本文用放射性核素标记以及单光子发射型计算机断层（SPECT）γ 显像的方法，进行 E-选择素蛋白分子位点密度测定，以探讨其实用价值。采用 Indogen 法对 E-选择素蛋白分子抗体进行 125I 标记，标记产物经 G25 葡聚糖凝胶层析柱分离纯化，对分离出的样品排列在塑胶试管架上，用 SPECT 进行平面显像并定量分析。制备不同浓度的 E-选择素标准溶液，将放射性计数换算为位点密度，作蛋白量位点密度标准曲线。标记产物经 SPECT 定量分析，E-选择素抗体标记率为 78%；不同浓度样品饱和曲线显示，当浓度在 0～1 mg/mL 浓度范围时，得标准曲线为 y=6 045.7x—51.166，决定系数 R2=0.997 9。研究结果表明，γ 显像在放射性标记产物分析及位点密度测定时有一定实用价值。
引用本文： 张金赫, 李趣欢, 凌颖琛, 钟建秋, 尹吉林, 徐浩. γ 显像在层析分离及蛋白分子位点密度测定中的应用. 生物医学工程学杂志, 2017, 34(3): 445-448. doi: 10.7507/1001-5515.201609035 复制
引言
在炎症反应的过程中，由 E-选择素介导的白细胞对内皮细胞的黏附是关键步骤[1]。人们常用平行平板流动腔（parallel plat flow chamber，PPFC）实验来模拟体外循环的白细胞黏附过程[2]。因此准确测定 PPFC 表面 E-选择素的位点密度，是在分子水平上研究 E-选择素介导机制的关键。
放射性同位素 125I 标记示踪法具有较高的灵敏度，在位点密度的测定中受到广泛应用[3]。在测定标记率时，传统的方法是将标记样品上柱纯化后，得到分离样品，通常为多个试管，然后用 γ 计数器检测每管溶液的放射性计数，得到分离曲线，以计算标记率[4]。这样不仅耗时，而且会因放射性的衰减造成误差，尤其对于短半衰期核素更为明显。计算位点密度时制作标准曲线，同样要测定不同样品的放射性，也存在相同的问题。本研究采用单光子发射型计算机断层（single photon emission com-puted tomography，SPECT）进行单光子发射扫描，可对样品进行批量检测，有利于减少误差，同时可借助 SPECT 本身软件，进行半自动定量分析，提高检测精度及检测效率。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
单光子发射型计算机断层设备为美国 GE 公司的 Infinia Hawkeye 4；重组人类 E-选择素（R&D）、抗人类 E-选择素抗体（R&D）、聚苯乙烯 48 孔板（Corning Inc，NY）、预涂层碘化管（Pre-Coated Iodination Tube）由美国 Pierce 公司提供；125I 由中国同辐有限公司提供；Tris 缓冲液为实验室自行配制；终止反应溶液为含 10 mg/mL 酪氨酸的 Tris 缓冲液，由实验室自行配制；层析柱为 10 mL 玻璃柱，用 G25 葡聚糖凝胶自行填充，使用前用 20～30 mL Tris 缓冲液平衡。
1.2 方法
1.2.1 125I 标记抗人类 E-选择素抗体 在预涂层碘化管中加入 1 mL Tris 缓冲液，润湿后倒掉；将 100 μL 高浓度 Tris 缓冲液直接加入预涂层碘化管的底部，注意避免溶液接触试管管壁；加入 10 μL（1.0 mCi）Na125I 溶液，让碘化物活化 6 min，每 30 s 旋转试管一次；将活化后的碘化物加入到 25 μg E-选择素抗体蛋白溶液中混合，反应 9 min，每 30 s 轻轻晃动试管一次；然后加入 50 μL 终止反应溶液，混匀并孵育 5 min。
1.2.2 层析过柱 将产物加入到 10 mL 层析柱中，将 0.5 mL Tris 缓冲液加入到样品管中，以溶解剩余蛋白，并加入到层析柱中；用 Tris 缓冲液对层析柱进行洗脱，每 0.5～0.8 mL（18 滴左右）收集一管，共收集 30 管。
1.2.3 对收集样品的试管进行 γ 显像 标记抗体过柱后，试管收集，将样品顺序排列在塑胶试管架上，用 SPECT 进行平面 γ 显像，并用自带软件进行定量分析。SPECT 显像采用低能通用准直器，能峰（36±3.6）keV，矩阵 128×128，放大倍数 1.0，采集时间根据放射性计数，可采集 10～30 min。
1.2.4 放射密度检测 将柱分离得到的标记样品，也就是第一个峰收集到的几管溶液混合，测定总放射量和总蛋白量，计算放射量/分子数比值，为下一步将放射性定量转化为位点密度做好准备。
1.2.5 E-选择素位点密度测定标准曲线的制作 将 130 μL 特定浓度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL）的 E-选择素溶液加入 48 孔聚苯乙烯板中（直径 10.2 mm），聚苯乙烯板中的聚苯乙烯可以有效吸附 E-选择素分子，形成不同位点密度的平面，每个浓度重复 4 次，每个样品之间间隔至少一个空白孔，置 4℃ 冰箱中过夜，使其吸附牢固。加入 130 μL 标有 125I 的抗体分子溶液，室温孵育 30 min，进行免疫结合。然后吸走多余抗体溶液，用 Tris 缓冲液清洗三次，最后再加入 130 μL Tris 缓冲液。用 SPECT 检测 48 孔板中每个样品的放射性，作蛋白量放射性标准曲线及蛋白量位点密度曲线。
1.2.6 统计方法 采用 SPECT 自带软件 Xerise Functional Imaging Workstation 进行半定量分析，采用 SPSS 17.0 进行标准曲线绘制及回归方程计算。
2 结果
2.1 标记结果
标记抗体过柱后，试管收集，共 30 管，顺序置于塑料试管架上，进行 SPECT 扫描。结果见图 1。
图1
过柱后收集管的 SPECT 显像图
Figure1.
SPECT imaging of the collection tube
用 SPECT 自带软件对每一管放射性进行定量测定，并做出直方图，因 1～5 管为空白，故从第 5 管开始计算，见图 2。各收集管的放射量出现两个峰，第一峰为标有 125I 的抗体峰，第二峰为游离的 125I 峰，经计算，抗体标记率达 78%，其中第 6～10 管样品已占抗体标记物 99%，收集并保存于 4℃ 冰箱备用。
图2
过柱后收集管放射性计数定量直方图
Figure2.
Quantitative histogram of radioactivity counts of the collection tube
2.2 放射性计数与位点密度的定量关系
根据 1 min 标记物的总放射性计数和标记物的质量，可计算出 1 min 每分子标记物的放射性计数频率为 1.08×10–11，已知 48 孔聚苯乙烯板每孔直径为 10.2 mm，所以测得每孔一定时间放射性计数，即可求得标记分子数量及其在平板的密度。
2.3 E-选择素位点密度测定标准曲线
将制作好的 48 孔板用 SPECT 进行采集显像，采用低能通用准直器，采集 10 min，结果见图 3。
图3
不同浓度 E-选择素与一定量 125I 标记抗体结合后的 SPECT 显像图
Figure3.
SPECT imaging of different concentrations of E-selectin combined with a certain amount of 125I-labeled antibody
用 SPECT 自带软件对图像进行定量计算，得到每一培养孔的 125I 总计数，根据上一步计算的结果，换算成单位面积的分子的位点密度，做出位点密度和溶液浓度的标准曲线，见图 4。
图4
不同浓度 E-选择素的位点密度曲线
Figure4.
Site density curve of different concentrations of E-selectin
当浓度为 0～1 μg/mL 时，浓度与位点密度近似直线关系，对这一范围进行线性回归，得到回归方程 y=6 045.7x–51.166（x 为 E-选择素浓度，y 为位点密度），两者的相关系数（R2）达 0.997 9。
3 讨论
E-选择素是选择素家族的一员，它是一个分子量为 107～115 kD 的细胞表面糖蛋白，在健康和病变组织中均有表达。它可以介导炎症发生时白细胞向血管壁的趋附，在体内参与多种病理过程[5]。位点密度的测定在细胞黏附病理机制方面的研究具有重要作用，因而有必要建立精确可行的测定方法。
对于 E-选择素位点密度的测定有不同的方法，如 Snook 等[6]曾用 E-选择素的动力学变化，经复杂计算来测定，过程相对较繁杂。而同位素示踪法相对直观，灵敏度高，是一种重要的测定方法。
层析分离是放射性标记后分离纯化的常用方法，目前已发展为自动化[7]。但对于许多实验室仍用传统的柱层析分离，分离产物用 γ 计数器进行定量分析。传统柱层析的优点在于可根据不同分离物选择不同填料、装备简单等，缺点在于步骤多、测量效率低等[8]。
本文对传统柱层析方法进行了改进，用 SPECT 代替 γ 计数器，对样品进行单光子发射扫描，可对样品进行批量检测，有利于减少误差，同时可借助 SPECT 本身软件半自动定量分析，明显提高了检测精度及检测效率。同时使测量结果可视化，更直观。
分子的位点密度与浓度在一定范围内成正比[9]。本文在对 E-选择素位点密度的实测中，证明了 E-选择素的浓度在 0～1 μg/mL 时，与位点密度直线相关，与文献一致。
SPECT 可以准确、快速地测定黏附表面的放射性计数，进而推算 PPFC 的位点密度。通过标记蛋白分子或其抗体，可精准测算蛋白分子的位点密度，或者与抗体结合的位点密度，对于研究细胞黏附机制、炎症反应、血栓疾病和肿瘤转移等是一个有力工具。
引言
在炎症反应的过程中，由 E-选择素介导的白细胞对内皮细胞的黏附是关键步骤[1]。人们常用平行平板流动腔（parallel plat flow chamber，PPFC）实验来模拟体外循环的白细胞黏附过程[2]。因此准确测定 PPFC 表面 E-选择素的位点密度，是在分子水平上研究 E-选择素介导机制的关键。
放射性同位素 125I 标记示踪法具有较高的灵敏度，在位点密度的测定中受到广泛应用[3]。在测定标记率时，传统的方法是将标记样品上柱纯化后，得到分离样品，通常为多个试管，然后用 γ 计数器检测每管溶液的放射性计数，得到分离曲线，以计算标记率[4]。这样不仅耗时，而且会因放射性的衰减造成误差，尤其对于短半衰期核素更为明显。计算位点密度时制作标准曲线，同样要测定不同样品的放射性，也存在相同的问题。本研究采用单光子发射型计算机断层（single photon emission com-puted tomography，SPECT）进行单光子发射扫描，可对样品进行批量检测，有利于减少误差，同时可借助 SPECT 本身软件，进行半自动定量分析，提高检测精度及检测效率。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
单光子发射型计算机断层设备为美国 GE 公司的 Infinia Hawkeye 4；重组人类 E-选择素（R&D）、抗人类 E-选择素抗体（R&D）、聚苯乙烯 48 孔板（Corning Inc，NY）、预涂层碘化管（Pre-Coated Iodination Tube）由美国 Pierce 公司提供；125I 由中国同辐有限公司提供；Tris 缓冲液为实验室自行配制；终止反应溶液为含 10 mg/mL 酪氨酸的 Tris 缓冲液，由实验室自行配制；层析柱为 10 mL 玻璃柱，用 G25 葡聚糖凝胶自行填充，使用前用 20～30 mL Tris 缓冲液平衡。
1.2 方法
1.2.1 125I 标记抗人类 E-选择素抗体 在预涂层碘化管中加入 1 mL Tris 缓冲液，润湿后倒掉；将 100 μL 高浓度 Tris 缓冲液直接加入预涂层碘化管的底部，注意避免溶液接触试管管壁；加入 10 μL（1.0 mCi）Na125I 溶液，让碘化物活化 6 min，每 30 s 旋转试管一次；将活化后的碘化物加入到 25 μg E-选择素抗体蛋白溶液中混合，反应 9 min，每 30 s 轻轻晃动试管一次；然后加入 50 μL 终止反应溶液，混匀并孵育 5 min。
1.2.2 层析过柱 将产物加入到 10 mL 层析柱中，将 0.5 mL Tris 缓冲液加入到样品管中，以溶解剩余蛋白，并加入到层析柱中；用 Tris 缓冲液对层析柱进行洗脱，每 0.5～0.8 mL（18 滴左右）收集一管，共收集 30 管。
1.2.3 对收集样品的试管进行 γ 显像 标记抗体过柱后，试管收集，将样品顺序排列在塑胶试管架上，用 SPECT 进行平面 γ 显像，并用自带软件进行定量分析。SPECT 显像采用低能通用准直器，能峰（36±3.6）keV，矩阵 128×128，放大倍数 1.0，采集时间根据放射性计数，可采集 10～30 min。
1.2.4 放射密度检测 将柱分离得到的标记样品，也就是第一个峰收集到的几管溶液混合，测定总放射量和总蛋白量，计算放射量/分子数比值，为下一步将放射性定量转化为位点密度做好准备。
1.2.5 E-选择素位点密度测定标准曲线的制作 将 130 μL 特定浓度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL）的 E-选择素溶液加入 48 孔聚苯乙烯板中（直径 10.2 mm），聚苯乙烯板中的聚苯乙烯可以有效吸附 E-选择素分子，形成不同位点密度的平面，每个浓度重复 4 次，每个样品之间间隔至少一个空白孔，置 4℃ 冰箱中过夜，使其吸附牢固。加入 130 μL 标有 125I 的抗体分子溶液，室温孵育 30 min，进行免疫结合。然后吸走多余抗体溶液，用 Tris 缓冲液清洗三次，最后再加入 130 μL Tris 缓冲液。用 SPECT 检测 48 孔板中每个样品的放射性，作蛋白量放射性标准曲线及蛋白量位点密度曲线。
1.2.6 统计方法 采用 SPECT 自带软件 Xerise Functional Imaging Workstation 进行半定量分析，采用 SPSS 17.0 进行标准曲线绘制及回归方程计算。
2 结果
2.1 标记结果
标记抗体过柱后，试管收集，共 30 管，顺序置于塑料试管架上，进行 SPECT 扫描。结果见图 1。
图1
过柱后收集管的 SPECT 显像图
Figure1.
SPECT imaging of the collection tube
用 SPECT 自带软件对每一管放射性进行定量测定，并做出直方图，因 1～5 管为空白，故从第 5 管开始计算，见图 2。各收集管的放射量出现两个峰，第一峰为标有 125I 的抗体峰，第二峰为游离的 125I 峰，经计算，抗体标记率达 78%，其中第 6～10 管样品已占抗体标记物 99%，收集并保存于 4℃ 冰箱备用。
图2
过柱后收集管放射性计数定量直方图
Figure2.
Quantitative histogram of radioactivity counts of the collection tube
2.2 放射性计数与位点密度的定量关系
根据 1 min 标记物的总放射性计数和标记物的质量，可计算出 1 min 每分子标记物的放射性计数频率为 1.08×10–11，已知 48 孔聚苯乙烯板每孔直径为 10.2 mm，所以测得每孔一定时间放射性计数，即可求得标记分子数量及其在平板的密度。
2.3 E-选择素位点密度测定标准曲线
将制作好的 48 孔板用 SPECT 进行采集显像，采用低能通用准直器，采集 10 min，结果见图 3。
图3
不同浓度 E-选择素与一定量 125I 标记抗体结合后的 SPECT 显像图
Figure3.
SPECT imaging of different concentrations of E-selectin combined with a certain amount of 125I-labeled antibody
用 SPECT 自带软件对图像进行定量计算，得到每一培养孔的 125I 总计数，根据上一步计算的结果，换算成单位面积的分子的位点密度，做出位点密度和溶液浓度的标准曲线，见图 4。
图4
不同浓度 E-选择素的位点密度曲线
Figure4.
Site density curve of different concentrations of E-selectin
当浓度为 0～1 μg/mL 时，浓度与位点密度近似直线关系，对这一范围进行线性回归，得到回归方程 y=6 045.7x–51.166（x 为 E-选择素浓度，y 为位点密度），两者的相关系数（R2）达 0.997 9。
3 讨论
E-选择素是选择素家族的一员，它是一个分子量为 107～115 kD 的细胞表面糖蛋白，在健康和病变组织中均有表达。它可以介导炎症发生时白细胞向血管壁的趋附，在体内参与多种病理过程[5]。位点密度的测定在细胞黏附病理机制方面的研究具有重要作用，因而有必要建立精确可行的测定方法。
对于 E-选择素位点密度的测定有不同的方法，如 Snook 等[6]曾用 E-选择素的动力学变化，经复杂计算来测定，过程相对较繁杂。而同位素示踪法相对直观，灵敏度高，是一种重要的测定方法。
层析分离是放射性标记后分离纯化的常用方法，目前已发展为自动化[7]。但对于许多实验室仍用传统的柱层析分离，分离产物用 γ 计数器进行定量分析。传统柱层析的优点在于可根据不同分离物选择不同填料、装备简单等，缺点在于步骤多、测量效率低等[8]。
本文对传统柱层析方法进行了改进，用 SPECT 代替 γ 计数器，对样品进行单光子发射扫描，可对样品进行批量检测，有利于减少误差，同时可借助 SPECT 本身软件半自动定量分析，明显提高了检测精度及检测效率。同时使测量结果可视化，更直观。
分子的位点密度与浓度在一定范围内成正比[9]。本文在对 E-选择素位点密度的实测中，证明了 E-选择素的浓度在 0～1 μg/mL 时，与位点密度直线相关，与文献一致。
SPECT 可以准确、快速地测定黏附表面的放射性计数，进而推算 PPFC 的位点密度。通过标记蛋白分子或其抗体，可精准测算蛋白分子的位点密度，或者与抗体结合的位点密度，对于研究细胞黏附机制、炎症反应、血栓疾病和肿瘤转移等是一个有力工具。
