腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）与肝癌等肿瘤发生、发展有关。然而这方面的研究大都是基于体外细胞实验或小鼠移植瘤模型开展的。本文介绍一个运用白蛋白启动子驱动 Cre（Alb-Cre）转基因，通过基因重组技术成功构建基因型为 AMPKα1-/--Alb-Cre 的转基因小鼠模型，肝脏特异表达的 Cre 重组酶在转基因小鼠中实现对肝脏 AMPKα1 特异性高效敲除。肝脏 AMPKα1 敲除后不影响小鼠的生长、繁殖及肝脏的结构。肝脏特异敲除 AMPKα1 小鼠模型的成功构建，为实现在动物整体水平对 AMPK 与肝脏代谢或肝癌的发生、发展的关系等方面的研究提供了基础。
引用本文： 唐兴鸿, 孔庆斌, 蒋扬富, 敬静. 肝脏特异敲除腺苷酸活化蛋白激酶小鼠模型的建立. 生物医学工程学杂志, 2017, 34(3): 415-420. doi: 10.7507/1001-5515.201703025 复制
引言
肝癌是我国的常见恶性肿瘤，其发病机制、防治策略均是重要的研究方向[1]。“能量感受器”腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）由催化亚基 α 和调节亚基 β、γ 组成。根据编码基因的不同，α 亚基有 α1、α2 两种，β 亚基可分为 β1 和 β2，而 γ 亚基存在 γ1、γ2、γ3 三种形式[2]。AMPK 是维持细胞内能量稳态的一个重要分子开关，当胞内能量消耗大于能量供给，AMP/ATP 比值上升，AMPK 则被激活，活化的 AMPK 直接或间接作用于下游的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）、乙酰辅酶 A 羧化酶 1/2（acetyl-CoA carboxylase，ACC1/2）等，关闭耗能的合成代谢信号通路，与此同时 AMPK 还能够激活过氧化物酶体增殖物活化受体 γ 协同刺激因子 1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC1α）、6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3（phosphofructokinase-2/fructose-2，6-bispho-sphatase 3，PFKFB3）等，从而促进产能的分解代谢信号通路，通过参与上述能量调控过程，AMPK 可以精确调控细胞的生长、凋亡等[3]。
肝脏是体内重要的代谢器官，糖、脂代谢紊乱与肿瘤的发生发展有关[4]。研究报道，肿瘤细胞中脂肪酸合成增加，活化的 AMPK 可以抑制与脂代谢相关的一系列酶的活性，如脂肪酸合成酶、乙酰辅酶 A 羧化酶、羟甲基戊二酸单酰辅酶 A 等，从而抑制肿瘤的发生及生长[5]。糖酵解是肿瘤细胞主要的产能方式，肿瘤抑制基因P53通过上调 P53 诱导的糖酵解和凋亡调节子（P53 induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR），引起 2、6-二磷酸果糖水平的降低，抑制糖酵解[6]。AMPK 可通过调控 P53 减少糖分解中间体的利用，减少肿瘤细胞的能量来源，进而抑制肿瘤细胞的生长[7]。尽管 AMPK 曾被认为是肿瘤抑制因子，但也有研究提示其也具有促肿瘤作用，也就是说 AMPK 可能在不同类型或遗传背景肿瘤、肿瘤发展不同阶段以及不同的肿瘤微环境中发挥不同甚至相反的作用[8]。
目前有关 AMPK 与肿瘤发生、发展之间关系的研究大都是基于体外细胞实验或小鼠移植瘤模型开展的，这对于说明 AMPK 在肿瘤发生发展中的作用有一定意义，但也有局限性。因此，很有必要结合 AMPK 敲除动物模型研究 AMPK 在肿瘤发生、发展中的作用。基于 Cre-LoxP 重组酶系统的基因敲除技术是建立条件性基因敲除动物模型的经典技术，其原理是 Cre 重组酶与限制性内切酶相似，具有位点特异性，能识别特异的 DNA 序列即 loxP 位点，使 loxP 位点间的基因序列被删除或重组，达到基因敲除的目的[9]。如果将 Cre 重组酶表达限定在特定器官中，则能实现器官特异性基因敲除。通过将 Cre 片段插入在肝脏特异性表达的白蛋白（albumin, Alb）启动子之后，可实现肝脏特异性表达 Cre 重组酶。Cre-LoxP 重组酶系统因其高效的剪切效率在构建转基因动物模型方面得到广泛应用。本文报道一个应用 Cre-LoxP 重组酶系统建立的肝脏特异敲除 AMPKα1 小鼠模型。本研究所用 AMP-Kα1fl/fl 小鼠是野生型 C57BL/6 品系小鼠经基因工程改造而得到，AMPKα1fl/fl 小鼠基因组中 AMPKα1 基因 3 号外显子两侧具有 LoxP 位点，该位点可被 Cre 重组酶识别，将 Cre 重组酶表达限制在肝脏表达就能够对 LoxP 位点间的 3 号外显子进行剪切，从而实现对 AMPKα1 的肝脏特异性敲除。
1 材料与方法
1.1 实验动物
AMPKα1fl/fl 和 Alb-Cre 单基因型小鼠均为 C57BL/6 品系。AMPKα1fl/fl 小鼠购自 Jackson Laboratory（Prkaa1tm1.1Sjm/J，Stock No：014141），白蛋白启动子驱动 Cre 转基因（Alb-Cre）小鼠由四川大学生物治疗国家重点实验室神经分子生物学研究室肖波教授馈赠。
1.2 小鼠饲养与繁殖
按照 SPF 级动物饲养标准在四川大学华西科技园实验动物中心进行饲养。室内温度 21～25℃，相对湿度 50%～60%，每日光照 12 h，小鼠饲料、饮水、垫料均经高温高压灭菌处理。肝脏特异性 AMPKα1 基因敲除可通过 AMPKα1 基因被 Alb-Cre 重组酶在 AMPKα1 的 3 号外显子上剪切而实现。取 8 周龄的 AMPKα1fl/fl 雌鼠与 Alb-Cre 雄鼠交配。经多次交配和筛选，获得 AMPKα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 基因型的小鼠。之后将 AMPKα1fl/fl 型和 AMPKα1-/--Alb-Cre 型互相交配将得到稳定的 AMP-Kα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 两种基因型小鼠。
1.3 主要试剂
Taq PCR 预混液、琼脂糖购自成都擎科梓熙生物技术有限公司（Cat TSE004、Cat 16031105），AMPKα1 抗体、磷酸化 ACC 抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公司（Cat 2795S，Cat 3661S），β-Actin 抗体、磷酸化 S6 抗体购自成都正能生物技术有限责任公司（Cat 200068-8F10，Cat 310090），ECL 发光液购自碧云天生物技术公司（Cat P0018）。
1.4 肝脏特异敲除AMPK小鼠模型的建立
1.4.1 小鼠基因型鉴定 小鼠出生后 3 周断奶，耳号标记并分笼。无菌剪刀取小鼠尾约 0.5 cm，加入 75 μL Buffer A （25 mmol/L NaOH 和 0.2 mmol/L EDTA）置于 PCR 仪中 98℃ 加热 1 h 后冷却至室温，然后加入 75 μL Buffer B（40 mmol/L Tris-HCl pH 5.5），混匀并离心（4 000 r/min，3 min），吸取 2 μL 上清用于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）鉴定。
用于 PCR 的 AMPKα1/AMPKα1-LoxP 与 Cre 引物序列见表 1。以下反应物构成 20 μL 反应体系：Taq PCR 预混液 10 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，模板 NDA 1 μL，ddH2O 7 μL，共 20 μL。PCR 反应条件如下：94℃ 预变性 3 min，94℃ 变性 20 s，65℃ 退火 25 s，68℃ 延伸 20 s，10 个循环，每个循环降 0.5℃，94℃ 变性 20 s，60℃ 退火 25 s，72℃ 延伸 20 s，28 个循环，72℃ 总延伸 3 min，12℃ 维持。PCR 扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型鉴定。制备 1% 琼脂糖凝胶，取 PCR 反应终产物 10 μL 进行电泳。电泳后使用凝胶成像系统进行电泳图片分析。
表1
小鼠基因型鉴定PCR引物序列
Table1.
Genotyping primer sequences of mice
1.4.2 小鼠肝脏病理学检查 随机选取 8 周龄的 AMPKα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 小鼠各三只，称重后颈椎脱臼处死，迅速完整取出肝脏，称重，同时观察肝脏大小、色泽、质地。取适量肝脏组织石蜡包埋，伊红-苏木素（hematoxylin-eosin, HE）染色。HE 染色步骤如下：二甲苯脱蜡 2 次，10 min/次，梯度酒精脱水，10 min/梯度，PBS 缓冲液清洗 3 次，5 min/次，显微镜下伊红、苏木素染色，细胞质和细胞核着色后立即终止反应，自来水冲洗反蓝 5 min，1% 盐酸酒精分化 10 s，PBS 缓冲液清洗 3 次，5 min/次，梯度酒精脱水，5 min/梯度，二甲苯透明 2 次，10 min/次，中性树脂封片，镜检。
1.4.3 蛋白印迹检测 AMPKα1 蛋白的表达 取适量小鼠肝组织，按 250 mg 组织加入蛋白质抽提试剂 1 mL 提取组织蛋白，以 BCA 分析试剂测定蛋白质浓度。总蛋白质（30 μg）经 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶 90 V 电泳分离后，电转移至聚偏氟乙烯膜，260 mA 恒流湿转 95 min，将膜置于 5%（50 g/L）脱脂牛奶中室温孵育 1 h，封闭膜上的非特异结合。一抗（1∶1 500）4℃ 孵育过夜。Tris 缓冲液洗膜 3 次，5 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000），室温孵育 1 h，再以 Tris 缓冲液洗膜 3 次，5 min/次，采用同样方法标记 β-Actin 作为对照。ECL 发光液显影，采集图像。
1.5 统计学方法
所有数据采用 Graphpad Prism 5.0 软件进行统计学分析，数据以均值±标准差表示，两组间均值的统计比较用非配对 t 检验，以 P≤0.05 为差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1 肝脏特异性 AMPKα1 敲除小鼠的获得与基因型鉴定
2.1.1 AMPKα1-/--Alb-Cre 基因型小鼠的获得 我们首先采用 F0 代 AMPKα1fl/fl 雌鼠 2 只与 Alb-Cre 雄鼠 1 只交配后得到基因型为 AMPKα1fl/+Alb-Cre 的 F1 代小鼠 15 只。选取 F1 代基因型为 AMPKα1fl/+-Alb-Cre 的雌鼠 2 只与 AMPKα1fl/fl 雄鼠 1 只回交，得到基因型为 AMPKα1-/--Alb-Cre、AMPKα1fl/+-Alb-Cre、AMPKα1fl/fl、AMPKα1fl/+ 的 F2 代小鼠 32 只。在 F2 代小鼠中选择基因型为 AMPKα1-/--Alb-Cre 的雄鼠 1 只与 AMPKα1fl/fl 雌鼠 2 只自交，得到 F3 代基因型为 AMPKα1-/--Alb-Cre、AMPKα1fl/fl 小鼠 25 只，按此循环交配可得到稳定的基因型为 AMPKα1-/--Alb-Cre 的肝脏特异性 AMPKα1 敲除小鼠（见图 1）。
图1
肝脏特异性敲除 AMPKα1 小鼠建立流程图
Figure1.
Procedure of generating liver-specific AMPKα1 knockout mice
2.1.2 AMPKα1-/--Alb-Cre 基因型小鼠的基因型鉴定 我们通过 PCR 扩增法对小鼠进行基因型鉴定。AMPKα1fl/fl 小鼠基因组序列中 AMPKα1 的 3 号外显子区被插入了一段 LoxP 序列，因此，通过同时针对 AMPKα1 和 LoxP 区域基因组 DNA 进行特异性扩增，纯合 AMPKα1fl/fl 小鼠得到 450 bp 的条带，而 AMPKα1fl/+ 杂合小鼠则同时具有 334 bp 和 450 bp 两条带（334 bp 为 AMPKα1 野生型小鼠表现，结果未列出）；根据上述 PCR 产物大小即可将 AMPKα1fl/fl 型和 AMPKα1fl/+ 型小鼠区分开来。同时，利用针对 Cre 重组酶的特异性引物亦能够区分是否表达 Alb-Cre 重组酶。如图 2 所示，25、20 号小鼠在 450 bp 处呈单一条带，为 AMPKα1fl/fl 纯合型小鼠的表现；同时，20 号小鼠在 300 bp（Cre）处有条带，表明有 Alb-Cre 重组酶表达，故该小鼠基因型为 AMPKα1-/--Alb-Cre，而 25 号小鼠在 300 bp 处无 Cre 条带，说明该小鼠无 Alb-Cre 重组酶表达，则基因型为 AMPKα1fl/fl。19、12、18、17 号小鼠在 334 bp 和 450 bp 处呈双条带，为 AMPKα1fl/+ 杂合型小鼠的表现；同时，19、17 号小鼠在 300 bp 处有 Cre 条带，故它们的基因型为 AMPKα1fl/+-Alb-Cre，而 12、18 号小鼠无 Cre 条带，故其基因型为 AMPKα1fl/+。
图2
琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型
Figure2.
Genotyping and identification of liver-specific AMPKα1 knockout mice by PCR assay
2.2 蛋白印迹验证 AMPKα1 在 AMPKα1-/--Alb-Cre 型小鼠肝脏中不表达
为进一步验证在 AMPKα1-/--Alb-Cre 型小鼠中 AMPKα1 确实已被敲除，我们采用蛋白印迹法检测 AMPKα1fl/fl 组和 AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏中 AMPKα1 蛋白的表达情况。结果显示，AMPKα1fl/fl 组小鼠肝组织中存在 AMPKα1 表达，而 AMPKα1-/--Alb-Cre 组肝脏组织中不表达 AMPKα1，进一步验证了 AMPKα1 在 AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏中被高效敲除（见图 3）。此外，我们也检测了 AMPK 的靶标 ACC 的磷酸化水平以及 mTOR 下游的 S6 磷酸化水平，结果显示，AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏中 ACC 及 S6 磷酸化水平均低于 AMPKα1fl/fl 组（见图 4）。
图3
AMPKα1 在 AMPKα1fl/fl 组与 AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏中的表达 1、3：AMPKα1fl/fl 组小鼠肝脏蛋白；2、4：AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏蛋白
Figure3.
Immunoblotting analysis of AMPKα1 expression of liver lysates from AMPKα1fl/fl or AMPKα1-/--Alb-Cre mice Lane 1 and 3: the liver lysates from AMPKα1fl/fl mice; Lane 2 and 4: the liver lysates from AMPKα1-/--Alb-Cre mice
图4
AMPKα1fl/fl 组与 AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏中 ACC、S6 的磷酸化水平
Figure4.
Immunoblotting analysis of the phosphorylation of ACC and S6 in AMPKα1fl/fl or AMPKα1-/--Alb-Cre mice liver
2.3 肝脏特异敲除 AMPKα1 对小鼠繁殖、生长及肝脏组织形态等的影响
AMPKα1 在小鼠肝脏被特异性敲除以后，不影响小鼠的正常生长、繁殖。AMPKα1fl/fl 组小鼠体重为（27.73±1.45）g，AMPKα1-/--Alb-Cre 组为（29.00±1.73）g，两组间差异无统计学意义（P>0.05）。AMPKα1 敲除后不影响肝脏的生长及结构，AMPKα1fl/fl 组小鼠肝重占体重百分比为 3.72%±0.002 6%，AMPKα1-/--Alb-Cre 组为 4.22%±0.002 9%，二者间差异无统计学意义（P>0.05）。两组小鼠肝脏表面光滑，呈红褐色，质地柔软，未见肉眼可见改变。两组肝脏切片 HE 染色显示，肝小叶结构完整、正常，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞索与肝血窦排列规则，未见肝细胞变性、坏死等征像（见图 5）。
图5
AMPKα1fl/fl 组与 AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏大体观及 HE 染色光学显微镜下表现
Figure5.
Gross and HE staining views of mice liver with gene-type of AMPKα1fl/fl and AMPKα1-/--Alb-Cre
3 讨论
能量代谢异常是肿瘤细胞的重要特征之一。作为调控细胞能量稳态的重要分子开关，AMPK 与肿瘤的关系受到广泛关注，常被认为是肿瘤抑制因子。但是，AMPK 在肿瘤发生、发展过程中的具体功能尚无定论。有研究表明 AMPK 通过磷酸化结节硬化复合物 2（tuberous sclerosis complex 2，TSC2）抑制 mTORC1 依赖的蛋白合成，以及磷酸化 ACC 抑制脂质合成，从而抑制肿瘤细胞的增殖[10-12]。动物实验发现小鼠 B 淋巴细胞中特异敲除 AMPKα1 亚基能够加速 Myc 基因诱导的淋巴瘤形成[13]，但另一项研究却发现 c-Myc 驱动的肿瘤细胞的生存依赖于 AMPK 活化[14]。最近两篇关于 AMPK 调节 Hippo 通路中的关键因子 YAP（Yes-associated protein）的报道揭示了应激环境影响肿瘤细胞增殖的新机制[15-17]。这表明当肿瘤细胞处于应激状态时，作为能量感应的分子开关 AMPK 接受环境信号并发出关闭耗能的代谢通路的指令，肿瘤细胞此时将进入一个生长停滞的休眠期，当外界生长环境改善后细胞又将重新恢复增殖。从这个角度看，肿瘤微环境动力学对肿瘤发展影响很大，AMPK 活化亦是一种保护肿瘤细胞存活于逆境的适应机制。
AMPK 作为细胞代谢调控的一个关键分子，在肿瘤发生、发展中的作用较为复杂。尽管 AMPK 具有一些抑癌作用，但一些研究一致发现 AMPK 可以促进应激状态下的癌细胞存活[8, 18-21]。AMPK 的 β1 亚基表达水平降低能够导致前列腺癌细胞存活能力下降[22]。在雄激素依赖的前列腺癌细胞中，AMPK 通过诱导自噬以增加细胞在应激情况下的存活率[23]，此外，AMPK 还能通过调节还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的水平促进脱离了细胞外基质的癌细胞以及糖剥夺的癌细胞的存活能力[24]。在 BRAF 基因突变的黑色素瘤细胞中，AMPK 介导了癌细胞对 BRAF 抑制剂的耐药性[25]。AMPK 活化还可削弱血管内皮生长因子抗体的抗癌作用[26]。
事实上，虽然很多基因都被划分为癌基因或抑癌基因，但在癌症研究中发现不少“双面蛋白”，一个典型的例子就是转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）。虽然较多研究涉及到 AMPK，但不少是基于直接或间接作用于 AMPK 的小分子或药物，鉴于这些小分子药物可能具有 AMPK 之外的靶标，因此其作用是否能归因于 AMPK 尚存疑问[27-28]。本实验中，我们采用 Cre-LoxP 重组酶系统实现了 AMPKα1 在小鼠肝脏的特异性敲除。Cre 片段插入在肝脏特异性表达的白蛋白启动子之后，从而实现肝脏特异性表达 Cre 重组酶及对 AMPKα1 的特异性敲除。我们采用 PCR 扩增法对 AMPKα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 两种基因型小鼠进行了鉴定，并采用蛋白印迹法证实了小鼠肝脏 AMPKα1 被敲除。而且，敲除小鼠肝脏 AMPKα1 不影响小鼠的生长、繁殖及肝脏的组织结构。肝脏特异敲除 AMPKα1 小鼠模型的建立为研究 AMPKα1 与肝脏代谢或肝癌发生、发展间的关系等提供了一个理想的动物模型，为实现在动物水平对 AMPK 功能的研究打下了基础。
引言
肝癌是我国的常见恶性肿瘤，其发病机制、防治策略均是重要的研究方向[1]。“能量感受器”腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）由催化亚基 α 和调节亚基 β、γ 组成。根据编码基因的不同，α 亚基有 α1、α2 两种，β 亚基可分为 β1 和 β2，而 γ 亚基存在 γ1、γ2、γ3 三种形式[2]。AMPK 是维持细胞内能量稳态的一个重要分子开关，当胞内能量消耗大于能量供给，AMP/ATP 比值上升，AMPK 则被激活，活化的 AMPK 直接或间接作用于下游的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）、乙酰辅酶 A 羧化酶 1/2（acetyl-CoA carboxylase，ACC1/2）等，关闭耗能的合成代谢信号通路，与此同时 AMPK 还能够激活过氧化物酶体增殖物活化受体 γ 协同刺激因子 1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC1α）、6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3（phosphofructokinase-2/fructose-2，6-bispho-sphatase 3，PFKFB3）等，从而促进产能的分解代谢信号通路，通过参与上述能量调控过程，AMPK 可以精确调控细胞的生长、凋亡等[3]。
肝脏是体内重要的代谢器官，糖、脂代谢紊乱与肿瘤的发生发展有关[4]。研究报道，肿瘤细胞中脂肪酸合成增加，活化的 AMPK 可以抑制与脂代谢相关的一系列酶的活性，如脂肪酸合成酶、乙酰辅酶 A 羧化酶、羟甲基戊二酸单酰辅酶 A 等，从而抑制肿瘤的发生及生长[5]。糖酵解是肿瘤细胞主要的产能方式，肿瘤抑制基因P53通过上调 P53 诱导的糖酵解和凋亡调节子（P53 induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR），引起 2、6-二磷酸果糖水平的降低，抑制糖酵解[6]。AMPK 可通过调控 P53 减少糖分解中间体的利用，减少肿瘤细胞的能量来源，进而抑制肿瘤细胞的生长[7]。尽管 AMPK 曾被认为是肿瘤抑制因子，但也有研究提示其也具有促肿瘤作用，也就是说 AMPK 可能在不同类型或遗传背景肿瘤、肿瘤发展不同阶段以及不同的肿瘤微环境中发挥不同甚至相反的作用[8]。
目前有关 AMPK 与肿瘤发生、发展之间关系的研究大都是基于体外细胞实验或小鼠移植瘤模型开展的，这对于说明 AMPK 在肿瘤发生发展中的作用有一定意义，但也有局限性。因此，很有必要结合 AMPK 敲除动物模型研究 AMPK 在肿瘤发生、发展中的作用。基于 Cre-LoxP 重组酶系统的基因敲除技术是建立条件性基因敲除动物模型的经典技术，其原理是 Cre 重组酶与限制性内切酶相似，具有位点特异性，能识别特异的 DNA 序列即 loxP 位点，使 loxP 位点间的基因序列被删除或重组，达到基因敲除的目的[9]。如果将 Cre 重组酶表达限定在特定器官中，则能实现器官特异性基因敲除。通过将 Cre 片段插入在肝脏特异性表达的白蛋白（albumin, Alb）启动子之后，可实现肝脏特异性表达 Cre 重组酶。Cre-LoxP 重组酶系统因其高效的剪切效率在构建转基因动物模型方面得到广泛应用。本文报道一个应用 Cre-LoxP 重组酶系统建立的肝脏特异敲除 AMPKα1 小鼠模型。本研究所用 AMP-Kα1fl/fl 小鼠是野生型 C57BL/6 品系小鼠经基因工程改造而得到，AMPKα1fl/fl 小鼠基因组中 AMPKα1 基因 3 号外显子两侧具有 LoxP 位点，该位点可被 Cre 重组酶识别，将 Cre 重组酶表达限制在肝脏表达就能够对 LoxP 位点间的 3 号外显子进行剪切，从而实现对 AMPKα1 的肝脏特异性敲除。
1 材料与方法
1.1 实验动物
AMPKα1fl/fl 和 Alb-Cre 单基因型小鼠均为 C57BL/6 品系。AMPKα1fl/fl 小鼠购自 Jackson Laboratory（Prkaa1tm1.1Sjm/J，Stock No：014141），白蛋白启动子驱动 Cre 转基因（Alb-Cre）小鼠由四川大学生物治疗国家重点实验室神经分子生物学研究室肖波教授馈赠。
1.2 小鼠饲养与繁殖
按照 SPF 级动物饲养标准在四川大学华西科技园实验动物中心进行饲养。室内温度 21～25℃，相对湿度 50%～60%，每日光照 12 h，小鼠饲料、饮水、垫料均经高温高压灭菌处理。肝脏特异性 AMPKα1 基因敲除可通过 AMPKα1 基因被 Alb-Cre 重组酶在 AMPKα1 的 3 号外显子上剪切而实现。取 8 周龄的 AMPKα1fl/fl 雌鼠与 Alb-Cre 雄鼠交配。经多次交配和筛选，获得 AMPKα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 基因型的小鼠。之后将 AMPKα1fl/fl 型和 AMPKα1-/--Alb-Cre 型互相交配将得到稳定的 AMP-Kα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 两种基因型小鼠。
1.3 主要试剂
Taq PCR 预混液、琼脂糖购自成都擎科梓熙生物技术有限公司（Cat TSE004、Cat 16031105），AMPKα1 抗体、磷酸化 ACC 抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公司（Cat 2795S，Cat 3661S），β-Actin 抗体、磷酸化 S6 抗体购自成都正能生物技术有限责任公司（Cat 200068-8F10，Cat 310090），ECL 发光液购自碧云天生物技术公司（Cat P0018）。
1.4 肝脏特异敲除AMPK小鼠模型的建立
1.4.1 小鼠基因型鉴定 小鼠出生后 3 周断奶，耳号标记并分笼。无菌剪刀取小鼠尾约 0.5 cm，加入 75 μL Buffer A （25 mmol/L NaOH 和 0.2 mmol/L EDTA）置于 PCR 仪中 98℃ 加热 1 h 后冷却至室温，然后加入 75 μL Buffer B（40 mmol/L Tris-HCl pH 5.5），混匀并离心（4 000 r/min，3 min），吸取 2 μL 上清用于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）鉴定。
用于 PCR 的 AMPKα1/AMPKα1-LoxP 与 Cre 引物序列见表 1。以下反应物构成 20 μL 反应体系：Taq PCR 预混液 10 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，模板 NDA 1 μL，ddH2O 7 μL，共 20 μL。PCR 反应条件如下：94℃ 预变性 3 min，94℃ 变性 20 s，65℃ 退火 25 s，68℃ 延伸 20 s，10 个循环，每个循环降 0.5℃，94℃ 变性 20 s，60℃ 退火 25 s，72℃ 延伸 20 s，28 个循环，72℃ 总延伸 3 min，12℃ 维持。PCR 扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型鉴定。制备 1% 琼脂糖凝胶，取 PCR 反应终产物 10 μL 进行电泳。电泳后使用凝胶成像系统进行电泳图片分析。
表1
小鼠基因型鉴定PCR引物序列
Table1.
Genotyping primer sequences of mice
1.4.2 小鼠肝脏病理学检查 随机选取 8 周龄的 AMPKα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 小鼠各三只，称重后颈椎脱臼处死，迅速完整取出肝脏，称重，同时观察肝脏大小、色泽、质地。取适量肝脏组织石蜡包埋，伊红-苏木素（hematoxylin-eosin, HE）染色。HE 染色步骤如下：二甲苯脱蜡 2 次，10 min/次，梯度酒精脱水，10 min/梯度，PBS 缓冲液清洗 3 次，5 min/次，显微镜下伊红、苏木素染色，细胞质和细胞核着色后立即终止反应，自来水冲洗反蓝 5 min，1% 盐酸酒精分化 10 s，PBS 缓冲液清洗 3 次，5 min/次，梯度酒精脱水，5 min/梯度，二甲苯透明 2 次，10 min/次，中性树脂封片，镜检。
1.4.3 蛋白印迹检测 AMPKα1 蛋白的表达 取适量小鼠肝组织，按 250 mg 组织加入蛋白质抽提试剂 1 mL 提取组织蛋白，以 BCA 分析试剂测定蛋白质浓度。总蛋白质（30 μg）经 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶 90 V 电泳分离后，电转移至聚偏氟乙烯膜，260 mA 恒流湿转 95 min，将膜置于 5%（50 g/L）脱脂牛奶中室温孵育 1 h，封闭膜上的非特异结合。一抗（1∶1 500）4℃ 孵育过夜。Tris 缓冲液洗膜 3 次，5 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000），室温孵育 1 h，再以 Tris 缓冲液洗膜 3 次，5 min/次，采用同样方法标记 β-Actin 作为对照。ECL 发光液显影，采集图像。
1.5 统计学方法
所有数据采用 Graphpad Prism 5.0 软件进行统计学分析，数据以均值±标准差表示，两组间均值的统计比较用非配对 t 检验，以 P≤0.05 为差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1 肝脏特异性 AMPKα1 敲除小鼠的获得与基因型鉴定
2.1.1 AMPKα1-/--Alb-Cre 基因型小鼠的获得 我们首先采用 F0 代 AMPKα1fl/fl 雌鼠 2 只与 Alb-Cre 雄鼠 1 只交配后得到基因型为 AMPKα1fl/+Alb-Cre 的 F1 代小鼠 15 只。选取 F1 代基因型为 AMPKα1fl/+-Alb-Cre 的雌鼠 2 只与 AMPKα1fl/fl 雄鼠 1 只回交，得到基因型为 AMPKα1-/--Alb-Cre、AMPKα1fl/+-Alb-Cre、AMPKα1fl/fl、AMPKα1fl/+ 的 F2 代小鼠 32 只。在 F2 代小鼠中选择基因型为 AMPKα1-/--Alb-Cre 的雄鼠 1 只与 AMPKα1fl/fl 雌鼠 2 只自交，得到 F3 代基因型为 AMPKα1-/--Alb-Cre、AMPKα1fl/fl 小鼠 25 只，按此循环交配可得到稳定的基因型为 AMPKα1-/--Alb-Cre 的肝脏特异性 AMPKα1 敲除小鼠（见图 1）。
图1
肝脏特异性敲除 AMPKα1 小鼠建立流程图
Figure1.
Procedure of generating liver-specific AMPKα1 knockout mice
2.1.2 AMPKα1-/--Alb-Cre 基因型小鼠的基因型鉴定 我们通过 PCR 扩增法对小鼠进行基因型鉴定。AMPKα1fl/fl 小鼠基因组序列中 AMPKα1 的 3 号外显子区被插入了一段 LoxP 序列，因此，通过同时针对 AMPKα1 和 LoxP 区域基因组 DNA 进行特异性扩增，纯合 AMPKα1fl/fl 小鼠得到 450 bp 的条带，而 AMPKα1fl/+ 杂合小鼠则同时具有 334 bp 和 450 bp 两条带（334 bp 为 AMPKα1 野生型小鼠表现，结果未列出）；根据上述 PCR 产物大小即可将 AMPKα1fl/fl 型和 AMPKα1fl/+ 型小鼠区分开来。同时，利用针对 Cre 重组酶的特异性引物亦能够区分是否表达 Alb-Cre 重组酶。如图 2 所示，25、20 号小鼠在 450 bp 处呈单一条带，为 AMPKα1fl/fl 纯合型小鼠的表现；同时，20 号小鼠在 300 bp（Cre）处有条带，表明有 Alb-Cre 重组酶表达，故该小鼠基因型为 AMPKα1-/--Alb-Cre，而 25 号小鼠在 300 bp 处无 Cre 条带，说明该小鼠无 Alb-Cre 重组酶表达，则基因型为 AMPKα1fl/fl。19、12、18、17 号小鼠在 334 bp 和 450 bp 处呈双条带，为 AMPKα1fl/+ 杂合型小鼠的表现；同时，19、17 号小鼠在 300 bp 处有 Cre 条带，故它们的基因型为 AMPKα1fl/+-Alb-Cre，而 12、18 号小鼠无 Cre 条带，故其基因型为 AMPKα1fl/+。
图2
琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型
Figure2.
Genotyping and identification of liver-specific AMPKα1 knockout mice by PCR assay
2.2 蛋白印迹验证 AMPKα1 在 AMPKα1-/--Alb-Cre 型小鼠肝脏中不表达
为进一步验证在 AMPKα1-/--Alb-Cre 型小鼠中 AMPKα1 确实已被敲除，我们采用蛋白印迹法检测 AMPKα1fl/fl 组和 AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏中 AMPKα1 蛋白的表达情况。结果显示，AMPKα1fl/fl 组小鼠肝组织中存在 AMPKα1 表达，而 AMPKα1-/--Alb-Cre 组肝脏组织中不表达 AMPKα1，进一步验证了 AMPKα1 在 AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏中被高效敲除（见图 3）。此外，我们也检测了 AMPK 的靶标 ACC 的磷酸化水平以及 mTOR 下游的 S6 磷酸化水平，结果显示，AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏中 ACC 及 S6 磷酸化水平均低于 AMPKα1fl/fl 组（见图 4）。
图3
AMPKα1 在 AMPKα1fl/fl 组与 AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏中的表达 1、3：AMPKα1fl/fl 组小鼠肝脏蛋白；2、4：AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏蛋白
Figure3.
Immunoblotting analysis of AMPKα1 expression of liver lysates from AMPKα1fl/fl or AMPKα1-/--Alb-Cre mice Lane 1 and 3: the liver lysates from AMPKα1fl/fl mice; Lane 2 and 4: the liver lysates from AMPKα1-/--Alb-Cre mice
图4
AMPKα1fl/fl 组与 AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏中 ACC、S6 的磷酸化水平
Figure4.
Immunoblotting analysis of the phosphorylation of ACC and S6 in AMPKα1fl/fl or AMPKα1-/--Alb-Cre mice liver
2.3 肝脏特异敲除 AMPKα1 对小鼠繁殖、生长及肝脏组织形态等的影响
AMPKα1 在小鼠肝脏被特异性敲除以后，不影响小鼠的正常生长、繁殖。AMPKα1fl/fl 组小鼠体重为（27.73±1.45）g，AMPKα1-/--Alb-Cre 组为（29.00±1.73）g，两组间差异无统计学意义（P>0.05）。AMPKα1 敲除后不影响肝脏的生长及结构，AMPKα1fl/fl 组小鼠肝重占体重百分比为 3.72%±0.002 6%，AMPKα1-/--Alb-Cre 组为 4.22%±0.002 9%，二者间差异无统计学意义（P>0.05）。两组小鼠肝脏表面光滑，呈红褐色，质地柔软，未见肉眼可见改变。两组肝脏切片 HE 染色显示，肝小叶结构完整、正常，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞索与肝血窦排列规则，未见肝细胞变性、坏死等征像（见图 5）。
图5
AMPKα1fl/fl 组与 AMPKα1-/--Alb-Cre 组小鼠肝脏大体观及 HE 染色光学显微镜下表现
Figure5.
Gross and HE staining views of mice liver with gene-type of AMPKα1fl/fl and AMPKα1-/--Alb-Cre
3 讨论
能量代谢异常是肿瘤细胞的重要特征之一。作为调控细胞能量稳态的重要分子开关，AMPK 与肿瘤的关系受到广泛关注，常被认为是肿瘤抑制因子。但是，AMPK 在肿瘤发生、发展过程中的具体功能尚无定论。有研究表明 AMPK 通过磷酸化结节硬化复合物 2（tuberous sclerosis complex 2，TSC2）抑制 mTORC1 依赖的蛋白合成，以及磷酸化 ACC 抑制脂质合成，从而抑制肿瘤细胞的增殖[10-12]。动物实验发现小鼠 B 淋巴细胞中特异敲除 AMPKα1 亚基能够加速 Myc 基因诱导的淋巴瘤形成[13]，但另一项研究却发现 c-Myc 驱动的肿瘤细胞的生存依赖于 AMPK 活化[14]。最近两篇关于 AMPK 调节 Hippo 通路中的关键因子 YAP（Yes-associated protein）的报道揭示了应激环境影响肿瘤细胞增殖的新机制[15-17]。这表明当肿瘤细胞处于应激状态时，作为能量感应的分子开关 AMPK 接受环境信号并发出关闭耗能的代谢通路的指令，肿瘤细胞此时将进入一个生长停滞的休眠期，当外界生长环境改善后细胞又将重新恢复增殖。从这个角度看，肿瘤微环境动力学对肿瘤发展影响很大，AMPK 活化亦是一种保护肿瘤细胞存活于逆境的适应机制。
AMPK 作为细胞代谢调控的一个关键分子，在肿瘤发生、发展中的作用较为复杂。尽管 AMPK 具有一些抑癌作用，但一些研究一致发现 AMPK 可以促进应激状态下的癌细胞存活[8, 18-21]。AMPK 的 β1 亚基表达水平降低能够导致前列腺癌细胞存活能力下降[22]。在雄激素依赖的前列腺癌细胞中，AMPK 通过诱导自噬以增加细胞在应激情况下的存活率[23]，此外，AMPK 还能通过调节还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的水平促进脱离了细胞外基质的癌细胞以及糖剥夺的癌细胞的存活能力[24]。在 BRAF 基因突变的黑色素瘤细胞中，AMPK 介导了癌细胞对 BRAF 抑制剂的耐药性[25]。AMPK 活化还可削弱血管内皮生长因子抗体的抗癌作用[26]。
事实上，虽然很多基因都被划分为癌基因或抑癌基因，但在癌症研究中发现不少“双面蛋白”，一个典型的例子就是转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）。虽然较多研究涉及到 AMPK，但不少是基于直接或间接作用于 AMPK 的小分子或药物，鉴于这些小分子药物可能具有 AMPK 之外的靶标，因此其作用是否能归因于 AMPK 尚存疑问[27-28]。本实验中，我们采用 Cre-LoxP 重组酶系统实现了 AMPKα1 在小鼠肝脏的特异性敲除。Cre 片段插入在肝脏特异性表达的白蛋白启动子之后，从而实现肝脏特异性表达 Cre 重组酶及对 AMPKα1 的特异性敲除。我们采用 PCR 扩增法对 AMPKα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 两种基因型小鼠进行了鉴定，并采用蛋白印迹法证实了小鼠肝脏 AMPKα1 被敲除。而且，敲除小鼠肝脏 AMPKα1 不影响小鼠的生长、繁殖及肝脏的组织结构。肝脏特异敲除 AMPKα1 小鼠模型的建立为研究 AMPKα1 与肝脏代谢或肝癌发生、发展间的关系等提供了一个理想的动物模型，为实现在动物水平对 AMPK 功能的研究打下了基础。
