光声显微成像兼具高光学组织对比度，以及超声的高穿透深度和高空间分辨率的优点。但一方面在光声显微成像中，组织深层目标易被浅表目标屏蔽，另一方面其横向分辨率与焦深的矛盾一直限制了光声显微的成像质量。针对这两个问题，本实验搭建了一套基于超声分辨的光声显微成像系统。其采用一种非共轴的照明-探测方式来减少浅层组织对深层信息的影响，并且采用一种新的焦区积分算法来进行数据的处理，结合多次纵向变焦扫描来实现深层组织的高分辨探测。仿体实验表明，该方法可以在不同纵向深度上保持约 0.6 mm 的横向分辨率，与理论值相接近。裸鼠肿瘤成像结果表明，本文所提出的方法可以比普通的背向探测声聚焦光声显微成像方法在深度方向上获取更多的信息。随着超快脉冲激光和高速扫描方式的发展，本文所提出的方法有望在脑部血管成像、宫颈癌内窥成像、浅表肿瘤成像等方面得到较好的应用。
引用本文： 罗晓飞, 彭宽, 王波, 王天爽, 肖嘉莹. 基于焦区积分的高分辨率光声变焦显微成像. 生物医学工程学杂志, 2018, 35(1): 115-122. doi: 10.7507/1001-5515.201609072 复制
引言
光声成像是一种新型的无损生物成像技术。这种成像模态使用超短脉冲激光照射生物组织，通过探测光声效应所产生的光声信号来检测样品中的光吸收参数变化，兼具光学成像的高灵敏度以及超声成像的高穿透深度和高空间分辨率的优点[1-10]。光声显微成像（photoacoustic microscopy，PAM）作为光声成像的重要分支，通常通过检测某个激光光路上所产生的超声时域信号来直接分析该路径上光吸收量的分布情况，而不需要使用逆向重建算法。按照空间分辨率的提供方式，光声显微系统一般分为两种类型，一种是光聚焦 PAM，通过激光聚焦获得高空间分辨率，但由于生物组织对光的强散射作用，其成像只限于浅表层，平均深度不超过光子平均自由程[11-12]。另一种是声聚焦 PAM，通过超声聚焦获得空间分辨率，由于超声在生物组织中的散射效应远小于光，这种方法即使在组织内光子自由程范围外仍然能够获得高分辨率的图像，并且已经成功地应用在肿瘤、深层血管等活体组织成像中[13-18]。
然而，在常见的声聚焦 PAM 中，通常采用一个与激光光路同轴的聚焦超声探头来获取整个激光光路上所产生的超声时间序列。这种成像方式会导致在同一激光光路上深层目标的光声信号可能被淹没在浅层目标光声信号的拖尾中，从而降低系统对深层目标检测的灵敏度[19]。此外，由于超声探头的焦点被固定在某个深度上，系统的横向空间分辨率会随着远离聚焦区域而显著降低[20]。汪力宏课题组[12]在 2005 年提出了一种暗场共聚焦 PAM 系统，这一系统采用一个锥形镜暗场照明系统，有效降低了超声探头正下方表面组织的光照强度，从而极大地减小了表面组织对深层目标信号的影响，并使用高数值孔径的聚焦探头来提高系统的横向分辨率。2012 年，刘炎炎等[21]在汪力宏组类似的暗场光声显微系统的基础上，进一步提出了一种基于稀疏扫描轮廓的滑动焦点 PAM 方法，通过在平面扫描过程中不断调节探头的聚焦深度，使得感兴趣的目标样品始终处于焦深的范围，从而获得分辨率和信噪比均匀的光声显微图像。但刘炎炎等的实验只是对二维平面扫描的优化，并没给出完整的三维图像。
本文搭建了一套声聚焦 PAM 系统，采用一种非共轴的照明-探测方法来减少浅层组织对深层信息的影响。这种方法中，超声检测波束和激光光路相互垂直且聚焦超声探头的焦点始终位于两者的交汇点上，并将所获取的光声信号作为该位置上的光声成像结果，移动该交汇点遍历成像区域，从而获得完整图像。此外，由于聚焦超声探头的焦点始终处于当前的成像深度，这种方法也能够在不同的成像深度上保持基本一致的空间分辨率。
1 系统与方法
1.1 成像系统
实验系统设置如图 1 上图所示。激光器（Q-switched Nd：YAG，北京镭宝光电技术有限公司）所产生的 532 nm 脉冲激光被凸透镜聚焦之后耦合进一根芯径为 0.8 mm 的多模光纤中，光纤另一端的出射光被另一个凸透镜进行整形之后与水平面呈 45° 角入射到水槽中的样品中。一个中心频率为 10 MHz 的聚焦超声探头（A312S-N-SU，日本 Olympus Co，焦距约为 15 mm，横向分辨率和纵向分辨率分别为 0.4 mm 和 0.2 mm）被用于采集光声信号，这个超声探头同样与水平面呈 45° 角安装固定，且超声探头的焦点被放置在超声检测波束和激光光路的交点上。光纤的出射端、出射光整形透镜和聚焦超声探头一起被安装在一个 TSA 电控位移台（TSA150-b，北京卓立汉光仪器有限公司）上以实现水平和纵向移动且步进均为 0.1 mm。超声探头所接收到的光声信号在经过超声脉冲发射接收器（5072PR，日本 Olympus Co）的滤波和放大之后被计算机中的数据采集卡（Spectrum M4i 2223-x8，北京坤驰科技有限公司，双通道，最大采样速率 2.5 GS/s，最大带宽 1 GHz）记录和保存。整个系统的触发信号由脉冲激光器提供，数据的采样频率为 100 MHz。在成像时，聚焦超声探头和光纤出射端同步进行垂直和水平移动。对于某个移动位置而言，当前聚焦超声探头的焦点位置为其成像位置，在该位置上只测量该成像位置上的光声信号。在完成全部水平和垂直移动之后可以最终获得一幅样品的 B 扫描图像。平移台的移动由计算机中的 Labview 程序通过电机控制器（SC300，北京卓立汉光仪器有限公司）进行管理。本文实验在精密光学平台（OTPOT18-12，北京卓立汉光仪器有限公司）完成。
这一系统中，由于激光光路和聚焦超声探头的检测波束相互垂直，且超声探头焦点始终位于超声探头检测波束和激光光路的交汇位置上，因此激光光路上来自浅表层的光声信号将被超声探头的聚焦效应所压制，从而降低了浅表层光声信号对深层目标检测的干扰。此外，由于聚焦超声探头焦点始终处于当前的成像位置上，其空间分辨率也不会随成像深度的改变而发生显著变化。图 1 下图显示了聚焦超声探头探测波束与激光光路的关系。
图1
所用 PAM 成像系统与光声探测方法
Figure1.
The PAM system and its optical-ultrasonic detection arrangements
1.2 数据处理方法
数据处理采用 matlab 进行。先获得系统中聚焦探头焦点处的冲击响应函数信号，对其进行频谱分析，得到其中心频率和带宽，并对其进行希尔伯特变换并取包络，得到包络的半高宽。用所提出的方法进行数据处理时，需将探头在每个位置所得的 A 扫描时域信号进行希尔伯特变换后取包络，然后再选择一定的时间窗大小，对探头焦区范围 t1 和 t2 之间的信号进行积分。由此得到焦点位置信号的强度：
 |
其中，L 为探头焦距。经过对焦点位置在纵向二维平面上的扫描，就得到了样品在纵向断层截面的图像。
由于系统中成像位置始终位于聚焦超声探头的焦点上，因此可以认为只有来自焦点附近的信号是有效的。为了确定超声探头的焦点位置，首先对超声探头进行了接收效率空间分布测试。测试中使用激光照射一根 0.1 mm 直径的金属丝产生光声信号，并移动超声探头使光声信号源位于不同的相对位置上，最后把每个位置上所获得的时域信号幅度的最大值作为该位置处的超声探头接收效率，得到的超声探头接收效率空间分布如图 2a 所示。通过取图 2a 中每行数据中所有大于该行数据最大值 50% 的数据点的分布范围，获得如图 2b 所示的纵向距离与横向分辨率的关系曲线，从该图中可以发现超声探头的焦距为 16 mm。为了进一步获得该探头焦区的范围，画出了焦点处的时域信号响应，如图 3a 所示。最后将信号中所有幅值大于 10% 最大值的信号确定为焦区信号，从而确定了焦区范围为 10.92～11.59 μs。处理后的数据主要用来生成纵向截面图。
图2
聚焦超声探头接收效率的空间分布及横向分辨率
a. 聚焦超声探头接收效率的空间分布；b. 横向分辨率与纵向距离的相对关系
Figure2. Receiving efficiency distribution and lateral resolution of the focused ultrasound transducera. the spatial distribution of the receiving efficiency of the focused ultrasound transducer; b. the relationship between the lateral resolution and the axial distance
图3
焦区积分区间的确定
a. 聚焦超声探头所接收到的时域信号序列；b. 焦点处有效时域信号序列
Figure3. Determination of the focal integral zonea. photoacoustic signal received by the focused ultrasound transducer; b. the extracted signal of the focal zone
1.3 实验方法
1.3.1 信噪比实验
搭建了一个传统同轴系统与本文实验的非共轴系统信噪比对比实验，以验证所提出方法对成像信噪比的影响。信噪比实验所用的琼脂仿体外径为 30 mm，由琼脂粉、脂肪乳、墨汁制作，散射和吸收系数分别为 1 mm–1 和 0.07 mm–1，与活体宫颈正常组织相接近[22]。实验所使用仿体中横向插入了一根直径为 0.5 mm 的金属丝，其深度为 2 mm。为了进行同轴 PAM 成像，本文使用了如图 4 所示的系统。激光垂直向下穿过一块放置在仿体上方呈 45° 放置的 1 mm 厚度透明玻璃，照射到仿体上表面，仿体中所产生的光声信号被这块透明玻璃反射到放置在仿体上方侧面的聚焦超声探头中。同轴 PAM 以 0.1 mm 的横向步长扫描了仿体中与金属丝垂直的横向长度 6 mm、深度 3 mm 的一个面，并取每个横向位置所对应光声信号时间序列的最大幅值作为对比数据。采用所提出方法扫描了与同轴 PAM 相同的检测面，横向步长为 0.1 mm，深度步长为 0.05 mm，最后取每个横向位置不同深度上的最大信号幅值作为对比数据。
1.3.2 仿体实验
通过仿体实验，对不同深度点目标成像，观测目标位置、噪声背景与拖尾情况，并与传统共轴固定焦点的探测方式进行比较，来验证所提出的方法的有效性。仿体实验所用的琼脂仿体与信噪比试验中相同。在仿体不同位置竖直埋入四根直径为 0.5 mm 的金属丝。其中，金属丝 1、2 纵向深 1 mm，金属丝 3、4 纵向深 3 mm，同一纵向深度的两根金属丝平行且水平方向相距 2 mm。利用步进电机控制，采用聚焦超声换能器对四根金属丝进行断层扫描。
1.3.3 裸鼠肿瘤实验
在光声非共轴探测条件下，本文还采用了纵向移动焦点加焦区积分方法与固定焦点方法，对裸鼠背部肿瘤成像结果进行了对比实验，以验证所提方法在活体组织成像中的效果。裸鼠肿瘤扫描实验选用湖南斯莱克景达实验动物有限公司 6 周龄的 Balb/c 雌性小鼠 6 只。Hela 细胞培养至足够数目后将其悬浮于磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中，取离心后浓度为 5 × 107/mL 的细胞悬浮液 100 μL 注射入裸鼠背部皮下，每日观察肿瘤生长情况。最终有 5 只成瘤，肿瘤细胞注射两周后，肿瘤大小为（162 ± 25.2）mm2。在进行实验前，需将裸鼠从动物房移出，并放置在实验室环境中适应 1～2 d，然后以 0.5 g/kg 的剂量用水合氯醛麻醉 20 min，再进行扫描实验。在进行裸鼠背部肿瘤扫描时，裸鼠麻醉后固定加热板并固定在升降平台上，水槽下有 30 mm × 30 mm 的开口，开口处贴有透明弹性聚乙烯薄膜。裸鼠背部肿瘤置于透明薄膜正下方，裸鼠肿瘤位置和透明薄膜间涂抹超声胶以便超声耦合，如图 5 所示。
图4
同轴光声显微系统
Figure4.
Coaxial photoacoustic microscopy system
图5
裸鼠实验系统装置图
Figure5.
System for nude mice experiments
2 结果与讨论
2.1 信噪比实验
将两种成像方式所获得的信号强度进行统一的归一化处理后，进行曲线对比，结果如图 6 所示。为了评估两种成像模式的信噪比，本文将结果中大于各自最大值 40% 的数据点作为信号，其他的数据点的平均值作为背景噪声计算了同轴和非同轴两种成像模式的信噪比，分别为 3.417 3 dB 和 3.477 2 dB，可见两种成像模式的信噪比基本相当。通常进行 PAM 同轴成像需要使用一面光学透明的超声反射镜，将同轴的光声信号反射到侧面的超声探头中。但激光穿透超声反射镜时会损失一部分能量，光声信号在被反射过程中也会损失一部分能量。虽然同轴 PAM 成像在生物组织中的光学/声学传输路径比所提出方法要短，但其在光声信号检测和激光激发过程中要比所提出方法损失更多的能量，因此所提出方法的信噪比相比同轴 PAM 方法并未出现下降。
图6
典型的同轴与非同轴系统光声信号对比
Figure6.
Comparison between typical photoacoustic signals from coaxial and non-coaxial PAM systems
2.2 仿体实验
实验结果如图 7 所示。其中，图 7a 为金属丝在仿体中的相对位置示意图；图 7b 为本文所述非共轴移动焦点叠加焦区积分方法所得结果，图 7c 为非共轴移动焦点方法所得结果，图 7d 为传统共轴垂直背向固定焦点方法所得结果。图 7b–d 的信号最大值都进行了归一化。可以看到在三幅光声图像内，4 根金属丝都可以清晰地成像，其分布与图 7a 中的金属丝的分布十分吻合。由此可见，在现有条件下，系统都可以对目标的光吸收分布进行真实的还原。
图 7d 中，4 根金属丝在图像中表现出明显的拖尾痕迹，尤其是靠近仿体表层的两根金属丝，其拖尾对下层其它 2 根金属丝信号有明显的干扰。与其相比，采用非共轴探测方式及移动焦点扫描方法后，拖尾现象得到了明显的抑制，如图 7c 所示；然而，在第 1 和第 3 根金属丝之间，即部分离焦区域还是有较严重的杂散信号。图 7b 中，采用焦区积分的方法处理数据后，4 根金属丝的位置都得到了很好的还原，图像背景噪声也最小。同时也注意到，相对于图 7d，在图 7b、c 中下面两根金属丝的横向尺寸更小。这说明本文所提出的纵向移动焦点的方法不仅可以很好地消除目标信号的拖尾现象，还能在较大的纵向深度内保持较高的横向分辨率。通过截取图 7b 各金属丝中心横向轮廓，并且测量其半高宽可得，各金属丝的横向轮廓平均大小约为 0.61 mm，即在本文所提出的方法的设置下，系统横向分辨率约为 0.61 mm。这与现所用 10 MHz 聚焦探头（孔径 8 mm，焦距 15 mm）在 45° 方向上的横向分辨率理论值 0.52 mm 相接近。
图7
点目标仿体实验结果
a. 仿体中目标的位置；b. 移动焦点扫描加焦区积分处理结果图；c. 移动焦点扫描结果图；d. 固定焦点扫描结果图
Figure7. Results of point target experimenta. point target positions in the phantom; b. result of multiple axial scanning combined with focal zone integral; c. result of multiple axial scanning; d. result of focus fixed scanning
2.3 裸鼠肿瘤实验
图 8a 为裸鼠肿瘤实物照片，图 8b 为固定焦点方法和移动焦点叠加焦区积分方法所对应的结果，图中信号最大值都已归一化到 1。如图 8a 所示，肿瘤大小约为 13 mm，实验中聚焦探头沿着图 8a 中黑色虚线箭头所示方向进行扫描探测，扫描距离为 18 mm，采样间隔为 0.1 mm。为了对深层成像效果进行定量分析，本文还在 1、2、3 mm 的深度上分别对比了以上两种成像方式的结果，如图 8c 所示。
从图 8b 中可以看出，两幅图都给出了肿瘤表面较为清晰的轮廓。然而，图 8b 左图中的肿瘤只有在顶部有较强信号，顶部以下结构的信号强度很小。与其相比，图 8b 右图中肿瘤侧边轮廓更清晰，且显示了更多的肿瘤内部结构。这是由于在图 8b 左图中，聚焦探头焦平面在肿瘤顶部附近，因此焦平面下方信号收集效率低，横向分辨率也较低。而用纵向移动焦点加焦区积分的方法，可以更好地保证纵向上每个位置的分辨率和超声接收效率，从而得到更好的成像结果。
从图 8c 中可以看出，成像深度越深，两种成像方式所获得的信息量差异越大。图 8c 左图为深度在皮肤下 1 mm 处，即为图 b 中标注的 1 mm 深处的光声信号。红色折线为固定焦点方法的结果，蓝色折线为经过焦区积分处理的移动焦点系统结果，可以看出在 1 mm 深度两种方法均能看到较多的肿瘤边缘信息。在 2 mm 的深度上，如图 8c 中图所示，红色信号线固定焦点方式的结果中信号幅度已经非常小，基本无法提供有价值的信息，而本文所提出的方法仍然能够提供一定的肿瘤深层的相关光吸收信息。
此外，本文还在成像实验后从小鼠皮下取出了完整的肿瘤组织，并测量了其在深度上的尺寸，结果如图 8a 右图所示。可见肿瘤从顶部到底部的距离约为 10 mm，本文所提出的方法检测到了其 6.5 mm 深度上的信息，而固定焦点方式的检测深度未超过 2 mm。
图8
裸鼠肿瘤实验结果
a. 裸鼠肿瘤照片图；b. 光声显微系统裸鼠肿瘤结果图；c. 两种方法距离表面不同深度肿瘤信号对比图
Figure8. Results of xenograft experiments on nude micea. photos of in-vivo and excised tumor; b. PAM reconstruction results of the tumor; c. comparison of the tumor reconstructed profiles at different depths between the two methods
3 结论
本研究搭建了一套声聚焦 PAM 实验系统。采用聚焦探头和光纤与水平面分别成 45° 角的非共轴的照明-探测方式，来减少浅表目标组织对深层信息的影响，并且采用了纵向滑动焦点和焦区积分的数据处理方法来保证不同深度上较高的横向分辨率。仿体测试表明，所提出的方法在纵向各深度上都能保持约 0.6 mm 的横向分辨率，与理论值相一致。该方法有效解决了在常规声聚焦 PAM 中横向分辨率与焦深的矛盾，以及组织深层目标易被浅表目标屏蔽这两个问题，并且在随后的裸鼠背部肿瘤活体实验中对其成像效果进行了验证。虽然由于纵向多次变焦扫描所用时间较长，但是随着超快脉冲激光和高速步进电机的发展与应用，该方法将有效克服扫描时间过长的障碍，有望在脑部血管成像、宫颈癌内窥成像、表皮肿瘤成像等方面得到较好的应用。
引言
光声成像是一种新型的无损生物成像技术。这种成像模态使用超短脉冲激光照射生物组织，通过探测光声效应所产生的光声信号来检测样品中的光吸收参数变化，兼具光学成像的高灵敏度以及超声成像的高穿透深度和高空间分辨率的优点[1-10]。光声显微成像（photoacoustic microscopy，PAM）作为光声成像的重要分支，通常通过检测某个激光光路上所产生的超声时域信号来直接分析该路径上光吸收量的分布情况，而不需要使用逆向重建算法。按照空间分辨率的提供方式，光声显微系统一般分为两种类型，一种是光聚焦 PAM，通过激光聚焦获得高空间分辨率，但由于生物组织对光的强散射作用，其成像只限于浅表层，平均深度不超过光子平均自由程[11-12]。另一种是声聚焦 PAM，通过超声聚焦获得空间分辨率，由于超声在生物组织中的散射效应远小于光，这种方法即使在组织内光子自由程范围外仍然能够获得高分辨率的图像，并且已经成功地应用在肿瘤、深层血管等活体组织成像中[13-18]。
然而，在常见的声聚焦 PAM 中，通常采用一个与激光光路同轴的聚焦超声探头来获取整个激光光路上所产生的超声时间序列。这种成像方式会导致在同一激光光路上深层目标的光声信号可能被淹没在浅层目标光声信号的拖尾中，从而降低系统对深层目标检测的灵敏度[19]。此外，由于超声探头的焦点被固定在某个深度上，系统的横向空间分辨率会随着远离聚焦区域而显著降低[20]。汪力宏课题组[12]在 2005 年提出了一种暗场共聚焦 PAM 系统，这一系统采用一个锥形镜暗场照明系统，有效降低了超声探头正下方表面组织的光照强度，从而极大地减小了表面组织对深层目标信号的影响，并使用高数值孔径的聚焦探头来提高系统的横向分辨率。2012 年，刘炎炎等[21]在汪力宏组类似的暗场光声显微系统的基础上，进一步提出了一种基于稀疏扫描轮廓的滑动焦点 PAM 方法，通过在平面扫描过程中不断调节探头的聚焦深度，使得感兴趣的目标样品始终处于焦深的范围，从而获得分辨率和信噪比均匀的光声显微图像。但刘炎炎等的实验只是对二维平面扫描的优化，并没给出完整的三维图像。
本文搭建了一套声聚焦 PAM 系统，采用一种非共轴的照明-探测方法来减少浅层组织对深层信息的影响。这种方法中，超声检测波束和激光光路相互垂直且聚焦超声探头的焦点始终位于两者的交汇点上，并将所获取的光声信号作为该位置上的光声成像结果，移动该交汇点遍历成像区域，从而获得完整图像。此外，由于聚焦超声探头的焦点始终处于当前的成像深度，这种方法也能够在不同的成像深度上保持基本一致的空间分辨率。
1 系统与方法
1.1 成像系统
实验系统设置如图 1 上图所示。激光器（Q-switched Nd：YAG，北京镭宝光电技术有限公司）所产生的 532 nm 脉冲激光被凸透镜聚焦之后耦合进一根芯径为 0.8 mm 的多模光纤中，光纤另一端的出射光被另一个凸透镜进行整形之后与水平面呈 45° 角入射到水槽中的样品中。一个中心频率为 10 MHz 的聚焦超声探头（A312S-N-SU，日本 Olympus Co，焦距约为 15 mm，横向分辨率和纵向分辨率分别为 0.4 mm 和 0.2 mm）被用于采集光声信号，这个超声探头同样与水平面呈 45° 角安装固定，且超声探头的焦点被放置在超声检测波束和激光光路的交点上。光纤的出射端、出射光整形透镜和聚焦超声探头一起被安装在一个 TSA 电控位移台（TSA150-b，北京卓立汉光仪器有限公司）上以实现水平和纵向移动且步进均为 0.1 mm。超声探头所接收到的光声信号在经过超声脉冲发射接收器（5072PR，日本 Olympus Co）的滤波和放大之后被计算机中的数据采集卡（Spectrum M4i 2223-x8，北京坤驰科技有限公司，双通道，最大采样速率 2.5 GS/s，最大带宽 1 GHz）记录和保存。整个系统的触发信号由脉冲激光器提供，数据的采样频率为 100 MHz。在成像时，聚焦超声探头和光纤出射端同步进行垂直和水平移动。对于某个移动位置而言，当前聚焦超声探头的焦点位置为其成像位置，在该位置上只测量该成像位置上的光声信号。在完成全部水平和垂直移动之后可以最终获得一幅样品的 B 扫描图像。平移台的移动由计算机中的 Labview 程序通过电机控制器（SC300，北京卓立汉光仪器有限公司）进行管理。本文实验在精密光学平台（OTPOT18-12，北京卓立汉光仪器有限公司）完成。
这一系统中，由于激光光路和聚焦超声探头的检测波束相互垂直，且超声探头焦点始终位于超声探头检测波束和激光光路的交汇位置上，因此激光光路上来自浅表层的光声信号将被超声探头的聚焦效应所压制，从而降低了浅表层光声信号对深层目标检测的干扰。此外，由于聚焦超声探头焦点始终处于当前的成像位置上，其空间分辨率也不会随成像深度的改变而发生显著变化。图 1 下图显示了聚焦超声探头探测波束与激光光路的关系。
图1
所用 PAM 成像系统与光声探测方法
Figure1.
The PAM system and its optical-ultrasonic detection arrangements
1.2 数据处理方法
数据处理采用 matlab 进行。先获得系统中聚焦探头焦点处的冲击响应函数信号，对其进行频谱分析，得到其中心频率和带宽，并对其进行希尔伯特变换并取包络，得到包络的半高宽。用所提出的方法进行数据处理时，需将探头在每个位置所得的 A 扫描时域信号进行希尔伯特变换后取包络，然后再选择一定的时间窗大小，对探头焦区范围 t1 和 t2 之间的信号进行积分。由此得到焦点位置信号的强度：
|
其中，L 为探头焦距。经过对焦点位置在纵向二维平面上的扫描，就得到了样品在纵向断层截面的图像。
由于系统中成像位置始终位于聚焦超声探头的焦点上，因此可以认为只有来自焦点附近的信号是有效的。为了确定超声探头的焦点位置，首先对超声探头进行了接收效率空间分布测试。测试中使用激光照射一根 0.1 mm 直径的金属丝产生光声信号，并移动超声探头使光声信号源位于不同的相对位置上，最后把每个位置上所获得的时域信号幅度的最大值作为该位置处的超声探头接收效率，得到的超声探头接收效率空间分布如图 2a 所示。通过取图 2a 中每行数据中所有大于该行数据最大值 50% 的数据点的分布范围，获得如图 2b 所示的纵向距离与横向分辨率的关系曲线，从该图中可以发现超声探头的焦距为 16 mm。为了进一步获得该探头焦区的范围，画出了焦点处的时域信号响应，如图 3a 所示。最后将信号中所有幅值大于 10% 最大值的信号确定为焦区信号，从而确定了焦区范围为 10.92～11.59 μs。处理后的数据主要用来生成纵向截面图。
图2
聚焦超声探头接收效率的空间分布及横向分辨率
a. 聚焦超声探头接收效率的空间分布；b. 横向分辨率与纵向距离的相对关系
Figure2. Receiving efficiency distribution and lateral resolution of the focused ultrasound transducera. the spatial distribution of the receiving efficiency of the focused ultrasound transducer; b. the relationship between the lateral resolution and the axial distance
图3
焦区积分区间的确定
a. 聚焦超声探头所接收到的时域信号序列；b. 焦点处有效时域信号序列
Figure3. Determination of the focal integral zonea. photoacoustic signal received by the focused ultrasound transducer; b. the extracted signal of the focal zone
1.3 实验方法
1.3.1 信噪比实验
搭建了一个传统同轴系统与本文实验的非共轴系统信噪比对比实验，以验证所提出方法对成像信噪比的影响。信噪比实验所用的琼脂仿体外径为 30 mm，由琼脂粉、脂肪乳、墨汁制作，散射和吸收系数分别为 1 mm–1 和 0.07 mm–1，与活体宫颈正常组织相接近[22]。实验所使用仿体中横向插入了一根直径为 0.5 mm 的金属丝，其深度为 2 mm。为了进行同轴 PAM 成像，本文使用了如图 4 所示的系统。激光垂直向下穿过一块放置在仿体上方呈 45° 放置的 1 mm 厚度透明玻璃，照射到仿体上表面，仿体中所产生的光声信号被这块透明玻璃反射到放置在仿体上方侧面的聚焦超声探头中。同轴 PAM 以 0.1 mm 的横向步长扫描了仿体中与金属丝垂直的横向长度 6 mm、深度 3 mm 的一个面，并取每个横向位置所对应光声信号时间序列的最大幅值作为对比数据。采用所提出方法扫描了与同轴 PAM 相同的检测面，横向步长为 0.1 mm，深度步长为 0.05 mm，最后取每个横向位置不同深度上的最大信号幅值作为对比数据。
1.3.2 仿体实验
通过仿体实验，对不同深度点目标成像，观测目标位置、噪声背景与拖尾情况，并与传统共轴固定焦点的探测方式进行比较，来验证所提出的方法的有效性。仿体实验所用的琼脂仿体与信噪比试验中相同。在仿体不同位置竖直埋入四根直径为 0.5 mm 的金属丝。其中，金属丝 1、2 纵向深 1 mm，金属丝 3、4 纵向深 3 mm，同一纵向深度的两根金属丝平行且水平方向相距 2 mm。利用步进电机控制，采用聚焦超声换能器对四根金属丝进行断层扫描。
1.3.3 裸鼠肿瘤实验
在光声非共轴探测条件下，本文还采用了纵向移动焦点加焦区积分方法与固定焦点方法，对裸鼠背部肿瘤成像结果进行了对比实验，以验证所提方法在活体组织成像中的效果。裸鼠肿瘤扫描实验选用湖南斯莱克景达实验动物有限公司 6 周龄的 Balb/c 雌性小鼠 6 只。Hela 细胞培养至足够数目后将其悬浮于磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中，取离心后浓度为 5 × 107/mL 的细胞悬浮液 100 μL 注射入裸鼠背部皮下，每日观察肿瘤生长情况。最终有 5 只成瘤，肿瘤细胞注射两周后，肿瘤大小为（162 ± 25.2）mm2。在进行实验前，需将裸鼠从动物房移出，并放置在实验室环境中适应 1～2 d，然后以 0.5 g/kg 的剂量用水合氯醛麻醉 20 min，再进行扫描实验。在进行裸鼠背部肿瘤扫描时，裸鼠麻醉后固定加热板并固定在升降平台上，水槽下有 30 mm × 30 mm 的开口，开口处贴有透明弹性聚乙烯薄膜。裸鼠背部肿瘤置于透明薄膜正下方，裸鼠肿瘤位置和透明薄膜间涂抹超声胶以便超声耦合，如图 5 所示。
图4
同轴光声显微系统
Figure4.
Coaxial photoacoustic microscopy system
图5
裸鼠实验系统装置图
Figure5.
System for nude mice experiments
2 结果与讨论
2.1 信噪比实验
将两种成像方式所获得的信号强度进行统一的归一化处理后，进行曲线对比，结果如图 6 所示。为了评估两种成像模式的信噪比，本文将结果中大于各自最大值 40% 的数据点作为信号，其他的数据点的平均值作为背景噪声计算了同轴和非同轴两种成像模式的信噪比，分别为 3.417 3 dB 和 3.477 2 dB，可见两种成像模式的信噪比基本相当。通常进行 PAM 同轴成像需要使用一面光学透明的超声反射镜，将同轴的光声信号反射到侧面的超声探头中。但激光穿透超声反射镜时会损失一部分能量，光声信号在被反射过程中也会损失一部分能量。虽然同轴 PAM 成像在生物组织中的光学/声学传输路径比所提出方法要短，但其在光声信号检测和激光激发过程中要比所提出方法损失更多的能量，因此所提出方法的信噪比相比同轴 PAM 方法并未出现下降。
图6
典型的同轴与非同轴系统光声信号对比
Figure6.
Comparison between typical photoacoustic signals from coaxial and non-coaxial PAM systems
2.2 仿体实验
实验结果如图 7 所示。其中，图 7a 为金属丝在仿体中的相对位置示意图；图 7b 为本文所述非共轴移动焦点叠加焦区积分方法所得结果，图 7c 为非共轴移动焦点方法所得结果，图 7d 为传统共轴垂直背向固定焦点方法所得结果。图 7b–d 的信号最大值都进行了归一化。可以看到在三幅光声图像内，4 根金属丝都可以清晰地成像，其分布与图 7a 中的金属丝的分布十分吻合。由此可见，在现有条件下，系统都可以对目标的光吸收分布进行真实的还原。
图 7d 中，4 根金属丝在图像中表现出明显的拖尾痕迹，尤其是靠近仿体表层的两根金属丝，其拖尾对下层其它 2 根金属丝信号有明显的干扰。与其相比，采用非共轴探测方式及移动焦点扫描方法后，拖尾现象得到了明显的抑制，如图 7c 所示；然而，在第 1 和第 3 根金属丝之间，即部分离焦区域还是有较严重的杂散信号。图 7b 中，采用焦区积分的方法处理数据后，4 根金属丝的位置都得到了很好的还原，图像背景噪声也最小。同时也注意到，相对于图 7d，在图 7b、c 中下面两根金属丝的横向尺寸更小。这说明本文所提出的纵向移动焦点的方法不仅可以很好地消除目标信号的拖尾现象，还能在较大的纵向深度内保持较高的横向分辨率。通过截取图 7b 各金属丝中心横向轮廓，并且测量其半高宽可得，各金属丝的横向轮廓平均大小约为 0.61 mm，即在本文所提出的方法的设置下，系统横向分辨率约为 0.61 mm。这与现所用 10 MHz 聚焦探头（孔径 8 mm，焦距 15 mm）在 45° 方向上的横向分辨率理论值 0.52 mm 相接近。
图7
点目标仿体实验结果
a. 仿体中目标的位置；b. 移动焦点扫描加焦区积分处理结果图；c. 移动焦点扫描结果图；d. 固定焦点扫描结果图
Figure7. Results of point target experimenta. point target positions in the phantom; b. result of multiple axial scanning combined with focal zone integral; c. result of multiple axial scanning; d. result of focus fixed scanning
2.3 裸鼠肿瘤实验
图 8a 为裸鼠肿瘤实物照片，图 8b 为固定焦点方法和移动焦点叠加焦区积分方法所对应的结果，图中信号最大值都已归一化到 1。如图 8a 所示，肿瘤大小约为 13 mm，实验中聚焦探头沿着图 8a 中黑色虚线箭头所示方向进行扫描探测，扫描距离为 18 mm，采样间隔为 0.1 mm。为了对深层成像效果进行定量分析，本文还在 1、2、3 mm 的深度上分别对比了以上两种成像方式的结果，如图 8c 所示。
从图 8b 中可以看出，两幅图都给出了肿瘤表面较为清晰的轮廓。然而，图 8b 左图中的肿瘤只有在顶部有较强信号，顶部以下结构的信号强度很小。与其相比，图 8b 右图中肿瘤侧边轮廓更清晰，且显示了更多的肿瘤内部结构。这是由于在图 8b 左图中，聚焦探头焦平面在肿瘤顶部附近，因此焦平面下方信号收集效率低，横向分辨率也较低。而用纵向移动焦点加焦区积分的方法，可以更好地保证纵向上每个位置的分辨率和超声接收效率，从而得到更好的成像结果。
从图 8c 中可以看出，成像深度越深，两种成像方式所获得的信息量差异越大。图 8c 左图为深度在皮肤下 1 mm 处，即为图 b 中标注的 1 mm 深处的光声信号。红色折线为固定焦点方法的结果，蓝色折线为经过焦区积分处理的移动焦点系统结果，可以看出在 1 mm 深度两种方法均能看到较多的肿瘤边缘信息。在 2 mm 的深度上，如图 8c 中图所示，红色信号线固定焦点方式的结果中信号幅度已经非常小，基本无法提供有价值的信息，而本文所提出的方法仍然能够提供一定的肿瘤深层的相关光吸收信息。
此外，本文还在成像实验后从小鼠皮下取出了完整的肿瘤组织，并测量了其在深度上的尺寸，结果如图 8a 右图所示。可见肿瘤从顶部到底部的距离约为 10 mm，本文所提出的方法检测到了其 6.5 mm 深度上的信息，而固定焦点方式的检测深度未超过 2 mm。
图8
裸鼠肿瘤实验结果
a. 裸鼠肿瘤照片图；b. 光声显微系统裸鼠肿瘤结果图；c. 两种方法距离表面不同深度肿瘤信号对比图
Figure8. Results of xenograft experiments on nude micea. photos of in-vivo and excised tumor; b. PAM reconstruction results of the tumor; c. comparison of the tumor reconstructed profiles at different depths between the two methods
3 结论
本研究搭建了一套声聚焦 PAM 实验系统。采用聚焦探头和光纤与水平面分别成 45° 角的非共轴的照明-探测方式，来减少浅表目标组织对深层信息的影响，并且采用了纵向滑动焦点和焦区积分的数据处理方法来保证不同深度上较高的横向分辨率。仿体测试表明，所提出的方法在纵向各深度上都能保持约 0.6 mm 的横向分辨率，与理论值相一致。该方法有效解决了在常规声聚焦 PAM 中横向分辨率与焦深的矛盾，以及组织深层目标易被浅表目标屏蔽这两个问题，并且在随后的裸鼠背部肿瘤活体实验中对其成像效果进行了验证。虽然由于纵向多次变焦扫描所用时间较长，但是随着超快脉冲激光和高速步进电机的发展与应用，该方法将有效克服扫描时间过长的障碍，有望在脑部血管成像、宫颈癌内窥成像、表皮肿瘤成像等方面得到较好的应用。
