本研究旨在搭建一套可测量血管应变的光学相干层析成像（OCT）系统。首先，利用搭建的 OCT 系统测量猪冠状动脉结构，并与血管组织切片对比，以确定系统的可靠性；然后，在灌流系统中，对猪冠状动脉施加不同压力，测量不同压力下血管的 OCT 图像，并使用互相关算法计算血管应变。结果表明，血管的 OCT 图像呈明暗分层，可以清晰地观察到血管的中膜和内膜，与血管组织切片结果一致。计算得到了不同压力下中膜和内膜的位移和应变，发现中膜应变大于内膜应变。该OCT系统不仅可以测量血管组织形态，还可以测量血管微观尺度的应变。
引用本文： 吴琨, 彭远来, 盛广济, 李昂, 刘肖, 邓小燕, 樊瑜波. 一种可测量血管应变的光学相干成像系统. 生物医学工程学杂志, 2017, 34(5): 772-777. doi: 10.7507/1001-5515.201607011 复制
引言
正常血管呈多层结构[1]，且其成分随着血管的状态动态变化，导致血管的力学特性呈不均匀分布，使得同样的力学作用下血管的局部力学环境具有较大差异。研究表明，局部力学环境不仅影响血管的生长发育[2-3]，还会影响血管疾病的发生和治疗，比如，动脉粥样硬化斑块的形成和破裂，与血管局部力学环境密切相关[4-7]；支架植入后力学环境的改变，也被认为是血管再狭窄和晚期血栓的关键因素[8-9]。因此，需要较为准确地描述在体血管的力学性质。
目前较为常见的研究手段为弹性成像技术[10]，其中以基于超声和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）的血管弹性成像为主，然而超声和 MRI 的成像分辨率较低，无法描述血管的精细力学性质。近年来，光学相干层析成像（optical coherence tomography，OCT）开始应用于光学弹性成像[11]。这种技术通过测量散射或反射的弹道光子的光程，对生物组织的表面和内部结构进行横断面层析成像。其成像深度为 1～3 mm，空间分辨率可达 1～20 μm[12-13]。因此，基于 OCT 的弹性成像（optical coherence elastography，OCE）可能可以观测到组织的微观结构和生物力学性质。
本文介绍了一种可以测量血管应变的 OCT 系统，对比苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色组织切片，表明该系统能够分辨血管内膜和中膜。此外，基于该系统，初步分析了静态压力环境下的血管应变，为进一步分析血管的精细力学性质提供了依据。
1 系统和实验方法
1.1 系统结构
本光学相干成像系统的构架如图 1 所示，在频域 OCT 光学平台上，搭建血管灌流系统，并配套血管扫描系统，使用 Morie Software（Version 0.956b）软件（http://www.Opticist.org），处理血管 OCT 原始图片，计算得到血管位移分布和血管应变，进而得到内膜和中膜 x 方向和 y 方向的应变分布。
图1
本光学相干成像系统
Figure1.
The optical coherent imaging system
1.2 硬件平台
实验室光学平台包括自主搭建的 1 300 nm 波段全光纤傅立叶域光学相干层析（Fourier domain optical coherence tomography，FD-OCT）系统，可程控、手动控制的高精度载物平台，X-Y 位移精度可以达到 1 μm。手动模式下对焦精度可以达到 5 μm。整套 FD-OCT 系统信噪比大于 100 dB，实测深度分辨率在 10 μm 左右，成像深度大于 3 mm。配套扫描系统软件可以实现系统参数调节、样本实时观测和存储等功能。
血管灌流系统包括观察腔、水位器、蠕动泵以及储液池四部分。血管两端密闭固定在观测腔内，观测腔一端通过管道连接水位器，一端输出到储液池，系统通过设置水位器的高度完成血管内部压强的标定。
1.3 测量方法和实验原理
首先，使用 OCT 系统对血管进行扫描，采集不同静水压下血管的 OCT 图像；然后，使用互相关算法，计算得出血管的位移分布图[14]。基于应变的定义，将血管的位移分布图转换为应变分布图。
1.4 OCT 扫描血管
设置血管灌流系统和 OCT 系统参数：猪舒张压为 52～165 mm Hg[15]，分别设定灌流系统水位器液压高度值为 65、75、85、95 cm，该静水压值处于猪血管生理值范围。同一血管在该四种静水压力条件下进行扫描，得到四组图像（65 cm 组、75 cm 组、85 cm 组和 95 cm 组）。猪冠状动脉样本数为 3 例。OCT 扫描频率为每秒 6 帧，扫描范围和血管直径重合，系统成像的动态范围大于 100 dB，利用上位机 OCT 扫描软件保存实验结果。实验过程中需要保持 OCT 系统参数一致和观测室静止不动，防止引起位移噪声，同时需要保证离体实验封闭，防止漏水，并且排除通路内气泡。
1.5 血管位移和应变分布的计算
利用 Image J 处理采集的图像，图片尺寸为 500×300，去除底部噪声，提高信噪比。使用 Moire Software 在 65 cm 组图像中选择感兴趣区域（region of interest，ROI），选择数字散斑相关算法（digital image correlation，DIC），以 65 cm 组图像作为初始位置，分别对 65 cm 组与 75 cm 组、65 cm 组与 85 cm 组、65 cm 组与 95 cm 组计算位移场和应变场的分布。矩形计算模板区域长度设置在 10～20 范围内比较合适。
分析位移场的分布，通过软件把实验结果分割为中膜和内膜两个部分，再计算内膜和中膜 x 方向及 y 方向的位移和应变分布图。
1.6 组织切片观察血管分层
为了验证 OCT 系统采集的图像，将用 OCT 测量后的血管进行 HE 染色。其大致过程为，首先用 10% 中性福尔马林充分固定血管，用酒精在不同的时间内把组织内的水分置换出来，用二甲苯充分透明，然后用石蜡除去组织中的透明剂，用新蜡和旧蜡包埋，而后用苏木精适当过染色、分化、显蓝[16]，最后使用显微镜观察采集图像。
2 实验结果
2.1 OCT 扫描与组织切片对比
OCT 图像结果显示，整个血管呈清晰的明暗相间分布（图 2 左）。由于血管外膜在实验预处理阶段基本剥离完全，因此这种明暗相间结构理论上应该是内膜和中膜。为了验证该结果，对 OCT 扫描的样本进行 HE 染色切片观察（图 2 右），组织切片中，深红区域为血管内膜，红白相间区域为血管中膜（血管切开后内层向上放置观察），分布情况与 OCT 扫描的明暗相间部位一致，因此可以确定，在 OCT 扫描实验中观测到的明暗相间分层结构即为血管内膜和中膜。
图2
血管 OCT 扫描和组织切片图
Figure2.
OCT scanning and HE staining images of tissue slices of blood vessels
2.2 OCT 扫描血管结果
图 3 所示为一个样品的 OCT 扫描图像，包括四种不同压力环境下（灌流系统水位器液压高度分别为 65、75、85 和 95 cm，即液体压强大小分别为 48.75、56.25、63.75 和 71.25 mm Hg）的血管成像图。通过调整图像灰度值映射的动态范围可知，系统成像灵敏度超过 100 dB。此外，我们还采用深度分辨色散补偿方法[17]，提高血管深度方向的扫描范围和分辨率。其它样本的实验结果相似（未放入本文），表明实验可重复性强。OCT 的成像灰度值由样本折射率决定，折射率表征物质的组成成分和微观结构，因此 OCT 图像反映了内膜和中膜的组成和性质有差异。本实验的 OCT 扫描血管方式是，从外部垂直血管轴向方向扫描成像，图像中中膜在上，内膜在下，可对血管的上半部分进行观察。
图3
OCT 原始扫描图像
Figure3.
The OCT original scanning images
2.3 血管位移和应变分布
图 4 显示的是，以 65 cm 水柱（48.75 mm Hg）压力下的血管扫描图为基准，其它三个压力（75、85 和 95 cm）下血管的位移场和应变场。在 x 方向上，血管由于受到静水压力的作用向外膨胀，使得血管左右两侧位移方向相反；在 y 方向上，由于膨胀作用，血管上半部分位移几乎竖直向上，且具有对称性。此外，图 5 结果显示，不同冠状动脉的位移测量结果类似，相同压力下不同血管的扫描结果一致，说明实验方案正确、可靠。
图4
Morie Software 计算位移分布图
Figure4.
The displacement map calculated in Morie Software
图5
不同冠脉血管位移的测量
Figure5.
Measurement of displacement in different coronary blood vessels
图 6 显示的是 75 cm 压力条件下血管的应变，左图为 x 方向上的应变场，右图为 y 方向上的应变场。由内及外血管应变呈逐渐增大的趋势，x 方向上的应变大体呈左右对称分布，而 y 方向的应变则较为不均匀。这种非均匀分布表明血管力学性质为非均匀介质。此外，大致可以看出中膜的应变大于内膜。由于在相同的压力作用下，应变能在一定程度上反映出材料的力学性质，说明内膜的弹性模量比中膜大。
图6
x 方向和 y 方向上的血管应变分布（65 cm 对比 75 cm 液压高度）
Figure6.
Vascular strain distributions in the x direction and the y direction (comparison of strains at 65 cm and 75 cm hydraulic heights)
3 讨论
本研究利用光学相干层析成像平台，扫描处于静水压下的猪冠状动脉。成像结果显示，血管具有明显分层结构，进而通过对比组织切片和 OCT 扫描切片样本，验证该分层结构是血管的内膜和中膜，该结果与文献中血管 OCT 图像的分层结构一致[18]。与文献研究方法不同的是，文献中将 OCT 探头置于血管中，而本实验中 OCT 成像系统采用非侵入扫描方式，将探头置于血管外。该扫描方式操作简便，而且能有效防止探头植入血管中引起的血管运动，使得后续位移场和应变场的分析更加方便、准确。
OCT 作为一种新兴的成像技术，在科学研究和医学临床实践中具有广泛的应用前景。国外研究表明，利用 OCT 测量生物组织在压缩应力下的微观变形，可以帮助我们更好地研究生物组织的微观特性[19]。本研究搭建的 OCT 系统是针对血管微观力学性质的测量，在 OCT 测量系统的基础上，设计了血管灌流系统，以配合 OCT 图像的采集。通过 Morie Software 软件计算血管位移和应变分布。该软件基于 DIC 算法，国内外相关研究证实该算法准确性较强，具有较高的重复性[20-21]。从图 5 结果可以知，在 x 方向上，随着静水压增大，血管左右两侧位移增大，血管顶端的位移减小；在 y 方向上，随着内压力增大，向上逐渐增大，且靠近轴线部分位移量最小；上述结果符合理想均质弹性管位移的分布规律。更为重要的是，结果表明血管的位移场呈非均匀分布，为了大体描述这种非均匀性的差异，利用图像分割把内膜和中膜的应变分布图提取出来并单独进行分析比较，发现中膜的应变大于内膜。有研究报道，血管内膜的弹性模量比中膜大三到四倍[22]。因此，在相同应力作用下，中膜的应变会大于内膜的应变，该结果与本实验的结果一致，印证了本实验的结论，同时验证了本系统测量血管应变的可行性。此外，本系统测量得到的血管应变结果相比于其它血管应变测量技术，如高频超声和 MRI[23-25]，具有分辨率高的特点（高频超声分辨率为 30～70 μm，MRI 分辨率为 120 μm，而 OCT 分辨率为 10 μm 以内），为实验的准确性和正确性提供了保障。
引言
正常血管呈多层结构[1]，且其成分随着血管的状态动态变化，导致血管的力学特性呈不均匀分布，使得同样的力学作用下血管的局部力学环境具有较大差异。研究表明，局部力学环境不仅影响血管的生长发育[2-3]，还会影响血管疾病的发生和治疗，比如，动脉粥样硬化斑块的形成和破裂，与血管局部力学环境密切相关[4-7]；支架植入后力学环境的改变，也被认为是血管再狭窄和晚期血栓的关键因素[8-9]。因此，需要较为准确地描述在体血管的力学性质。
目前较为常见的研究手段为弹性成像技术[10]，其中以基于超声和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）的血管弹性成像为主，然而超声和 MRI 的成像分辨率较低，无法描述血管的精细力学性质。近年来，光学相干层析成像（optical coherence tomography，OCT）开始应用于光学弹性成像[11]。这种技术通过测量散射或反射的弹道光子的光程，对生物组织的表面和内部结构进行横断面层析成像。其成像深度为 1～3 mm，空间分辨率可达 1～20 μm[12-13]。因此，基于 OCT 的弹性成像（optical coherence elastography，OCE）可能可以观测到组织的微观结构和生物力学性质。
本文介绍了一种可以测量血管应变的 OCT 系统，对比苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色组织切片，表明该系统能够分辨血管内膜和中膜。此外，基于该系统，初步分析了静态压力环境下的血管应变，为进一步分析血管的精细力学性质提供了依据。
1 系统和实验方法
1.1 系统结构
本光学相干成像系统的构架如图 1 所示，在频域 OCT 光学平台上，搭建血管灌流系统，并配套血管扫描系统，使用 Morie Software（Version 0.956b）软件（http://www.Opticist.org），处理血管 OCT 原始图片，计算得到血管位移分布和血管应变，进而得到内膜和中膜 x 方向和 y 方向的应变分布。
图1
本光学相干成像系统
Figure1.
The optical coherent imaging system
1.2 硬件平台
实验室光学平台包括自主搭建的 1 300 nm 波段全光纤傅立叶域光学相干层析（Fourier domain optical coherence tomography，FD-OCT）系统，可程控、手动控制的高精度载物平台，X-Y 位移精度可以达到 1 μm。手动模式下对焦精度可以达到 5 μm。整套 FD-OCT 系统信噪比大于 100 dB，实测深度分辨率在 10 μm 左右，成像深度大于 3 mm。配套扫描系统软件可以实现系统参数调节、样本实时观测和存储等功能。
血管灌流系统包括观察腔、水位器、蠕动泵以及储液池四部分。血管两端密闭固定在观测腔内，观测腔一端通过管道连接水位器，一端输出到储液池，系统通过设置水位器的高度完成血管内部压强的标定。
1.3 测量方法和实验原理
首先，使用 OCT 系统对血管进行扫描，采集不同静水压下血管的 OCT 图像；然后，使用互相关算法，计算得出血管的位移分布图[14]。基于应变的定义，将血管的位移分布图转换为应变分布图。
1.4 OCT 扫描血管
设置血管灌流系统和 OCT 系统参数：猪舒张压为 52～165 mm Hg[15]，分别设定灌流系统水位器液压高度值为 65、75、85、95 cm，该静水压值处于猪血管生理值范围。同一血管在该四种静水压力条件下进行扫描，得到四组图像（65 cm 组、75 cm 组、85 cm 组和 95 cm 组）。猪冠状动脉样本数为 3 例。OCT 扫描频率为每秒 6 帧，扫描范围和血管直径重合，系统成像的动态范围大于 100 dB，利用上位机 OCT 扫描软件保存实验结果。实验过程中需要保持 OCT 系统参数一致和观测室静止不动，防止引起位移噪声，同时需要保证离体实验封闭，防止漏水，并且排除通路内气泡。
1.5 血管位移和应变分布的计算
利用 Image J 处理采集的图像，图片尺寸为 500×300，去除底部噪声，提高信噪比。使用 Moire Software 在 65 cm 组图像中选择感兴趣区域（region of interest，ROI），选择数字散斑相关算法（digital image correlation，DIC），以 65 cm 组图像作为初始位置，分别对 65 cm 组与 75 cm 组、65 cm 组与 85 cm 组、65 cm 组与 95 cm 组计算位移场和应变场的分布。矩形计算模板区域长度设置在 10～20 范围内比较合适。
分析位移场的分布，通过软件把实验结果分割为中膜和内膜两个部分，再计算内膜和中膜 x 方向及 y 方向的位移和应变分布图。
1.6 组织切片观察血管分层
为了验证 OCT 系统采集的图像，将用 OCT 测量后的血管进行 HE 染色。其大致过程为，首先用 10% 中性福尔马林充分固定血管，用酒精在不同的时间内把组织内的水分置换出来，用二甲苯充分透明，然后用石蜡除去组织中的透明剂，用新蜡和旧蜡包埋，而后用苏木精适当过染色、分化、显蓝[16]，最后使用显微镜观察采集图像。
2 实验结果
2.1 OCT 扫描与组织切片对比
OCT 图像结果显示，整个血管呈清晰的明暗相间分布（图 2 左）。由于血管外膜在实验预处理阶段基本剥离完全，因此这种明暗相间结构理论上应该是内膜和中膜。为了验证该结果，对 OCT 扫描的样本进行 HE 染色切片观察（图 2 右），组织切片中，深红区域为血管内膜，红白相间区域为血管中膜（血管切开后内层向上放置观察），分布情况与 OCT 扫描的明暗相间部位一致，因此可以确定，在 OCT 扫描实验中观测到的明暗相间分层结构即为血管内膜和中膜。
图2
血管 OCT 扫描和组织切片图
Figure2.
OCT scanning and HE staining images of tissue slices of blood vessels
2.2 OCT 扫描血管结果
图 3 所示为一个样品的 OCT 扫描图像，包括四种不同压力环境下（灌流系统水位器液压高度分别为 65、75、85 和 95 cm，即液体压强大小分别为 48.75、56.25、63.75 和 71.25 mm Hg）的血管成像图。通过调整图像灰度值映射的动态范围可知，系统成像灵敏度超过 100 dB。此外，我们还采用深度分辨色散补偿方法[17]，提高血管深度方向的扫描范围和分辨率。其它样本的实验结果相似（未放入本文），表明实验可重复性强。OCT 的成像灰度值由样本折射率决定，折射率表征物质的组成成分和微观结构，因此 OCT 图像反映了内膜和中膜的组成和性质有差异。本实验的 OCT 扫描血管方式是，从外部垂直血管轴向方向扫描成像，图像中中膜在上，内膜在下，可对血管的上半部分进行观察。
图3
OCT 原始扫描图像
Figure3.
The OCT original scanning images
2.3 血管位移和应变分布
图 4 显示的是，以 65 cm 水柱（48.75 mm Hg）压力下的血管扫描图为基准，其它三个压力（75、85 和 95 cm）下血管的位移场和应变场。在 x 方向上，血管由于受到静水压力的作用向外膨胀，使得血管左右两侧位移方向相反；在 y 方向上，由于膨胀作用，血管上半部分位移几乎竖直向上，且具有对称性。此外，图 5 结果显示，不同冠状动脉的位移测量结果类似，相同压力下不同血管的扫描结果一致，说明实验方案正确、可靠。
图4
Morie Software 计算位移分布图
Figure4.
The displacement map calculated in Morie Software
图5
不同冠脉血管位移的测量
Figure5.
Measurement of displacement in different coronary blood vessels
图 6 显示的是 75 cm 压力条件下血管的应变，左图为 x 方向上的应变场，右图为 y 方向上的应变场。由内及外血管应变呈逐渐增大的趋势，x 方向上的应变大体呈左右对称分布，而 y 方向的应变则较为不均匀。这种非均匀分布表明血管力学性质为非均匀介质。此外，大致可以看出中膜的应变大于内膜。由于在相同的压力作用下，应变能在一定程度上反映出材料的力学性质，说明内膜的弹性模量比中膜大。
图6
x 方向和 y 方向上的血管应变分布（65 cm 对比 75 cm 液压高度）
Figure6.
Vascular strain distributions in the x direction and the y direction (comparison of strains at 65 cm and 75 cm hydraulic heights)
3 讨论
本研究利用光学相干层析成像平台，扫描处于静水压下的猪冠状动脉。成像结果显示，血管具有明显分层结构，进而通过对比组织切片和 OCT 扫描切片样本，验证该分层结构是血管的内膜和中膜，该结果与文献中血管 OCT 图像的分层结构一致[18]。与文献研究方法不同的是，文献中将 OCT 探头置于血管中，而本实验中 OCT 成像系统采用非侵入扫描方式，将探头置于血管外。该扫描方式操作简便，而且能有效防止探头植入血管中引起的血管运动，使得后续位移场和应变场的分析更加方便、准确。
OCT 作为一种新兴的成像技术，在科学研究和医学临床实践中具有广泛的应用前景。国外研究表明，利用 OCT 测量生物组织在压缩应力下的微观变形，可以帮助我们更好地研究生物组织的微观特性[19]。本研究搭建的 OCT 系统是针对血管微观力学性质的测量，在 OCT 测量系统的基础上，设计了血管灌流系统，以配合 OCT 图像的采集。通过 Morie Software 软件计算血管位移和应变分布。该软件基于 DIC 算法，国内外相关研究证实该算法准确性较强，具有较高的重复性[20-21]。从图 5 结果可以知，在 x 方向上，随着静水压增大，血管左右两侧位移增大，血管顶端的位移减小；在 y 方向上，随着内压力增大，向上逐渐增大，且靠近轴线部分位移量最小；上述结果符合理想均质弹性管位移的分布规律。更为重要的是，结果表明血管的位移场呈非均匀分布，为了大体描述这种非均匀性的差异，利用图像分割把内膜和中膜的应变分布图提取出来并单独进行分析比较，发现中膜的应变大于内膜。有研究报道，血管内膜的弹性模量比中膜大三到四倍[22]。因此，在相同应力作用下，中膜的应变会大于内膜的应变，该结果与本实验的结果一致，印证了本实验的结论，同时验证了本系统测量血管应变的可行性。此外，本系统测量得到的血管应变结果相比于其它血管应变测量技术，如高频超声和 MRI[23-25]，具有分辨率高的特点（高频超声分辨率为 30～70 μm，MRI 分辨率为 120 μm，而 OCT 分辨率为 10 μm 以内），为实验的准确性和正确性提供了保障。
