非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌的 80% 以上，吉西他滨联合顺铂已成为目前治疗 NSCLC 的一线化疗方案。本研究旨在探讨 18氟-氟代脱氧葡萄糖（18F-FDG）和 18氟-氟代脱氧胸腺嘧啶（18F-FLT）的小动物正电子（microPET）显像早期监测吉西他滨联合顺铂治疗 NSCLC 疗效的价值。以荷 Lewis 肺癌的 C57BL/6 小鼠作为动物模型，实验组给予吉西他滨加顺铂联合化疗，对照组给予等量生理盐水处理。分别在治疗前和治疗后第 3 天进行 18F-FDG 和 18F-FLT 的 microPET 显像，观察实验组及对照组动物肿瘤体积及 18F-FDG、18F-FLT 摄取的变化。显像结束后处死部分小鼠，取肿瘤组织进行苏木精-伊红（HE）染色及抗原 Ki67 免疫组化染色。与对照组相比，实验组的肿瘤生长明显受到抑制（P<0.05）。在实验组中，18F-FLT 的最大标准化摄取值（SUVmax）从治疗前的 0.59±0.05 下降至治疗后第 3 天的 0.28±0.05，结果显示差异具有统计学意义（P<0.05），而 18F-FDG 的 SUVmax 从治疗前的 4.35±0.46 下降至治疗后第 3 天的 4.02±0.47，结果显示差异不具有统计学意义（P>0.05）。组织学结果显示，在采用吉西他滨加顺铂治疗后，肿瘤增殖指标抗原 Ki67 出现明显下降（P<0.05）。HE 染色提示化疗后肿瘤组织中有较多坏死细胞及炎性细胞。本研究结果提示，18F-FLT 比 18F-FDG 能够更早期监测吉西他滨联合顺铂治疗 NSCLC 的效果；此外，18F-FLT 受化疗后肿瘤组织中的炎症反应干扰更小。
引用本文： 邢岩, 王甜甜, 郭李磊, 孙娜, 赵晋华. 18氟-氟代脱氧葡萄糖与 18氟-氟代胸腺嘧啶用于吉西他滨联合顺铂治疗非小细胞肺癌动物模型的早期疗效监测比较 . 生物医学工程学杂志, 2017, 34(3): 409-414. doi: 10.7507/1001-5515.201610011 复制
引言
肺癌的病死率位居全世界恶性肿瘤之首[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占原发性肺癌的 80% 以上，大部分患者确诊时已属无法手术切除的局部晚期或者已出现远处转移；即使诊断为早期肺癌，也有 50% 以上的患者会出现术后转移；因此大部分的 NSCLC 患者需要接受化疗。吉西他滨联合顺铂已经成为治疗 NSCLC 患者的一线化疗方案[2]。然而在临床应用中，吉西他滨加顺铂联合化疗也只对一部分患者有治疗效果。此外，肿瘤的生物学行为差异极大，同种类型肿瘤的不同个体，甚至同一个体的不同阶段，对同样的化疗药物敏感性也有所不同。因此，早期评价疗效可以帮助临床医生制定个体化治疗方案，避免不必要的药物毒性及经济上的浪费。
肿瘤疗效评估普遍采用以肿瘤形态学变化为基础的实体瘤疗效评估标准（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST），然而肿瘤对治疗的反应包含了一系列生物学变化过程，形态上的变化明显滞后于功能代谢的变化。正电子发射断层显像（positron emission tomography，PET）作为一种无创性功能成像模式，已被用于肿瘤疗效评价，尤其是治疗后的早期评价。目前临床应用最广泛的 PET 显像剂是 18 氟-氟代脱氧葡萄糖（18F-fluorode-oxyglucose，18F-FDG），18F-FDG 主要反映葡萄糖代谢水平，其缺点在于非肿瘤特异性，在炎症组织中也会有 18F-FDG 的高摄取[3]。作为胸腺嘧啶类似物，18 氟-氟代胸腺嘧啶（18F-fluorothymidine，18F-FLT）的 PET 显像可以反映活体内细胞增殖情况。在一些临床前期研究中，18F-FLT PET 就被用于监测治疗后的肿瘤细胞增殖变化。然而这些研究的结论不尽相同，部分研究结果显示 18F-FLT PET 能够早期监测肿瘤治疗后的细胞增殖情况；另一些研究显示尽管肿瘤对治疗有良好反应，但肿瘤对 18F-FLT 的摄取却没有明显变化[4-8]。在本文中，我们模拟临床化疗方案对 NSCLC 动物模型进行吉西他滨联合顺铂治疗，比较 18F-FDG 和 18F-FLT 两种 PET 显像剂在早期监测化疗疗效方面的价值；以期在临床实践中，应用 PET 显像早期监测吉西他滨联合顺铂治疗 NSCLC 患者的疗效。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
回旋加速器（MINI trace，美国 GE 公司）；多功能合成仪（TRACERlab FX-Fn，美国 GE 公司）；小动物 PET 仪（Inveon，德国 Siemens 公司）；洛斯维帕克纪念所 1640（Roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶（美国 Gibco 公司）；兔抗鼠 Ki67 多克隆抗体（英国 Abcam 公司）；顺铂（山东齐鲁制药厂）；吉西他滨（誉捷，哈尔滨誉衡药业有限公司）；叔丁氧羰基（t-Butyloxy carbonyl，BOC）前体、碳酸钾、乙腈、乙醇、乙酸钠、氨基聚醚 2.2.2（Kryptofix 2.2.2）均购自常熟华益化工有限公司。
1.2 细胞与动物模型
鼠肺腺癌细胞株 Lewis 细胞购自南京凯基生物科技发展有限公司，采用 RPMI 1640 细胞培养基（含 10% 胎牛血清、50 μg/mL 青霉素、50 μg/mL 链霉素）置于 37℃、5% CO2 孵箱中培养。C57BL/6 小鼠（雌性，4～6 周龄，体重 18～22 g）购于扬州大学比较医学中心，按无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级标准饲养于上海市第一人民医院实验动物中心层流架内，恒温（20～26℃）、恒湿（50%～65%），进食饮水自由。收集对数生长期 Lewis 肺癌细胞，取细胞数 2.5×107 个/mL 接种 0.2 mL 于小鼠右前肢皮下，每天测量并记录肿瘤大小（肿瘤体积=0.52×长×宽2）。当肿瘤体积达到大于 300 mm3 时开始进行实验分组。
1.3 动物分组及处理
将 36 只荷瘤小鼠随机分为实验组和对照组，各组又随机分为 18F-FLT 和 18F-FDG 组，每组 9 只。实验组给予吉西他滨+顺铂联合化疗，腹腔注射吉西他滨，按 50 mg/kg 给药，体积约 0.5～0.7 mL；注射吉西他滨 4 h 后腹腔注射顺铂，按 6 mg/kg 给药，体积约 0.5～0.7 mL。对照组小鼠腹腔注射同等体积的生理盐水。在治疗前和治疗后第 3 天，分别对实验组和对照组进行 18F-FDG 以及 18F-FLT 小动物 PET 显像；每次显像结束后分别取实验组和对照组中 3 只小鼠处死，取肿瘤组织进行病理分析。对剩余的荷瘤小鼠，继续每天测量并记录肿瘤大小，一直观测到治疗后第7天，根据肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线。
1.4 18F-FDG 及 18F-FLT 小动物 PET 显像及图像处理
显像剂来源：18F-FLT 由本院正电子药物中心利用前体物质 3-N-t-叔丁氧羰基-1-[5’-O-（4，4’-二甲氧基三苯甲基）-2’-脱氧-3’-O-（4-硝基苯磺酰基-β-1）-苏戊呋喃糖]胸腺嘧啶脱氧核苷（N-BOC-FLT）合成，合成方法参照文献[9]。产率约 15%，放化纯度>90%。18F-FDG 来自日常临床所用，购于上海原子高科有限公司。
小动物 PET 显像：① 18F-FDG 显像：荷瘤小鼠需空腹 6 h 上，经尾静脉注射 18F-FDG 100～200 μCi；注射显像剂 40～50 min 后，以 2% 异氟烷气体吸入麻醉，固定在 PET 扫描架上，进行 PET 扫描 20 min。② 18F-FLT 显像：荷瘤小鼠无需空腹，尾静脉注射 18F-FLT 100～200 μCi，注射显像剂 50～60 min 后，以 2% 异氟烷气体吸入麻醉，固定在 PET 扫描架上，进行 PET 扫描 20 min。所有显像结果均使用图像采集软件（Inveon Acquisition Workplace，德国 Siemens 公司）和图像分析软件（ASIPro VM，德国 Siemens 公司）进行图像处理。通过沿肿瘤边缘勾画感兴趣区（regions of inte-rest，ROIs）后由计算机自动计算肿瘤的最大标准化摄取值（maximal standardized uptake value，SUVmax）。
1.5 病理学检查
取肿瘤组织后进行固定、包埋及石蜡切片，并进行苏木精-伊红（Hematoxylin and eosin，HE）染色和抗原 Ki67 染色，于光学显微镜下观察各组切片的 HE 染色结果及抗原 Ki67 免疫组化染色结果并摄像。Ki67 阳性染色表现为细胞核染成棕褐色或棕黄色，高倍镜下观察 5 个视野（左上、右上、左下、右下及中间），采用定量法计算 Ki67 阳染细胞占总肿瘤细胞数的百分比。
1.6 统计学分析
结果以均数±标准差表示，采用绘制医学图表软件 GraphPad Prism 5 行统计分析，实验组与对照组荷瘤小鼠的肿瘤体积采用独立样本 t 检验。不同时间 18F-FDG 和 18F-FLT 摄取及两组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 吉西他滨加顺铂联合化疗对肿瘤生长的抑制
如图 1 所示，治疗前实验组和对照组小鼠的肿瘤体积差异无统计学意义，在治疗后的 7 天中，对照组的肿瘤体积随时间延长呈持续上升，而实验组的肿瘤体积没有明显增长。从治疗后第 4 天开始，实验组和对照组的肿瘤体积出现了差异，差异具有统计学意义（P<0.05），对照组的肿瘤体积从治疗前的（365.67±35.83）mm3 上升至治疗后第7天的（1 677.3±181.01）mm3，而实验组肿瘤体积从治疗前的（368.50±26.99）mm3上升至治疗后第 7 天的（408.17±26.58）mm3。
图1
实验组与对照组的肿瘤生长曲线 * P<0.05，实验组 vs. 对照组
Figure1.
Tumor growth curve of treated group and control group * P<0.05, treated group vs. control group
2.2 18F-FDG 和 18F-FLT 显像结果
如图 2、图 3 所示，治疗前实验组和对照组小鼠的肿瘤部位均可见 18F-FDG 和 18F-FLT 摄取，肿瘤部位以虚线圈出。治疗前，实验组肿瘤的 18F-FDG SUVmax 为 4.35±0.46，对照组小鼠肿瘤的 18F-FDG SUVmax 为 4.43±0.21，结果显示差异不具有统计学意义（P>0.05）。治疗前，实验组肿瘤的 18F-FLT SUV-max 为 0.59±0.05，对照组小鼠肿瘤的 18F-FLT SUV-max 为 0.51±0.06，结果显示差异不具有统计学意义（P>0.05）。无论是实验组还是对照组，治疗前肿瘤的 18F-FDG SUVmax 大约是 18F-FLT SUVmax 的 7～8 倍。
图2
实验组和对照组的 18F-FDG PET 显像 *为治疗后第 3 天，实验组与对照组比较，P<0.001
Figure2.
18F-FDG PET imaging of treated group and control group *, P<0.001, treated group vs. control group on day 3
图3
实验组和对照组的 18F-FLT PET 显像 #P<0.05，治疗后第 3 天，实验组与治疗前比较；*P<0.001，治疗后第 3 天，实验组与对照组比较
Figure3.
18F-FLT PET imaging of treated group and control group #P<0.05, treated group vs. baseline on day 3; *P<0.001, treated group vs. control group on day 3
在吉西他滨联合顺铂治疗后第 3 天，实验组小鼠肿瘤的 18F-FDG 摄取明显低于对照组，结果显示差异具有统计学意义（P<0.001）。而与治疗前 PET 结果相比，实验组小鼠肿瘤对 18F-FDG 的摄取差异不具有统计学意义（P>0.05）。另一方面，治疗后第 3 天，实验组小鼠肿瘤对 18F-FLT 的摄取明显低于对照组，结果显示差异具有统计学意义（P<0.001）；而且与治疗前相比，实验组肿瘤对 18F-FLT 的摄取明显低于治疗前的基线水平，结果显示差异具有统计学意义（P<0.05）。
2.3 病理检查结果
抗原 Ki67 免疫组化染色结果显示，经过吉西他滨联合顺铂治疗后第 3 天，肿瘤组织中的 Ki67 染色就出现了明显下降，Ki67 阳性细胞百分比明显低于治疗前的基线水平，结果显示差异具有统计学意义（P<0.05）。而HE染色结果显示，经过吉西他滨联合顺铂治疗后，肿瘤组织中出现了大量的炎性细胞和坏死细胞，结果如图 4 所示。
图4
肿瘤组织的病理学结果（×20） *P<0.05，治疗后第 3 天实验组与对照组比较
Figure4.
Histopathologic results of tumor xenografts（×20） *P<0.05, treated group vs. control group on day 3
3 讨论
对肿瘤进行早期准确的疗效监测可以使患者避免接受不必要的治疗，因此具有重要的临床意义。PET 显像能够无创、动态地显示机体内生理代谢状况，并且早于实体肿瘤体积的变化，更适合早期评价肿瘤的治疗效果。PET 显像示踪剂种类繁多，可以反映肿瘤的葡萄糖代谢、氨基酸和蛋白质合成、核苷代谢、氧代谢、乙酸盐代谢及胆碱代谢等不同生理变化。近年来，已有众多国内外研究者应用 18F-FDG 和 18F-FLT 这两种 PET 显像剂对不同种类的肿瘤进行诊断和疗效评估[10-11]。
18F-FDG 是主要反映肿瘤细胞葡萄糖代谢水平的 PET 显像剂，被广泛应用于肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、食管癌等多种肿瘤的诊断及鉴别诊断、分期及临床预后评估，但一些炎性病变也可以不同程度摄取 18F-FDG，容易造成假阳性结果。在化疗早期，肿瘤部位会出现炎性细胞，大量摄取 18F-FDG，从而严重影响 18F-FDG 对化疗早期效果的真实评价。
作为一种胸腺嘧啶的类似物，18F-FLT 能够和胸腺嘧啶一样进入细胞并掺入 DNA。18F-FLT 在细胞质内的胸腺嘧啶核苷激酶 1（thymidine kinase 1，TK1）作用下发生磷酸化，生成 18F-FLT-磷酸盐。由于 3’-端氟原子的交换，18F-FLT-磷酸盐不能进一步参与 DNA 的合成，也不能通过细胞膜返回组织液而滞留在细胞内，从而可以进行 PET 显像。TK1 是细胞 DNA 补救合成过程中的关键酶，存在于增殖细胞的 S 期和 G1 期，在静止期细胞中无酶活性。肿瘤细胞在增殖过程中，DNA 合成增加从而对核苷类底物的利用增加，使得在肿瘤增殖细胞 G1 期后期和 S 期 TK1 的活性达到最大。18F-FLT 通过反映 TK1 活性而反映细胞的增殖状况，提高了对肿瘤细胞早期化疗评估的准确度[12-13]。抗原 Ki67 是一种与细胞增殖密切相关的蛋白，其表达从细胞周期 G1 后期开始出现，至 M 期达到高峰，在有丝分裂结束后迅速降解，而 G0 和 G1 期细胞不表达，因此 Ki67 相对于其他增殖指标如增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），更能全面反映增殖细胞的数量。
在本研究中，我们应用 18F-FDG 和 18F-FLT 两种不同的 PET 显像剂，在动物体内实时、无创地监测了经过吉西他滨加顺铂联合治疗后，NSCLC 的早期葡萄糖代谢及细胞增殖的变化情况。结果显示，吉西他滨联合顺铂化疗能够明显抑制 Lewis 肿瘤的生长。在治疗后第 3 天，肿瘤对 18F-FLT 和 18F-FDG 的摄取较治疗前的基线水平均有不同程度的下降，相比之下，18F-FDG 下降的差异不明显，而 18F-FLT 下降的差异具有统计学意义。免疫组化染色结果进一步证实，经过吉西他滨联合顺铂治疗后，肿瘤组织中的增殖标志物 Ki67 较治疗前有明显下降，说明 18F-FLT 用于评估肿瘤早期反应的效果优于 18F-FDG ，这与其他研究结果一致[14-16]。
本研究另一个发现是，治疗前 NSCLC 肿瘤对 18F-FDG 的摄取大约为 18F-FLT 的 7～8 倍，这一结果也与其他研究报道的 18F-FDG 在探测 NSCLC 方面的敏感性优于 18F-FLT 是一致的[17]。有研究者猜测，这可能是因为在 NSCLC 肿瘤中葡萄糖代谢活跃的细胞比增殖的细胞数目多[18]。除此之外，本文的局限性主要有以下三点：首先，我们没有评估肿瘤对显像剂摄取的早期改变与荷瘤动物的肿瘤长期抑制是否有关。其次，本研究只观察了 NSCLC 肿瘤在化疗后第 3 天对 18F-FLT 和 18F-FDG 两种不同显像剂的摄取，尚不能判断 18F-FDG 能在化疗后多长时间准确评估吉西他滨联合顺铂的疗效，在今后的研究中，还需要延长治疗后天数进行再次显像，进一步证实 18F-FDG 判断疗效的适当时机。第三点，本研究是临床前期的基础研究，还需要进一步转化为临床应用。
综上所述，18F-FDG 与 18F-FLT PET 均可用于吉西他滨联合顺铂治疗 NSCLC 的疗效评价，但作为与肿瘤增殖相关的显像剂，18F-FLT 对化疗早期疗效评估的准确性高于 18F-FDG。18F-FLT 可以及时反映机体内肿瘤细胞增殖的变化水平，不容易受化疗后肿瘤局部炎症反应的影响，在今后的临床应用中可以指导临床医生及时调整治疗方案。
引言
肺癌的病死率位居全世界恶性肿瘤之首[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占原发性肺癌的 80% 以上，大部分患者确诊时已属无法手术切除的局部晚期或者已出现远处转移；即使诊断为早期肺癌，也有 50% 以上的患者会出现术后转移；因此大部分的 NSCLC 患者需要接受化疗。吉西他滨联合顺铂已经成为治疗 NSCLC 患者的一线化疗方案[2]。然而在临床应用中，吉西他滨加顺铂联合化疗也只对一部分患者有治疗效果。此外，肿瘤的生物学行为差异极大，同种类型肿瘤的不同个体，甚至同一个体的不同阶段，对同样的化疗药物敏感性也有所不同。因此，早期评价疗效可以帮助临床医生制定个体化治疗方案，避免不必要的药物毒性及经济上的浪费。
肿瘤疗效评估普遍采用以肿瘤形态学变化为基础的实体瘤疗效评估标准（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST），然而肿瘤对治疗的反应包含了一系列生物学变化过程，形态上的变化明显滞后于功能代谢的变化。正电子发射断层显像（positron emission tomography，PET）作为一种无创性功能成像模式，已被用于肿瘤疗效评价，尤其是治疗后的早期评价。目前临床应用最广泛的 PET 显像剂是 18 氟-氟代脱氧葡萄糖（18F-fluorode-oxyglucose，18F-FDG），18F-FDG 主要反映葡萄糖代谢水平，其缺点在于非肿瘤特异性，在炎症组织中也会有 18F-FDG 的高摄取[3]。作为胸腺嘧啶类似物，18 氟-氟代胸腺嘧啶（18F-fluorothymidine，18F-FLT）的 PET 显像可以反映活体内细胞增殖情况。在一些临床前期研究中，18F-FLT PET 就被用于监测治疗后的肿瘤细胞增殖变化。然而这些研究的结论不尽相同，部分研究结果显示 18F-FLT PET 能够早期监测肿瘤治疗后的细胞增殖情况；另一些研究显示尽管肿瘤对治疗有良好反应，但肿瘤对 18F-FLT 的摄取却没有明显变化[4-8]。在本文中，我们模拟临床化疗方案对 NSCLC 动物模型进行吉西他滨联合顺铂治疗，比较 18F-FDG 和 18F-FLT 两种 PET 显像剂在早期监测化疗疗效方面的价值；以期在临床实践中，应用 PET 显像早期监测吉西他滨联合顺铂治疗 NSCLC 患者的疗效。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
回旋加速器（MINI trace，美国 GE 公司）；多功能合成仪（TRACERlab FX-Fn，美国 GE 公司）；小动物 PET 仪（Inveon，德国 Siemens 公司）；洛斯维帕克纪念所 1640（Roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶（美国 Gibco 公司）；兔抗鼠 Ki67 多克隆抗体（英国 Abcam 公司）；顺铂（山东齐鲁制药厂）；吉西他滨（誉捷，哈尔滨誉衡药业有限公司）；叔丁氧羰基（t-Butyloxy carbonyl，BOC）前体、碳酸钾、乙腈、乙醇、乙酸钠、氨基聚醚 2.2.2（Kryptofix 2.2.2）均购自常熟华益化工有限公司。
1.2 细胞与动物模型
鼠肺腺癌细胞株 Lewis 细胞购自南京凯基生物科技发展有限公司，采用 RPMI 1640 细胞培养基（含 10% 胎牛血清、50 μg/mL 青霉素、50 μg/mL 链霉素）置于 37℃、5% CO2 孵箱中培养。C57BL/6 小鼠（雌性，4～6 周龄，体重 18～22 g）购于扬州大学比较医学中心，按无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级标准饲养于上海市第一人民医院实验动物中心层流架内，恒温（20～26℃）、恒湿（50%～65%），进食饮水自由。收集对数生长期 Lewis 肺癌细胞，取细胞数 2.5×107 个/mL 接种 0.2 mL 于小鼠右前肢皮下，每天测量并记录肿瘤大小（肿瘤体积=0.52×长×宽2）。当肿瘤体积达到大于 300 mm3 时开始进行实验分组。
1.3 动物分组及处理
将 36 只荷瘤小鼠随机分为实验组和对照组，各组又随机分为 18F-FLT 和 18F-FDG 组，每组 9 只。实验组给予吉西他滨+顺铂联合化疗，腹腔注射吉西他滨，按 50 mg/kg 给药，体积约 0.5～0.7 mL；注射吉西他滨 4 h 后腹腔注射顺铂，按 6 mg/kg 给药，体积约 0.5～0.7 mL。对照组小鼠腹腔注射同等体积的生理盐水。在治疗前和治疗后第 3 天，分别对实验组和对照组进行 18F-FDG 以及 18F-FLT 小动物 PET 显像；每次显像结束后分别取实验组和对照组中 3 只小鼠处死，取肿瘤组织进行病理分析。对剩余的荷瘤小鼠，继续每天测量并记录肿瘤大小，一直观测到治疗后第7天，根据肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线。
1.4 18F-FDG 及 18F-FLT 小动物 PET 显像及图像处理
显像剂来源：18F-FLT 由本院正电子药物中心利用前体物质 3-N-t-叔丁氧羰基-1-[5’-O-（4，4’-二甲氧基三苯甲基）-2’-脱氧-3’-O-（4-硝基苯磺酰基-β-1）-苏戊呋喃糖]胸腺嘧啶脱氧核苷（N-BOC-FLT）合成，合成方法参照文献[9]。产率约 15%，放化纯度>90%。18F-FDG 来自日常临床所用，购于上海原子高科有限公司。
小动物 PET 显像：① 18F-FDG 显像：荷瘤小鼠需空腹 6 h 上，经尾静脉注射 18F-FDG 100～200 μCi；注射显像剂 40～50 min 后，以 2% 异氟烷气体吸入麻醉，固定在 PET 扫描架上，进行 PET 扫描 20 min。② 18F-FLT 显像：荷瘤小鼠无需空腹，尾静脉注射 18F-FLT 100～200 μCi，注射显像剂 50～60 min 后，以 2% 异氟烷气体吸入麻醉，固定在 PET 扫描架上，进行 PET 扫描 20 min。所有显像结果均使用图像采集软件（Inveon Acquisition Workplace，德国 Siemens 公司）和图像分析软件（ASIPro VM，德国 Siemens 公司）进行图像处理。通过沿肿瘤边缘勾画感兴趣区（regions of inte-rest，ROIs）后由计算机自动计算肿瘤的最大标准化摄取值（maximal standardized uptake value，SUVmax）。
1.5 病理学检查
取肿瘤组织后进行固定、包埋及石蜡切片，并进行苏木精-伊红（Hematoxylin and eosin，HE）染色和抗原 Ki67 染色，于光学显微镜下观察各组切片的 HE 染色结果及抗原 Ki67 免疫组化染色结果并摄像。Ki67 阳性染色表现为细胞核染成棕褐色或棕黄色，高倍镜下观察 5 个视野（左上、右上、左下、右下及中间），采用定量法计算 Ki67 阳染细胞占总肿瘤细胞数的百分比。
1.6 统计学分析
结果以均数±标准差表示，采用绘制医学图表软件 GraphPad Prism 5 行统计分析，实验组与对照组荷瘤小鼠的肿瘤体积采用独立样本 t 检验。不同时间 18F-FDG 和 18F-FLT 摄取及两组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 吉西他滨加顺铂联合化疗对肿瘤生长的抑制
如图 1 所示，治疗前实验组和对照组小鼠的肿瘤体积差异无统计学意义，在治疗后的 7 天中，对照组的肿瘤体积随时间延长呈持续上升，而实验组的肿瘤体积没有明显增长。从治疗后第 4 天开始，实验组和对照组的肿瘤体积出现了差异，差异具有统计学意义（P<0.05），对照组的肿瘤体积从治疗前的（365.67±35.83）mm3 上升至治疗后第7天的（1 677.3±181.01）mm3，而实验组肿瘤体积从治疗前的（368.50±26.99）mm3上升至治疗后第 7 天的（408.17±26.58）mm3。
图1
实验组与对照组的肿瘤生长曲线 * P<0.05，实验组 vs. 对照组
Figure1.
Tumor growth curve of treated group and control group * P<0.05, treated group vs. control group
2.2 18F-FDG 和 18F-FLT 显像结果
如图 2、图 3 所示，治疗前实验组和对照组小鼠的肿瘤部位均可见 18F-FDG 和 18F-FLT 摄取，肿瘤部位以虚线圈出。治疗前，实验组肿瘤的 18F-FDG SUVmax 为 4.35±0.46，对照组小鼠肿瘤的 18F-FDG SUVmax 为 4.43±0.21，结果显示差异不具有统计学意义（P>0.05）。治疗前，实验组肿瘤的 18F-FLT SUV-max 为 0.59±0.05，对照组小鼠肿瘤的 18F-FLT SUV-max 为 0.51±0.06，结果显示差异不具有统计学意义（P>0.05）。无论是实验组还是对照组，治疗前肿瘤的 18F-FDG SUVmax 大约是 18F-FLT SUVmax 的 7～8 倍。
图2
实验组和对照组的 18F-FDG PET 显像 *为治疗后第 3 天，实验组与对照组比较，P<0.001
Figure2.
18F-FDG PET imaging of treated group and control group *, P<0.001, treated group vs. control group on day 3
图3
实验组和对照组的 18F-FLT PET 显像 #P<0.05，治疗后第 3 天，实验组与治疗前比较；*P<0.001，治疗后第 3 天，实验组与对照组比较
Figure3.
18F-FLT PET imaging of treated group and control group #P<0.05, treated group vs. baseline on day 3; *P<0.001, treated group vs. control group on day 3
在吉西他滨联合顺铂治疗后第 3 天，实验组小鼠肿瘤的 18F-FDG 摄取明显低于对照组，结果显示差异具有统计学意义（P<0.001）。而与治疗前 PET 结果相比，实验组小鼠肿瘤对 18F-FDG 的摄取差异不具有统计学意义（P>0.05）。另一方面，治疗后第 3 天，实验组小鼠肿瘤对 18F-FLT 的摄取明显低于对照组，结果显示差异具有统计学意义（P<0.001）；而且与治疗前相比，实验组肿瘤对 18F-FLT 的摄取明显低于治疗前的基线水平，结果显示差异具有统计学意义（P<0.05）。
2.3 病理检查结果
抗原 Ki67 免疫组化染色结果显示，经过吉西他滨联合顺铂治疗后第 3 天，肿瘤组织中的 Ki67 染色就出现了明显下降，Ki67 阳性细胞百分比明显低于治疗前的基线水平，结果显示差异具有统计学意义（P<0.05）。而HE染色结果显示，经过吉西他滨联合顺铂治疗后，肿瘤组织中出现了大量的炎性细胞和坏死细胞，结果如图 4 所示。
图4
肿瘤组织的病理学结果（×20） *P<0.05，治疗后第 3 天实验组与对照组比较
Figure4.
Histopathologic results of tumor xenografts（×20） *P<0.05, treated group vs. control group on day 3
3 讨论
对肿瘤进行早期准确的疗效监测可以使患者避免接受不必要的治疗，因此具有重要的临床意义。PET 显像能够无创、动态地显示机体内生理代谢状况，并且早于实体肿瘤体积的变化，更适合早期评价肿瘤的治疗效果。PET 显像示踪剂种类繁多，可以反映肿瘤的葡萄糖代谢、氨基酸和蛋白质合成、核苷代谢、氧代谢、乙酸盐代谢及胆碱代谢等不同生理变化。近年来，已有众多国内外研究者应用 18F-FDG 和 18F-FLT 这两种 PET 显像剂对不同种类的肿瘤进行诊断和疗效评估[10-11]。
18F-FDG 是主要反映肿瘤细胞葡萄糖代谢水平的 PET 显像剂，被广泛应用于肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、食管癌等多种肿瘤的诊断及鉴别诊断、分期及临床预后评估，但一些炎性病变也可以不同程度摄取 18F-FDG，容易造成假阳性结果。在化疗早期，肿瘤部位会出现炎性细胞，大量摄取 18F-FDG，从而严重影响 18F-FDG 对化疗早期效果的真实评价。
作为一种胸腺嘧啶的类似物，18F-FLT 能够和胸腺嘧啶一样进入细胞并掺入 DNA。18F-FLT 在细胞质内的胸腺嘧啶核苷激酶 1（thymidine kinase 1，TK1）作用下发生磷酸化，生成 18F-FLT-磷酸盐。由于 3’-端氟原子的交换，18F-FLT-磷酸盐不能进一步参与 DNA 的合成，也不能通过细胞膜返回组织液而滞留在细胞内，从而可以进行 PET 显像。TK1 是细胞 DNA 补救合成过程中的关键酶，存在于增殖细胞的 S 期和 G1 期，在静止期细胞中无酶活性。肿瘤细胞在增殖过程中，DNA 合成增加从而对核苷类底物的利用增加，使得在肿瘤增殖细胞 G1 期后期和 S 期 TK1 的活性达到最大。18F-FLT 通过反映 TK1 活性而反映细胞的增殖状况，提高了对肿瘤细胞早期化疗评估的准确度[12-13]。抗原 Ki67 是一种与细胞增殖密切相关的蛋白，其表达从细胞周期 G1 后期开始出现，至 M 期达到高峰，在有丝分裂结束后迅速降解，而 G0 和 G1 期细胞不表达，因此 Ki67 相对于其他增殖指标如增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），更能全面反映增殖细胞的数量。
在本研究中，我们应用 18F-FDG 和 18F-FLT 两种不同的 PET 显像剂，在动物体内实时、无创地监测了经过吉西他滨加顺铂联合治疗后，NSCLC 的早期葡萄糖代谢及细胞增殖的变化情况。结果显示，吉西他滨联合顺铂化疗能够明显抑制 Lewis 肿瘤的生长。在治疗后第 3 天，肿瘤对 18F-FLT 和 18F-FDG 的摄取较治疗前的基线水平均有不同程度的下降，相比之下，18F-FDG 下降的差异不明显，而 18F-FLT 下降的差异具有统计学意义。免疫组化染色结果进一步证实，经过吉西他滨联合顺铂治疗后，肿瘤组织中的增殖标志物 Ki67 较治疗前有明显下降，说明 18F-FLT 用于评估肿瘤早期反应的效果优于 18F-FDG ，这与其他研究结果一致[14-16]。
本研究另一个发现是，治疗前 NSCLC 肿瘤对 18F-FDG 的摄取大约为 18F-FLT 的 7～8 倍，这一结果也与其他研究报道的 18F-FDG 在探测 NSCLC 方面的敏感性优于 18F-FLT 是一致的[17]。有研究者猜测，这可能是因为在 NSCLC 肿瘤中葡萄糖代谢活跃的细胞比增殖的细胞数目多[18]。除此之外，本文的局限性主要有以下三点：首先，我们没有评估肿瘤对显像剂摄取的早期改变与荷瘤动物的肿瘤长期抑制是否有关。其次，本研究只观察了 NSCLC 肿瘤在化疗后第 3 天对 18F-FLT 和 18F-FDG 两种不同显像剂的摄取，尚不能判断 18F-FDG 能在化疗后多长时间准确评估吉西他滨联合顺铂的疗效，在今后的研究中，还需要延长治疗后天数进行再次显像，进一步证实 18F-FDG 判断疗效的适当时机。第三点，本研究是临床前期的基础研究，还需要进一步转化为临床应用。
综上所述，18F-FDG 与 18F-FLT PET 均可用于吉西他滨联合顺铂治疗 NSCLC 的疗效评价，但作为与肿瘤增殖相关的显像剂，18F-FLT 对化疗早期疗效评估的准确性高于 18F-FDG。18F-FLT 可以及时反映机体内肿瘤细胞增殖的变化水平，不容易受化疗后肿瘤局部炎症反应的影响，在今后的临床应用中可以指导临床医生及时调整治疗方案。
