纳米银和泊洛沙姆，制备浓度为240 μg/mL的纳米银分散液。
1.3 纳米银抗菌凝胶的制备
物理凝胶的制备方法基于唐奚敏[16]的研究。取6个标记为0~5的50 mL烧杯，分别加入15 mL蒸馏水和200 μL冰醋酸(分析纯，＞99.0%)。其次，向0~5号烧杯中分别加入0、250、500、1 000、 1 500、 2 000 μL之前已制备的纳米银分散液。然后分别滴加600 μL甘油(分析纯，＞99.0%)，搅拌使其充分溶解。之后分别向0~5号烧杯中加入50 mg泊洛沙姆407和0.42 g壳聚糖(平均分子量为Mη=200 000 D，脱乙酰度为95%)，搅拌均匀后放置过夜，使其充分溶胀并使其中的气泡排出。最后，分别向0~5号烧杯中滴加2 mL浓度为1 mol/L碳酸氢钠溶液，搅拌均匀后，滴加蒸馏水，配制成20 mL的溶胶体系，并静置几天等待其形成凝胶。所制成的6个凝胶样品的纳米银浓度分别为0、3、6、12、18、24 μg/mL。
1.4 所制备纳米银的表征
1.4.1 紫外吸收光谱实验
为了测试不同种类的水以及不同的分散剂对纳米银生成的影响，故制备了四组纳米银混合液样品进行紫外吸收光谱这一预实验，分别记为泊洛沙姆-蒸馏水组、PVP-蒸馏水组、泊洛沙姆-超纯水组、PVP-超纯水组。使用紫外可见分光光度计测量样品在300~500 nm紫外可见光波长范围的吸光度。
1.4.2 SEM实验
选取在紫外可见吸收光谱预实验中纳米银粒径较小的纳米银样品组进行SEM实验。取1~2滴纳米银分散液样品滴加到干净的载玻片上，在50 ℃的恒温烘箱内烘干后，进行表面镀金处理。之后在超高分辨率场发射扫描电子显微镜(仪器型号为Nova NanoSEM 430，荷兰FEI公司制造)上观察纳米银颗粒的微观结构。所选取的主要参数为：高压10 kV，高真空模式，扫描电镜模式(mode SE)。
1.5 纳米银抗菌凝胶的表征
1.5.1 凝胶断面的SEM实验
为了观察以壳聚糖(本研究所选浓度为2.1%)为凝胶基质以及以壳聚糖-泊洛沙姆(本研究所选浓度分别为2.1%、4‰)为凝胶基质的微观结构差异，参考1.3小节的制备方法分别制备壳聚糖凝胶样品与壳聚糖-泊洛沙姆凝胶样品(除了泊洛沙姆的量不同，其它成分的浓度都相同)后，经常温干燥且凝胶重量不再变化后得壳聚糖干凝胶与壳聚糖-泊洛沙姆干凝胶样品，切取适量干凝胶并对其断面分别进行表面镀金处理后进行SEM实验。实验在超高分辨率场发射扫描电子显微镜(仪器型号为Nova NanoSEM 430，荷兰FEI公司制造)上观察凝胶断面的微观结构。
1.5.2 溶胀率实验
为了测试泊洛沙姆的添加是否会影响凝胶体系的吸水能力，本项实验同样基于1.3小节的制备方法分别制备了壳聚糖抗菌凝胶与壳聚糖-泊洛沙姆抗菌凝胶(除了泊洛沙姆的量不同，其它成分的浓度都相同)。两组凝胶成胶前，将凝胶平铺于培养皿中，待其成胶后放入干燥剂使其得以充分干燥。待两次称量其重量不变后，将干燥后的干凝胶分割成1 cm×1 cm的薄片，每组分别取3片样品作为平行组，做好标记后分别称量其初始重量W0。之后将两组干凝胶的各6个样品置于生理盐水中，测量其溶胀率。另外，将两组干凝胶的另6个样品置于PBS溶液中，测量其溶胀率。当浸泡时间分别达到5 min、30 min、1 h、2 h、6 h、12 h和24 h时，将薄片取出，并用滤纸轻拭其表面以擦除薄片表面的水分，用分析天平分别对薄片进行测重(记为WS)之后，再次放入生理盐水或PBS溶液中等待下一次的测量。溶胀率的计算公式为SR(%)=100×(WS-W0)/W0。
1.5.3 体外细胞毒性实验
通过以上实验确定较适宜的凝胶基质后，为了测试不同纳米银浓度的抗菌凝胶的体外细胞毒性差异，本项实验按照1.3小节的制备方法分别制备6种不同纳米银浓度的凝胶样品进行测试。
① 细胞培养与接种:将L929细胞培养在含有10%胎牛血清的H-DMEM培养基中，并在5% CO2浓度、37 ℃环境下培养。培养基每三天替换一次。培养细胞贴壁使其达到80%左右的汇合度。细胞在培养基中传代，选取第5~10代的细胞进行实验。
把培养的细胞接种在24孔板中(5 000个/孔)，在含有10%胎牛血清的H-DMEM培养基中培养24 h。之后，根据ISO 10993-12 2007的标准，按照凝胶质量与浸提介质体积之比为1 g∶10 mL制备浸提液。其中浸提介质为含有10%胎牛血清的H-DMEM培养基。在(37±2)℃条件下浸提24 h后，取其浸提液，并用此浸提液再培养L929细胞24 h。
② CCK-8实验:在培养24 h后，使用CCK-8方法来评估凝胶的生物相容性。简要地说，在指定的时间点，将细胞用PBS溶液冲洗3次。然后每孔加入含有35 μL CCK-8溶液的350 μL完全培养基。在37 ℃、黑暗环境下培养2 h后，将培养液转移到新的96孔板中，每孔100 μL。使用ELISA plate reader在450 nm波长下测量溶液的光密度(optical density,OD)值。
③ 相对增殖率(relative growth rate，RGR)的计算:RGR=实验组OD450/对照组OD450×100%。
④ 体外细胞毒性反应评级具体如下：当相对增殖率≥100%时，对应细胞毒性评级为0级；当相对增殖率为80%~99%时，对应细胞毒性评级为1级；当相对增殖率为50%~79%时，对应细胞毒性评级为2级；当相对增殖率为30%~49%时，对应细胞毒性评级为3级；当相对增殖率为0~29%时，对应细胞毒性评级为4级。
1.5.4 抑菌圈实验
为了测试不同纳米银浓度的抗菌凝胶的抑菌能力差异，本项实验亦按照1.3小节的制备方法分别制备6种不同纳米银浓度的凝胶样品进行测试。将已活化好的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的细菌悬液(浓度各为108 CFU/mL的量级)分别取1~2 μL置于离心管中，用经过高压蒸汽灭菌处理的PBS溶液(pH=7.4)1 mL将细菌悬浊液稀释到105 CFU/mL的量级，轻轻振荡均匀后置于恒温培养箱中备用。使用平板涂布法，向已凝固冷却的琼脂培养基表面分别涂布稀释过的细菌悬液。使用打孔器，将培养基打出大小一致的孔洞(本实验所打孔洞直径为9 mm)，每个培养皿打3个孔洞，作为平行组。向打好的孔洞中注入凝胶样品。最后，将培养皿置于恒温培养箱中，37 ℃下培养24 h后测量抑菌圈大小。
1.5.5 pH值测试
根据2015年版《中国药典》第三部的要求，凝胶剂一般应检查其pH值，以防止pH值过高或过低对使用者造成损伤。通过以上实验确定了该凝胶体系中较适宜的纳米银添加浓度后，使用笔式pH计(仪器型号为PHB-5，杭州奥立龙仪器有限公司)对含有该纳米银浓度的凝胶样品的pH值进行测定。
1.5.6 黏度测试
本项实验选用旋转式黏度计(BROOKFIELD DV-Ⅱ+ Pro Viscometer)对上述确定纳米银浓度的凝胶样品进行黏度测试。凝胶样品选择在28.9 ℃环境下测试，并选用2号转子进行黏度测试。
2 结果
2.1 所制备纳米银的表征结果
2.1.1 紫外吸收光谱实验结果
泊洛沙姆-蒸馏水组、PVP-蒸馏水组、泊洛沙姆-超纯水组、PVP-超纯水组的紫外吸收光谱如图 1所示。
图1
纳米银混合液的紫外吸收光谱
Figure1.
UV-Vis absorption spectra of nano silver mixed solution
如图 1所示，泊洛沙姆-蒸馏水组、PVP-蒸馏水组、泊洛沙姆-超纯水组、PVP-超纯水组制成的纳米银的最大吸收波长分别为431、442、414与431 nm，数据显示以超纯水为溶剂的体系具有更小的最大吸收波长(提示其粒径较小)，因此选取泊洛沙姆-超纯水组与PVP-超纯水组进行SEM实验。
2.1.2 SEM实验结果
泊洛沙姆-超纯水组与PVP-超纯水组的SEM图像如图 2所示。
图2
纳米银颗粒的SEM图片
Figure2.
SEM images of silver nanoparticles
对比显示，PVP-超纯水组制成的纳米银的粒径分布较广，经统计计算，其粒径分布介于50~120 nm之间，图 2右上为被PVP包裹的纳米银颗粒；而由图 2左下可知，泊洛沙姆-超纯水组制成的纳米银的粒径分布较窄，经统计计算，其粒径分布介于45~85 nm之间，图 2右下为被泊洛沙姆包裹的纳米银颗粒。
所以，在用紫外光化学法制备纳米银时，有两个比较重要的因素能影响生成的纳米银的大小。一是溶剂的种类，使用超纯水制备的纳米银与使用蒸馏水制备的纳米银相比具有更小的粒径与粒径范围；二是分散剂的种类，使用泊洛沙姆作为分散剂制备出的纳米银相比于使用PVP作为分散剂制备出的纳米银具有更小的粒径与粒径范围。
2.2 纳米银抗菌凝胶的表征结果
2.2.1 凝胶断面的SEM实验结果
以壳聚糖为凝胶基质和以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的干凝胶的微观结构如图 3所示。
图3
干凝胶断面的SEM图片
Figure3.
SEM images of dried gel
由图 3可知，壳聚糖干凝胶的断面较为平滑平整，而壳聚糖-泊洛沙姆干凝胶的断面具有较多孔洞结构，且孔洞大小小于20 μm。由此可知，在壳聚糖的凝胶体系中，泊洛沙姆的引入会改变凝胶内部的微观结构，使其变得更蓬松。泊洛沙姆分子与壳聚糖分子的相互作用，会促使孔洞的形成。另外，根据壳聚糖与壳聚糖-泊洛沙姆的SEM图片，可大致判断，壳聚糖-泊洛沙姆凝胶的溶胀性要比壳聚糖凝胶的溶胀性好。
2.2.2 溶胀率实验结果
壳聚糖干凝胶和壳聚糖-泊洛沙姆干凝胶在PBS溶液和生理盐水溶液中的溶胀率如图 4所示。
由图 4左图可知，两组干凝胶在PBS溶液中浸泡时间为5 min时，两者的溶胀率皆已高于200%。在1 h内时，两者的溶胀率稳步上升并分别达到290%和460%的高峰。但当浸泡时间达到2 h时，开始出现下降。随后，随着浸泡时间的延长，其溶胀率也逐渐下降，24 h后两者的溶胀率分别降到94%和140%。由图还可明显地看到，无论在哪个时间点，壳聚糖-泊洛沙姆组干凝胶的溶胀率均明显高于壳聚糖组。
图4
两组干凝胶的溶胀率
Figure4.
Swelling ratio of the two groups of dried gel
由图 4右图可知，两组干凝胶在生理盐水溶液中浸泡时间为5 min时，两者的溶胀率亦皆高于200%。随后，随着浸泡时间的延长，两者的溶胀率也稳步增长，当浸泡时间为6 h时，两者的溶胀率已分别达到612%和920%。而当浸泡时间大于6 h时，由于干凝胶过度溶胀，两组样品均已变成非常柔软且没有固定形状的胶团，因此之后的溶胀率无法继续测量。
综上所述，无论在PBS溶液还是生理盐水溶液中，壳聚糖-泊洛沙姆凝胶的溶胀率均优于壳聚糖凝胶的溶胀率。在干凝胶断面SEM实验中的猜测得到了直接验证。
2.2.3 体外细胞毒性实验结果
不同纳米银浓度的抗菌凝胶的体外细胞毒性评级如图 5所示。
图5
不同纳米银浓度的抗菌凝胶的体外细胞毒性
Figure5.
In vitro cytotoxicity of antibacterial hydrogel with different silver nanoparticle concentrations
不同纳米银浓度的抗菌凝胶的体外细胞毒性分级都低于或等于2级，具有良好的细胞相容性。随着凝胶中纳米银浓度的增加，凝胶的体外细胞毒性也逐渐增加。其中，纳米银浓度分别为0、3、6μg/mL的三组的体外细胞毒性分级为1级，对应的相对增殖率分别为88.1%、82.5%、81.4%；纳米银浓度分别为12、18、24 μg/mL的三组的体外细胞毒性分级为2级，对应的相对增殖率分别为72.9%、61.5%、52.2%。
2.2.4 抑菌圈实验结果
不同纳米银浓度的抗菌凝胶在不同菌种中形成的抑菌圈的平均大小如图 6所示。
图6
不同纳米银浓度的抗菌凝胶在不同菌种中的抗菌特性
Figure6.
Antibacterial property of antibacterial hydrogel with different silver nanoparticle concentrations
由图 6可知，大肠杆菌组与金黄色葡萄球菌组都具有明显的抑菌圈，且两组数据的表现类似。在两组抑菌圈实验中，可以看到当凝胶样品的纳米银浓度为24 μg/mL与18 μg/mL时，抑菌圈大小没有明显差异，但随着浓度梯度的降低，抑菌圈随之变小。12 μg/mL组的抑菌圈已有明显缩小，而0、3、6 μg/mL三组的抑菌圈又进一步变小，且此三组对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的抑菌能力均无明显差异。另外，可以看到壳聚糖-泊洛沙姆空白凝胶组也具有一定的抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的能力。
通过综合不同纳米银浓度的抗菌凝胶在体外细胞毒性实验和抑菌圈实验中的结果，本研究优选出了12 μg/mL这一浓度作为壳聚糖-泊洛沙姆体系中纳米银的优选浓度。
2.2.5 pH值测试结果
所制备的纳米银抗菌凝胶的pH值为5.8~6.1，呈弱酸性。
2.2.6 黏度测试结果
以壳聚糖-泊洛沙姆为基质的抗菌凝胶的黏度如表 1所示。由表 1可知，随着转子转速的增加，凝胶的表观黏度越来越小。且转子速度越大，爬杆效应越明显，因此所制备的凝胶为非牛顿流体。
表1
纳米银抗菌凝胶的黏度
Table1.
Apparent viscosities of nano silver antibacterial hydrogel
3 讨论
金属纳米粒子的表面等离子共振吸收峰位置、半高宽和峰值强度分别与粒子大小、尺寸分布和金属纳米粒子的浓度有很大关系[13, 17]。吸收峰的位置基本上可以确定粒子的大小,在通常情况下,粒子越小,吸收峰的位置就越蓝移；吸收峰的半高宽越宽,粒子尺寸分布就越广泛；当吸收峰的位置和半高宽均不改变而吸收峰的峰值增大时,说明金属纳米粒子浓度增大,即单位体积内粒子数增多[17]。因此,在制备纳米银混合液后,可以利用紫外-可见光吸收光谱图来反映生成物粒子大小和尺寸分布范围。
由紫外吸收光谱实验可知，在同种溶剂的溶液体系中，添加泊洛沙姆的溶液体系相比于添加PVP的溶液体系具有更小的最大吸收波长。因此可推断添加泊洛沙姆的溶液体系中，生成的纳米银颗粒的平均粒径要小于添加PVP的溶液体系的纳米银颗粒。而在添加同种试剂的溶液体系中，以超纯水为溶剂的溶液体系相比于以蒸馏水为溶剂的溶液体系具有更小的最大吸收波长。因此可推断以超纯水为溶剂的溶液体系中，生成的纳米银颗粒的平均粒径要小于以蒸馏水为溶剂的溶液体系中的纳米银颗粒。为了验证以上推断，需要进行SEM实验来观察其形态特征。
在纳米银的SEM实验中，PVP-超纯水组制成的纳米银的粒径分布较广，其粒径分布介于50~120 nm之间；而泊洛沙姆-超纯水组制成的纳米银的粒径分布较窄，其粒径分布介于45~85 nm之间。不难发现，纳米银的粒径分布范围与在紫外吸收光谱实验中的半高宽基本成正比。另外，由于本研究所制备的纳米银的粒径中等，既避免了由于纳米银粒径过大而使其抗菌活性降低，也避免了由于其粒径过小而导致细胞毒性的上升[18]。此外，在图 2右侧两个图中，添加有PVP和泊洛沙姆的两组都可清楚地观察到纳米银颗粒被高分子材料包裹的情况，因此可以推测，高分子材料的包裹可避免纳米银颗粒在形成过程中发生聚集与沉淀，从而形成分散的纳米银溶液。
当壳聚糖分散于稀醋酸溶液中时，主要存在两个平衡关系，如式(1)和式(2)所示：
| $\text{C}{{\text{H}}_{\text{3}}}\text{COOH}\rightleftharpoons {{\text{H}}^{\text{+}}}\text{+C}{{\text{H}}_{\text{3}}}\text{CO}{{\text{O}}^{-}}$ |
此时的壳聚糖主要以Chitosan-NH3+的状态存在，分子链由于静电斥力的作用而完全舒展。当加入NaHCO3后，HCO3-与H+发生结合产生 CO2气体，溶液体系的pH值发生改变，平衡(2)向左移动，壳聚糖分子链上的氨基发生去质子化，静电斥力受到破坏，同时壳聚糖分子间的氢键作用和疏水作用加强[19]。随着pH值的缓慢变大，壳聚糖分子也逐渐收缩，在收缩过程中形成交联点，构成三维网状结构。在壳聚糖分子间形成交联点的过程中，泊洛沙姆分子中的羟基与壳聚糖分子中的氨基也可能会产生新的氢键，共同构成复杂的三维网络结构，形成凝胶。
在壳聚糖凝胶、壳聚糖-泊洛沙姆凝胶断面的SEM实验中，壳聚糖干凝胶断面结构较为致密，断面平滑规整，没有明显孔洞结构。而壳聚糖-泊洛沙姆干凝胶的断面较为疏松，断面具有较多最大直径小于20 μm的孔洞结构。由此可推断，孔洞的形成可能得益于泊洛沙姆分子链中的某些基团(例如-CH2-)与壳聚糖分子链中的某些基团(例如-NH2)发生了相互作用，形成了氢键交联点，从而进一步形成了孔洞。
在凝胶的溶胀率实验中，所制备的干凝胶具有很好吸水能力，并且添加有泊洛沙姆的壳聚糖凝胶基质的吸水能力明显优于不添加泊洛沙姆的壳聚糖凝胶基质。壳聚糖-泊洛沙姆凝胶在生理盐水溶液中浸泡6 h后，其溶胀率已超900%，并在之后仍能继续吸收水分，直到12 h后由于过度溶胀形成非常柔软的胶团。基于其优良的吸水能力，可以应用于体液渗出期的烧伤创面或伤口上。因为所制备的抗菌凝胶具有一定的吸收组织渗出液的作用，并在创口上形成潮湿的环境，且其本身具有一定抑菌抗感染的作用，因此有利于烧伤创面的更快愈合[20]。
通过综合两组干凝胶在SEM测试和溶胀率实验中的结果，本研究选择了壳聚糖-泊洛沙姆凝胶体系作为优选凝胶体系。
在抑菌圈实验结果中发现，纳米银浓度为24 μg/mL和18 μg/mL的两组的抑菌能力最强，其次为12 μg/mL的凝胶，而0、3、6 μg/mL的三组的抑菌能力相对较差。在凝胶中，无论纳米银含量的高低，甚至不含纳米银时，都具有一定的抗菌能力。因为纳米银颗粒与壳聚糖分子都具有一定的抑菌能力[21-24]。目前，关于纳米银颗粒的抑菌机制与壳聚糖的抑菌机制都还没有确切的结论。纳米银颗粒的抑菌机制主要有以下几个方面[22, 24]：银纳米粒子可能通过附着到细胞膜的表面来干扰细胞的渗透性及其呼吸功能；在相同质量的情况下，纳米银颗粒能比其他大颗粒拥有更大的表面积，从而具有更大的与微生物相互作用的空间；银纳米颗粒能与细菌膜上的含硫蛋白质发生相互作用，同时也与诸如DNA上的含磷化合物发生相互作用，从而使细菌失活；纳米银颗粒可在细菌内部释放银离子，它可提高其抗菌活性。壳聚糖的抑菌机制主要包括以下几个方面[24]：一是壳聚糖分子结构中存在带有正电荷的氨基，它易与表面带有负电荷的类脂-蛋白质、磷壁酸和荚膜多糖等的菌体发生结合，影响细菌正常的呼吸代谢和生理结构，从而使其失活；二是壳聚糖进入菌体内部通过与细菌生存所必需的成分如蛋白质等结合，破坏其代谢平衡，或选择性地螯合对微生物生长起关键作用的金属离子，尤其是酶的辅助因子，从而抑制微生物的生长和繁殖。最后，也可能同时与DNA相互作用，扰乱DNA的复制与转录。值得注意的是，本研究中，无论是含有纳米银的凝胶还是不含纳米银的凝胶，所实验的凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌效果都要比对大肠杆菌的效果要好。
通过体外细胞毒性实验结果发现，不含纳米银的凝胶具有优良的生物相容性，同样，含有低纳米银浓度的凝胶也具有优良的生物相容性。但是，随着纳米银浓度的升高，凝胶的生物相容性逐渐下降。当纳米银浓度为24 μg/mL时，L929细胞的相对增殖率进一步降至52.2%，细胞毒性评级几乎快达到3级。因此，制备过程中需要控制纳米银的浓度，来降低其细胞毒性。
因此，通过平衡抑菌圈实验和体外细胞毒性实验的结果，本研究选取了12 μg/mL的纳米银浓度作为壳聚糖-泊洛沙姆凝胶体系的最佳纳米银浓度。
最后，通过pH值测试和黏度测试发现，壳聚糖-泊洛沙姆凝胶呈弱酸性，酸碱度适中，且黏度良好，可作为综合考虑之选。
4 结论
本研究通过物理交联法制备了一种抗菌、较好吸水特性且具有良好生物相容性的纳米银抗菌凝胶。所制备的凝胶黏度适中，易于涂抹到纱布上。基于以上特性，该凝胶有望应用于体液渗出期的烧伤创面或伤口上。另外，通过平衡凝胶的抑菌能力与生物相容性，得到在该体系中最优的纳米银浓度约为12 μg/mL。
引言
纳米银通常指粒径小于100 nm的金属银单质。由于纳米银的表面效应，同等浓度下其抑菌能力要明显好于大颗粒的银单质。此外，纳米尺度的银单质比银离子具有更好的抑菌效果。在医疗领域使用的过程中，银单质不会像抗生素那样因为细菌的耐药性而导致药效丧失。正因如此，纳米银在医疗卫生领域的应用成为了近年来研究的热点。目前，已有纳米银抗菌纤维、纳米银抗菌凝胶和纳米银抗菌敷料等医疗产品相继问世,其应用范围包括了痤疮、前列腺炎、癣、妇科疾病以及烧伤、创伤等的治疗。
纳米银抗菌凝胶因其具有广谱抗菌、吸附组织渗出液等优点，常用于皮肤烧伤[1]、妇科疾病[2-3]等的治疗，目前已经有多种纳米银抗菌凝胶产品面世。然而，中国市场上大多数纳米银抗菌凝胶产品都具有3级及以上的细胞毒性[4]，其毒性主要来自过高的纳米银浓度以及凝胶基质本身[5]。一般来说，当纳米银剂量大于25 μg/mL时，会有比较大的细胞毒性(≥3级)[6]。因此，除了在制备过程中要保证纳米银颗粒的均匀分散外，控制纳米银的剂量、降低凝胶基质细胞毒性也是改进纳米银抗菌凝胶的重要方面。本研究一方面以保证纳米银的抗菌效果为前提，控制纳米银的浓度和粒径分布；另一方面使用物理交联法制备抗菌凝胶，降低凝胶基质的体外细胞毒性。
抗菌凝胶的基质材料主要有明胶、海藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素钠、果胶、壳聚糖等[7-8]。与其他基质材料不同，壳聚糖除了具备形成凝胶基质的能力，其本身还具有一定抗菌活性[9-10]，因此本研究选用壳聚糖为凝胶基质。形成壳聚糖凝胶的方法有戊二醛法[11]、物理交联法[12](可通过调节pH值来实现)等。戊二醛法中的戊二醛细胞毒性较大，且不易去除。故本研究采用物理交联法形成壳聚糖凝胶，不引入有毒的交联剂，从而减少凝胶整体的细胞毒性。另外，在制备纳米银的过程中，如何均匀分散纳米银颗粒，是稳定发挥纳米银抗菌性能的关键。一般用作纳米银分散剂的试剂为聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)[13]等，而本研究采用了泊洛沙姆作为一种新的纳米银分散剂。因为泊洛沙姆是聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，在眼用凝胶等方面具有广泛应用，且具有良好的生物相容性[14]。此外它还是一种表面活性剂，它能更好地把纳米银颗粒均匀分散，进而充分发挥纳米银的抑菌效果。因此，在制备纳米银和制备含纳米银抗菌凝胶两个过程中，都添加了泊洛沙姆，分别作为形成纳米银所需的分散剂和形成抗菌凝胶的基质。
本研究首先通过光引发法制备出了纳米银，并对其混合液和烘干后的颗粒进行表征。其次，将制备好的纳米银分散液引入到凝胶体系中，分别制备出以壳聚糖和以壳聚糖-泊洛沙姆为基质的纳米银抗菌凝胶，并对其进行干凝胶断面的扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)实验和溶胀率(swelling ratio,SR)实验，选出最佳的基质。之后，分别制备不同纳米银浓度的抗菌凝胶，并通过测试不同浓度(24、18、12、6、3、0 μg/mL)纳米银凝胶的体外细胞毒性与抑菌效果，选出最佳浓度的纳米银抗菌凝胶。最后，将选出的最佳浓度的凝胶样品进行pH值测试和黏度测试。
1 材料与方法
1.1 材料
壳聚糖购自成都西亚化工股份有限公司，高黏度，分子量为100~300 kD。硝酸银购自国药集团化学试剂有限公司。泊洛沙姆407购自德国巴斯夫公司。柠檬酸三钠购自广东汕头市西陇化工厂。药用级聚维酮K-30(PVP)购自杭州普修生物科技有限公司。冰醋酸、碳酸氢钠、丙三醇购自广东光华科技股份有限公司。
1.2 纳米银分散液的制备
纳米银分散液的制备基于和俊等[15]的制备方法。取400 mg硝酸银加入1 L蒸馏水或超纯水中，充分搅拌均匀。磁力搅拌下(1 600 r/min)，加入300 mg PVP或300 mg泊洛沙姆407作为分散剂。搅拌均匀后，加入300 mg柠檬酸三钠，打开紫外灯，在紫外灯照射以及磁力搅拌下反应4~5 h即可得到纳米银混合液。一方面，将所得混合液用于紫外可见吸收光谱实验。另一方面，将所得液体进行离心，弃去上清液，用蒸馏水或超纯水稀释后离心。重复上述步骤2次以洗去未反应的硝酸银和分散剂。最后，将离心得到的纳米银沉淀进行烘干。称取适量纳米银和泊洛沙姆，制备浓度为240 μg/mL的纳米银分散液。
1.3 纳米银抗菌凝胶的制备
物理凝胶的制备方法基于唐奚敏[16]的研究。取6个标记为0~5的50 mL烧杯，分别加入15 mL蒸馏水和200 μL冰醋酸(分析纯，＞99.0%)。其次，向0~5号烧杯中分别加入0、250、500、1 000、 1 500、 2 000 μL之前已制备的纳米银分散液。然后分别滴加600 μL甘油(分析纯，＞99.0%)，搅拌使其充分溶解。之后分别向0~5号烧杯中加入50 mg泊洛沙姆407和0.42 g壳聚糖(平均分子量为Mη=200 000 D，脱乙酰度为95%)，搅拌均匀后放置过夜，使其充分溶胀并使其中的气泡排出。最后，分别向0~5号烧杯中滴加2 mL浓度为1 mol/L碳酸氢钠溶液，搅拌均匀后，滴加蒸馏水，配制成20 mL的溶胶体系，并静置几天等待其形成凝胶。所制成的6个凝胶样品的纳米银浓度分别为0、3、6、12、18、24 μg/mL。
1.4 所制备纳米银的表征
1.4.1 紫外吸收光谱实验
为了测试不同种类的水以及不同的分散剂对纳米银生成的影响，故制备了四组纳米银混合液样品进行紫外吸收光谱这一预实验，分别记为泊洛沙姆-蒸馏水组、PVP-蒸馏水组、泊洛沙姆-超纯水组、PVP-超纯水组。使用紫外可见分光光度计测量样品在300~500 nm紫外可见光波长范围的吸光度。
1.4.2 SEM实验
选取在紫外可见吸收光谱预实验中纳米银粒径较小的纳米银样品组进行SEM实验。取1~2滴纳米银分散液样品滴加到干净的载玻片上，在50 ℃的恒温烘箱内烘干后，进行表面镀金处理。之后在超高分辨率场发射扫描电子显微镜(仪器型号为Nova NanoSEM 430，荷兰FEI公司制造)上观察纳米银颗粒的微观结构。所选取的主要参数为：高压10 kV，高真空模式，扫描电镜模式(mode SE)。
1.5 纳米银抗菌凝胶的表征
1.5.1 凝胶断面的SEM实验
为了观察以壳聚糖(本研究所选浓度为2.1%)为凝胶基质以及以壳聚糖-泊洛沙姆(本研究所选浓度分别为2.1%、4‰)为凝胶基质的微观结构差异，参考1.3小节的制备方法分别制备壳聚糖凝胶样品与壳聚糖-泊洛沙姆凝胶样品(除了泊洛沙姆的量不同，其它成分的浓度都相同)后，经常温干燥且凝胶重量不再变化后得壳聚糖干凝胶与壳聚糖-泊洛沙姆干凝胶样品，切取适量干凝胶并对其断面分别进行表面镀金处理后进行SEM实验。实验在超高分辨率场发射扫描电子显微镜(仪器型号为Nova NanoSEM 430，荷兰FEI公司制造)上观察凝胶断面的微观结构。
1.5.2 溶胀率实验
为了测试泊洛沙姆的添加是否会影响凝胶体系的吸水能力，本项实验同样基于1.3小节的制备方法分别制备了壳聚糖抗菌凝胶与壳聚糖-泊洛沙姆抗菌凝胶(除了泊洛沙姆的量不同，其它成分的浓度都相同)。两组凝胶成胶前，将凝胶平铺于培养皿中，待其成胶后放入干燥剂使其得以充分干燥。待两次称量其重量不变后，将干燥后的干凝胶分割成1 cm×1 cm的薄片，每组分别取3片样品作为平行组，做好标记后分别称量其初始重量W0。之后将两组干凝胶的各6个样品置于生理盐水中，测量其溶胀率。另外，将两组干凝胶的另6个样品置于PBS溶液中，测量其溶胀率。当浸泡时间分别达到5 min、30 min、1 h、2 h、6 h、12 h和24 h时，将薄片取出，并用滤纸轻拭其表面以擦除薄片表面的水分，用分析天平分别对薄片进行测重(记为WS)之后，再次放入生理盐水或PBS溶液中等待下一次的测量。溶胀率的计算公式为SR(%)=100×(WS-W0)/W0。
1.5.3 体外细胞毒性实验
通过以上实验确定较适宜的凝胶基质后，为了测试不同纳米银浓度的抗菌凝胶的体外细胞毒性差异，本项实验按照1.3小节的制备方法分别制备6种不同纳米银浓度的凝胶样品进行测试。
① 细胞培养与接种:将L929细胞培养在含有10%胎牛血清的H-DMEM培养基中，并在5% CO2浓度、37 ℃环境下培养。培养基每三天替换一次。培养细胞贴壁使其达到80%左右的汇合度。细胞在培养基中传代，选取第5~10代的细胞进行实验。
把培养的细胞接种在24孔板中(5 000个/孔)，在含有10%胎牛血清的H-DMEM培养基中培养24 h。之后，根据ISO 10993-12 2007的标准，按照凝胶质量与浸提介质体积之比为1 g∶10 mL制备浸提液。其中浸提介质为含有10%胎牛血清的H-DMEM培养基。在(37±2)℃条件下浸提24 h后，取其浸提液，并用此浸提液再培养L929细胞24 h。
② CCK-8实验:在培养24 h后，使用CCK-8方法来评估凝胶的生物相容性。简要地说，在指定的时间点，将细胞用PBS溶液冲洗3次。然后每孔加入含有35 μL CCK-8溶液的350 μL完全培养基。在37 ℃、黑暗环境下培养2 h后，将培养液转移到新的96孔板中，每孔100 μL。使用ELISA plate reader在450 nm波长下测量溶液的光密度(optical density,OD)值。
③ 相对增殖率(relative growth rate，RGR)的计算:RGR=实验组OD450/对照组OD450×100%。
④ 体外细胞毒性反应评级具体如下：当相对增殖率≥100%时，对应细胞毒性评级为0级；当相对增殖率为80%~99%时，对应细胞毒性评级为1级；当相对增殖率为50%~79%时，对应细胞毒性评级为2级；当相对增殖率为30%~49%时，对应细胞毒性评级为3级；当相对增殖率为0~29%时，对应细胞毒性评级为4级。
1.5.4 抑菌圈实验
为了测试不同纳米银浓度的抗菌凝胶的抑菌能力差异，本项实验亦按照1.3小节的制备方法分别制备6种不同纳米银浓度的凝胶样品进行测试。将已活化好的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的细菌悬液(浓度各为108 CFU/mL的量级)分别取1~2 μL置于离心管中，用经过高压蒸汽灭菌处理的PBS溶液(pH=7.4)1 mL将细菌悬浊液稀释到105 CFU/mL的量级，轻轻振荡均匀后置于恒温培养箱中备用。使用平板涂布法，向已凝固冷却的琼脂培养基表面分别涂布稀释过的细菌悬液。使用打孔器，将培养基打出大小一致的孔洞(本实验所打孔洞直径为9 mm)，每个培养皿打3个孔洞，作为平行组。向打好的孔洞中注入凝胶样品。最后，将培养皿置于恒温培养箱中，37 ℃下培养24 h后测量抑菌圈大小。
1.5.5 pH值测试
根据2015年版《中国药典》第三部的要求，凝胶剂一般应检查其pH值，以防止pH值过高或过低对使用者造成损伤。通过以上实验确定了该凝胶体系中较适宜的纳米银添加浓度后，使用笔式pH计(仪器型号为PHB-5，杭州奥立龙仪器有限公司)对含有该纳米银浓度的凝胶样品的pH值进行测定。
1.5.6 黏度测试
本项实验选用旋转式黏度计(BROOKFIELD DV-Ⅱ+ Pro Viscometer)对上述确定纳米银浓度的凝胶样品进行黏度测试。凝胶样品选择在28.9 ℃环境下测试，并选用2号转子进行黏度测试。
2 结果
2.1 所制备纳米银的表征结果
2.1.1 紫外吸收光谱实验结果
泊洛沙姆-蒸馏水组、PVP-蒸馏水组、泊洛沙姆-超纯水组、PVP-超纯水组的紫外吸收光谱如图 1所示。
图1
纳米银混合液的紫外吸收光谱
Figure1.
UV-Vis absorption spectra of nano silver mixed solution
如图 1所示，泊洛沙姆-蒸馏水组、PVP-蒸馏水组、泊洛沙姆-超纯水组、PVP-超纯水组制成的纳米银的最大吸收波长分别为431、442、414与431 nm，数据显示以超纯水为溶剂的体系具有更小的最大吸收波长(提示其粒径较小)，因此选取泊洛沙姆-超纯水组与PVP-超纯水组进行SEM实验。
2.1.2 SEM实验结果
泊洛沙姆-超纯水组与PVP-超纯水组的SEM图像如图 2所示。
图2
纳米银颗粒的SEM图片
Figure2.
SEM images of silver nanoparticles
对比显示，PVP-超纯水组制成的纳米银的粒径分布较广，经统计计算，其粒径分布介于50~120 nm之间，图 2右上为被PVP包裹的纳米银颗粒；而由图 2左下可知，泊洛沙姆-超纯水组制成的纳米银的粒径分布较窄，经统计计算，其粒径分布介于45~85 nm之间，图 2右下为被泊洛沙姆包裹的纳米银颗粒。
所以，在用紫外光化学法制备纳米银时，有两个比较重要的因素能影响生成的纳米银的大小。一是溶剂的种类，使用超纯水制备的纳米银与使用蒸馏水制备的纳米银相比具有更小的粒径与粒径范围；二是分散剂的种类，使用泊洛沙姆作为分散剂制备出的纳米银相比于使用PVP作为分散剂制备出的纳米银具有更小的粒径与粒径范围。
2.2 纳米银抗菌凝胶的表征结果
2.2.1 凝胶断面的SEM实验结果
以壳聚糖为凝胶基质和以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的干凝胶的微观结构如图 3所示。
图3
干凝胶断面的SEM图片
Figure3.
SEM images of dried gel
由图 3可知，壳聚糖干凝胶的断面较为平滑平整，而壳聚糖-泊洛沙姆干凝胶的断面具有较多孔洞结构，且孔洞大小小于20 μm。由此可知，在壳聚糖的凝胶体系中，泊洛沙姆的引入会改变凝胶内部的微观结构，使其变得更蓬松。泊洛沙姆分子与壳聚糖分子的相互作用，会促使孔洞的形成。另外，根据壳聚糖与壳聚糖-泊洛沙姆的SEM图片，可大致判断，壳聚糖-泊洛沙姆凝胶的溶胀性要比壳聚糖凝胶的溶胀性好。
2.2.2 溶胀率实验结果
壳聚糖干凝胶和壳聚糖-泊洛沙姆干凝胶在PBS溶液和生理盐水溶液中的溶胀率如图 4所示。
由图 4左图可知，两组干凝胶在PBS溶液中浸泡时间为5 min时，两者的溶胀率皆已高于200%。在1 h内时，两者的溶胀率稳步上升并分别达到290%和460%的高峰。但当浸泡时间达到2 h时，开始出现下降。随后，随着浸泡时间的延长，其溶胀率也逐渐下降，24 h后两者的溶胀率分别降到94%和140%。由图还可明显地看到，无论在哪个时间点，壳聚糖-泊洛沙姆组干凝胶的溶胀率均明显高于壳聚糖组。
图4
两组干凝胶的溶胀率
Figure4.
Swelling ratio of the two groups of dried gel
由图 4右图可知，两组干凝胶在生理盐水溶液中浸泡时间为5 min时，两者的溶胀率亦皆高于200%。随后，随着浸泡时间的延长，两者的溶胀率也稳步增长，当浸泡时间为6 h时，两者的溶胀率已分别达到612%和920%。而当浸泡时间大于6 h时，由于干凝胶过度溶胀，两组样品均已变成非常柔软且没有固定形状的胶团，因此之后的溶胀率无法继续测量。
综上所述，无论在PBS溶液还是生理盐水溶液中，壳聚糖-泊洛沙姆凝胶的溶胀率均优于壳聚糖凝胶的溶胀率。在干凝胶断面SEM实验中的猜测得到了直接验证。
2.2.3 体外细胞毒性实验结果
不同纳米银浓度的抗菌凝胶的体外细胞毒性评级如图 5所示。
图5
不同纳米银浓度的抗菌凝胶的体外细胞毒性
Figure5.
In vitro cytotoxicity of antibacterial hydrogel with different silver nanoparticle concentrations
不同纳米银浓度的抗菌凝胶的体外细胞毒性分级都低于或等于2级，具有良好的细胞相容性。随着凝胶中纳米银浓度的增加，凝胶的体外细胞毒性也逐渐增加。其中，纳米银浓度分别为0、3、6μg/mL的三组的体外细胞毒性分级为1级，对应的相对增殖率分别为88.1%、82.5%、81.4%；纳米银浓度分别为12、18、24 μg/mL的三组的体外细胞毒性分级为2级，对应的相对增殖率分别为72.9%、61.5%、52.2%。
2.2.4 抑菌圈实验结果
不同纳米银浓度的抗菌凝胶在不同菌种中形成的抑菌圈的平均大小如图 6所示。
图6
不同纳米银浓度的抗菌凝胶在不同菌种中的抗菌特性
Figure6.
Antibacterial property of antibacterial hydrogel with different silver nanoparticle concentrations
由图 6可知，大肠杆菌组与金黄色葡萄球菌组都具有明显的抑菌圈，且两组数据的表现类似。在两组抑菌圈实验中，可以看到当凝胶样品的纳米银浓度为24 μg/mL与18 μg/mL时，抑菌圈大小没有明显差异，但随着浓度梯度的降低，抑菌圈随之变小。12 μg/mL组的抑菌圈已有明显缩小，而0、3、6 μg/mL三组的抑菌圈又进一步变小，且此三组对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的抑菌能力均无明显差异。另外，可以看到壳聚糖-泊洛沙姆空白凝胶组也具有一定的抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的能力。
通过综合不同纳米银浓度的抗菌凝胶在体外细胞毒性实验和抑菌圈实验中的结果，本研究优选出了12 μg/mL这一浓度作为壳聚糖-泊洛沙姆体系中纳米银的优选浓度。
2.2.5 pH值测试结果
所制备的纳米银抗菌凝胶的pH值为5.8~6.1，呈弱酸性。
2.2.6 黏度测试结果
以壳聚糖-泊洛沙姆为基质的抗菌凝胶的黏度如表 1所示。由表 1可知，随着转子转速的增加，凝胶的表观黏度越来越小。且转子速度越大，爬杆效应越明显，因此所制备的凝胶为非牛顿流体。
表1
纳米银抗菌凝胶的黏度
Table1.
Apparent viscosities of nano silver antibacterial hydrogel
3 讨论
金属纳米粒子的表面等离子共振吸收峰位置、半高宽和峰值强度分别与粒子大小、尺寸分布和金属纳米粒子的浓度有很大关系[13, 17]。吸收峰的位置基本上可以确定粒子的大小,在通常情况下,粒子越小,吸收峰的位置就越蓝移；吸收峰的半高宽越宽,粒子尺寸分布就越广泛；当吸收峰的位置和半高宽均不改变而吸收峰的峰值增大时,说明金属纳米粒子浓度增大,即单位体积内粒子数增多[17]。因此,在制备纳米银混合液后,可以利用紫外-可见光吸收光谱图来反映生成物粒子大小和尺寸分布范围。
由紫外吸收光谱实验可知，在同种溶剂的溶液体系中，添加泊洛沙姆的溶液体系相比于添加PVP的溶液体系具有更小的最大吸收波长。因此可推断添加泊洛沙姆的溶液体系中，生成的纳米银颗粒的平均粒径要小于添加PVP的溶液体系的纳米银颗粒。而在添加同种试剂的溶液体系中，以超纯水为溶剂的溶液体系相比于以蒸馏水为溶剂的溶液体系具有更小的最大吸收波长。因此可推断以超纯水为溶剂的溶液体系中，生成的纳米银颗粒的平均粒径要小于以蒸馏水为溶剂的溶液体系中的纳米银颗粒。为了验证以上推断，需要进行SEM实验来观察其形态特征。
在纳米银的SEM实验中，PVP-超纯水组制成的纳米银的粒径分布较广，其粒径分布介于50~120 nm之间；而泊洛沙姆-超纯水组制成的纳米银的粒径分布较窄，其粒径分布介于45~85 nm之间。不难发现，纳米银的粒径分布范围与在紫外吸收光谱实验中的半高宽基本成正比。另外，由于本研究所制备的纳米银的粒径中等，既避免了由于纳米银粒径过大而使其抗菌活性降低，也避免了由于其粒径过小而导致细胞毒性的上升[18]。此外，在图 2右侧两个图中，添加有PVP和泊洛沙姆的两组都可清楚地观察到纳米银颗粒被高分子材料包裹的情况，因此可以推测，高分子材料的包裹可避免纳米银颗粒在形成过程中发生聚集与沉淀，从而形成分散的纳米银溶液。
当壳聚糖分散于稀醋酸溶液中时，主要存在两个平衡关系，如式(1)和式(2)所示：
| $\text{C}{{\text{H}}_{\text{3}}}\text{COOH}\rightleftharpoons {{\text{H}}^{\text{+}}}\text{+C}{{\text{H}}_{\text{3}}}\text{CO}{{\text{O}}^{-}}$ |
此时的壳聚糖主要以Chitosan-NH3+的状态存在，分子链由于静电斥力的作用而完全舒展。当加入NaHCO3后，HCO3-与H+发生结合产生 CO2气体，溶液体系的pH值发生改变，平衡(2)向左移动，壳聚糖分子链上的氨基发生去质子化，静电斥力受到破坏，同时壳聚糖分子间的氢键作用和疏水作用加强[19]。随着pH值的缓慢变大，壳聚糖分子也逐渐收缩，在收缩过程中形成交联点，构成三维网状结构。在壳聚糖分子间形成交联点的过程中，泊洛沙姆分子中的羟基与壳聚糖分子中的氨基也可能会产生新的氢键，共同构成复杂的三维网络结构，形成凝胶。
在壳聚糖凝胶、壳聚糖-泊洛沙姆凝胶断面的SEM实验中，壳聚糖干凝胶断面结构较为致密，断面平滑规整，没有明显孔洞结构。而壳聚糖-泊洛沙姆干凝胶的断面较为疏松，断面具有较多最大直径小于20 μm的孔洞结构。由此可推断，孔洞的形成可能得益于泊洛沙姆分子链中的某些基团(例如-CH2-)与壳聚糖分子链中的某些基团(例如-NH2)发生了相互作用，形成了氢键交联点，从而进一步形成了孔洞。
在凝胶的溶胀率实验中，所制备的干凝胶具有很好吸水能力，并且添加有泊洛沙姆的壳聚糖凝胶基质的吸水能力明显优于不添加泊洛沙姆的壳聚糖凝胶基质。壳聚糖-泊洛沙姆凝胶在生理盐水溶液中浸泡6 h后，其溶胀率已超900%，并在之后仍能继续吸收水分，直到12 h后由于过度溶胀形成非常柔软的胶团。基于其优良的吸水能力，可以应用于体液渗出期的烧伤创面或伤口上。因为所制备的抗菌凝胶具有一定的吸收组织渗出液的作用，并在创口上形成潮湿的环境，且其本身具有一定抑菌抗感染的作用，因此有利于烧伤创面的更快愈合[20]。
通过综合两组干凝胶在SEM测试和溶胀率实验中的结果，本研究选择了壳聚糖-泊洛沙姆凝胶体系作为优选凝胶体系。
在抑菌圈实验结果中发现，纳米银浓度为24 μg/mL和18 μg/mL的两组的抑菌能力最强，其次为12 μg/mL的凝胶，而0、3、6 μg/mL的三组的抑菌能力相对较差。在凝胶中，无论纳米银含量的高低，甚至不含纳米银时，都具有一定的抗菌能力。因为纳米银颗粒与壳聚糖分子都具有一定的抑菌能力[21-24]。目前，关于纳米银颗粒的抑菌机制与壳聚糖的抑菌机制都还没有确切的结论。纳米银颗粒的抑菌机制主要有以下几个方面[22, 24]：银纳米粒子可能通过附着到细胞膜的表面来干扰细胞的渗透性及其呼吸功能；在相同质量的情况下，纳米银颗粒能比其他大颗粒拥有更大的表面积，从而具有更大的与微生物相互作用的空间；银纳米颗粒能与细菌膜上的含硫蛋白质发生相互作用，同时也与诸如DNA上的含磷化合物发生相互作用，从而使细菌失活；纳米银颗粒可在细菌内部释放银离子，它可提高其抗菌活性。壳聚糖的抑菌机制主要包括以下几个方面[24]：一是壳聚糖分子结构中存在带有正电荷的氨基，它易与表面带有负电荷的类脂-蛋白质、磷壁酸和荚膜多糖等的菌体发生结合，影响细菌正常的呼吸代谢和生理结构，从而使其失活；二是壳聚糖进入菌体内部通过与细菌生存所必需的成分如蛋白质等结合，破坏其代谢平衡，或选择性地螯合对微生物生长起关键作用的金属离子，尤其是酶的辅助因子，从而抑制微生物的生长和繁殖。最后，也可能同时与DNA相互作用，扰乱DNA的复制与转录。值得注意的是，本研究中，无论是含有纳米银的凝胶还是不含纳米银的凝胶，所实验的凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌效果都要比对大肠杆菌的效果要好。
通过体外细胞毒性实验结果发现，不含纳米银的凝胶具有优良的生物相容性，同样，含有低纳米银浓度的凝胶也具有优良的生物相容性。但是，随着纳米银浓度的升高，凝胶的生物相容性逐渐下降。当纳米银浓度为24 μg/mL时，L929细胞的相对增殖率进一步降至52.2%，细胞毒性评级几乎快达到3级。因此，制备过程中需要控制纳米银的浓度，来降低其细胞毒性。
因此，通过平衡抑菌圈实验和体外细胞毒性实验的结果，本研究选取了12 μg/mL的纳米银浓度作为壳聚糖-泊洛沙姆凝胶体系的最佳纳米银浓度。
最后，通过pH值测试和黏度测试发现，壳聚糖-泊洛沙姆凝胶呈弱酸性，酸碱度适中，且黏度良好，可作为综合考虑之选。
4 结论
本研究通过物理交联法制备了一种抗菌、较好吸水特性且具有良好生物相容性的纳米银抗菌凝胶。所制备的凝胶黏度适中，易于涂抹到纱布上。基于以上特性，该凝胶有望应用于体液渗出期的烧伤创面或伤口上。另外，通过平衡凝胶的抑菌能力与生物相容性，得到在该体系中最优的纳米银浓度约为12 μg/mL。