本文利用自由基共聚法合成了一种多重响应性交联聚合物载药胶束，对其化学结构、纳米级形貌进行了表征，并测定其载药率。实验结果表明，交联聚合物载药胶束为尺寸约 100 nm 的球形颗粒；其在还原剂谷胱甘肽（GSH）作用下可发生降解并溶胀；交联聚合物载药胶束的低临界溶液温度（LCST）为 39.4℃，当环境温度高于 LCST 时，该胶束结构发生明显收缩。本研究分析了该交联聚合物载药胶束在模拟肿瘤微环境下的载药释放情况，即当该交联聚合物载药胶束处于酸性（pH 5.0）、还原性（GSH 10 mmol/L）和高温（42.0℃）条件下时，受条件刺激可促进其中药物释放，其累积释放率可达 91.78%，而该交联聚合物载药胶束在无刺激条件下累积释放率仅为 1.12%。细胞毒性实验进一步表明，本文合成的交联聚合物载药胶束表现出了较强的细胞摄取能力，具有良好的生物相容性和较好的体外抗肿瘤活性。基于以上研究结果，本实验中制备的交联聚合物载药胶束具有多重响应性释药功能，有望成为一种具备高效可控释药功能的理想载体材料。
引用本文： 屈婧, 陈康隆, 王秋月, 林娟, 周庆翰. 还原、温度和 pH 三重响应性交联聚合物载药胶束的制备及其释药性能研究. 生物医学工程学杂志, 2018, 35(1): 70-80. doi: 10.7507/1001-5515.201708038 复制
引言
近年来，聚合物胶束由于其独特的双亲性结构受到了研究者们广泛的关注[1]。聚合物胶束可包载疏水性药物，在提高疏水性药物的溶解度以及生物利用度的同时，其纳米级的尺度可利用肿瘤组织的高通透性和滞留效应（enhanced permeation retention effect，EPR）增强药物对肿瘤组织血管壁的渗透[2-3]。而经过化学交联的聚合物胶束因具有稳定化学结构，可以防止胶束在体内循环中由于稀释以及化学环境变化等原因导致的分解，同时交联结构内部大量的空腔还可提高胶束载药量，有利于提高其对肿瘤的治疗效果[4-6]。
为了使药物在肿瘤组织达到高效释放的目的，交联聚合物载药胶束应具有对肿瘤细胞内微环境的响应性。研究发现，肿瘤细胞与正常细胞内微环境条件明显不同，如肿瘤细胞中内涵体和溶酶体 pH 为 4～6，正常细胞 pH 为 7.4[7-12]；同时，肿瘤细胞中谷胱甘肽（glutathione，GSH）浓度（2～10 mmol/L）比正常组织细胞（1.2 mmol/L）高数倍，因而肿瘤细胞微环境具有较高的还原响应性[13-15]；另外，肿瘤细胞内较高的糖酵解速率也使其处于高温环境（40～42℃）[16]。因此，构建一种结构稳定，同时能够响应细胞内多重刺激的“智能”药物载体体系是目前交联聚合物载药胶束的研究热点[17]。Lin 等[18]制备了一种以聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯为亲水段，聚 ε-己内酯为疏水段的可降解聚合物胶束，在 10 mmol/L 二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）以及 pH 5.0 条件的双重刺激下，药物实现了高效靶向释放。Gao 等[19]利用聚多肽合成了一种具有还原响应性以及温度敏感性的双响应性聚合物胶束，其临界聚集胶束浓度远小于未交联聚合物胶束的临界聚集胶束浓度，同时包裹阿霉素（doxorubicin，DOX）后能够有效杀伤人宫颈癌细胞系 HeLa 细胞。虽然研究者对刺激响应性交联聚合物胶束进行了广泛的研究，但同时具有还原响应性、温度敏感性以及 pH 敏感性的多重响应性交联聚合物载药胶束却报道较少。
基于以上原因，并参考前述文献所描述的肿瘤细胞内微环境的特征条件，本文利用乙烯基聚谷氨酸苄酯［poly（γ-benzyl-L-glutamate），PBLG］及 N-异丙基丙烯酰胺（N-isopropyl acrylamide，NIPAM）为共聚组分，偶氮二异丁氰（2,2-azobisisobutyronitrile，AIBN）为引发剂，N，N-双（丙稀酰）胱胺（N，N-bisacrylamide，BACy）为交联剂，利用自由基共聚法制备交联聚合物；再通过腙键接载 DOX 制备了一种具有还原响应性、温度敏感性以及 pH 敏感性的多重响应性交联聚合物载药胶束，以期提高聚合物胶束的体内循环稳定性，同时实现其在肿瘤细胞微环境中的高效可控释药，为药物传递体系的构建与研究提供一种新的选择。
1 实验部分
1.1 试剂
NIPAM：纯度 98%，购自萨恩化学技术（上海）有限公司；谷氨酸苄酯；分析纯，购自四川同晟氨基酸有限公司；丙烯胺：纯度 99%，购自成都贝斯特试剂有限公司；AIBN：纯度 99%，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；联肼：纯度 80%，购自天津市致远化学试剂有限公司；DOX：纯度 98%，购自北京华奉联博化学材料有限公司。其余溶剂和试剂均为分析纯，购自成都市科隆化学品有限公司。
1.2 实验过程
整体合成路线如图 1 所示。首先用丙烯胺与谷氨酸苄酯环内酸酐（γ-Benzyl-L-glutamate N-carboxyanhydride，Glu-NCA）反应制得乙烯基 PBLG；用胱胺盐酸盐与丙烯酰氯反应制得 BACy。然后，利用乙烯基 PBLG 及 NIPAM 为共聚组分，AIBN 为引发剂，BACy 为交联剂，并利用自由基共聚法制备交联聚合物；通过腙键接载 DOX 制备多重响应性交联聚合物载药胶束。
图1
载药胶束的合成路线以及药物释放过程
Figure1.
Synthesis route and DOX release process of the drug-conjugated cross-linked micelles
1.2.1 Glu-NCA 的制备
以乙酸乙酯为溶剂，在三口烧瓶中加入谷氨酸苄酯 7.12 g，在氮气保护下，搅拌回流 0.5 h，反应温度为 85℃，加入三光气，继续搅拌 2 h，待溶液澄清。利用正己烷作为溶剂进行纯化，干燥后即得产品。
1.2.2 乙烯基 PBLG 的制备
将丙烯胺 5 μL，Glu-NCA 0.70 g 和 4 mL 二甲基甲酰胺（dimethyl formamide，DMF）同时转移至聚合管中，通入氮气保护。冷冻-解冻循环 3 次后，室温下反应 24 h。反应结束后，将产品用冰乙醚沉淀、过滤、干燥后即得产品。
1.2.3 BACy 的制备
将胱胺盐酸盐 2.30 g，溶于 18 mL 水中；同时取 1.8 mL 丙烯酰氯，溶于 3.0 mL 二氯甲烷中，冰浴降温。用恒压漏斗同时滴加配置好的 NaOH 溶液和丙烯酰氯溶液，冰浴下反应 3 h。利用二氯甲烷对产品进行萃取，利用无水 MgSO4 干燥、过滤、旋蒸、重结晶后即得产品。
1.2.4 交联聚合物的制备
将 NIPAM 0.61 g，乙烯基 PBLG 0.20 g，BACy 0.04 g，AIBN 0.04 g 加入三口烧瓶中，以甲苯作为溶剂，在 85℃ 氮气保护下反应 12 h。反应后将产品再用冰乙醚和四氢呋喃混合液进行沉淀、过滤、干燥后即得产品。
1.2.5 空白胶束的制备
称取交联聚合物 10 mg，溶于 2 mL 的四氢呋喃中，放在磁力搅拌器上搅拌 1 h。将溶液逐滴滴加到 5 mL 的蒸馏水中形成空白胶束。用透析袋（MWCO12000，MYM 生物科技有限公司）透析 3 d，冻干。
1.2.6 交联聚合物载药胶束的制备
将上述交联聚合物溶解于 DMF 中，加入过量的 DOX，避光；室温下，氮气保护，加入联肼在甲苯溶液中反应 24 h。用透析袋（MWCO12000，MYM 生物科技有限公司）透析 3 d，冻干，所得红色粉末即为产品。
1.3 测试与表征
1.3.1 核磁共振分析
本文采用核磁共振仪（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）（Inova-400，美国瓦里安技术有限公司）进行测试，选择氘代三氯甲烷（CDCl3）为样品氘代试剂。
1.3.2 傅里叶变换红外光谱分析
采用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪（IR2000，美国热电公司）进行测试；利用 KBr 盐片涂膜法进行测定，扫描范围为 400～4 000 cm–1，分辨率为 4 cm–1。
1.3.3 紫外光谱分析
紫外吸收光谱（ultraviolet spectrum，UV）分析采用紫外可见光分光光度计（TU1950，上海美谱达仪器有限公司）测试。药物释放紫外吸收波长选择 480 nm。
1.3.4 纳米粒度分析
采用纳米粒度（dynamic light scattereing，DLS）仪（Zetasizer Nano-zs 90，英国马尔文仪器有限公司）进行测试。实验室温度为 25℃，溶剂水的折射率 n = 1.332，入射光波长 λ = 632.8 nm，样品测试持续时间为 300 s。
1.3.5 吸光度分析
利用紫外可见光分光光度计（TU1950，上海美谱达仪器有限公司）测量吸光度，吸收波长为 600 nm，通过测定不同吸光度值计算交联聚合物溶液的相对吸光度。
1.3.6 透射电镜观察
利用透射电镜（transmission electron microscope，TEM）（Hitachi-600 型，日立有限公司）进行测试，将产品滴于铜网的碳膜上，室温干燥后进行观察。
1.3.7 低临界溶液温度的测定
取 1.6 mg 空白胶束溶于 2 mL 去离子水中，配置为 0.8 mg/mL 的空白胶束水溶液，并将溶液从 20℃ 升高至 50℃，每升高 2℃ 恒温 10 min 后，即用紫外可见分光光度计于 500 nm 波长处测溶液透光率，当透光率变化 50% 时的温度即为空白胶束的低临界溶液温度（low critical solution temperature，LCST）。随后，本文又测定了空白胶束分别在 25℃ 和 55℃ 温度下的粒径大小以及空白胶束分别在温度由 25℃ 升高至 45℃ 和由 45℃ 降低至 25℃ 等不同变化趋势下的粒径大小变化情况，以求全面了解胶束粒径随温度变化的情况。
1.4 药物释放
配置 1.0 mg/mL 交联聚合物载药胶束溶液，分别在以下条件下进行实验：① 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS），pH = 7.4，37℃；② GSH，10 mmol/L，PBS（pH = 7.4），37℃；③ 醋酸盐缓冲液（acetate buffer solution，ABS），pH = 5.0，37℃；④ GSH，10 mmol/L，ABS（pH = 5.0），37℃；⑤ GSH，10 mmol/L，ABS（pH = 5.0），42℃。在不同时间间隔分别取出 1.5 mL 用于溶液吸光度测定，进而计算 DOX 累积释放率。依据公式（1）如下所示：
载药效率（%）= 载药量/投入药量 (1)
本文根据 DOX 标准曲线以及式（1）可计算交联聚合物的载药效率。
1.5 细胞毒性实验
在罗斯威尔·帕克纪念研究所 1640 （Roswell Park memorial institute-1640，RPMI-1640）培养基中培养 HeLa 细胞 24 h，然后配置浓度分别为 1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL 以及 80 μg/mL 的样品溶液，各取 200 μL 作用于已处理过的 HeLa 细胞，24 h 后，加入 100 μL 新鲜培养基和 10 μL 细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）试剂，用酶标仪在 450 nm 处检测光密度（optical density，OD）值。以同样方法处理人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），用于检测空白胶束对正常细胞的细胞毒性。
1.6 共聚焦显微镜成像
首先用处理好的 PBS 清洗细胞，然后用 4% 的多聚甲醛使细胞固定住，室温静置 30 min。在避光条件下进行 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，室温静置。然后将细胞与样品一同培养，一定时间后，弃掉培养液，利用激光共聚焦显微镜（AE31，麦克奥迪实业集团有限公司）进行观察拍照。
2 结果与讨论
2.1 交联聚合物以及相关分子的结构分析
利用胱胺盐酸盐与丙烯酰氯反应制得 BACy；用丙烯胺与 Glu-NCA 反应制得乙烯基 PBLG；最后，利用乙烯基 PBLG 及 NIPAM 为共聚组分，AIBN 为引发剂，BACy 为交联剂利用自由基共聚法制备交联聚合物。用1H-NMR 对 BACy、乙烯基 PBLG、交联聚合物以及交联聚合物载药胶束的结构进行了表征。如图 2 中 BACy 的 1H-NMR 所示，δ = 6.5～6.7 对应于仲胺键上的氢，δ = 6.2～6.4 对应于乙烯基上的氢，δ = 3.6～3.8 为二硫键旁 α-碳原子上的氢，δ = 2.7～2.9 为二硫键旁 β-碳原子上的氢。1H-NMR 结果显示，BACy 的合成是成功的。如图 2 中乙烯基 PBLG 的 1H-NMR 所示，δ = 7.8～8.0 对应于主链上仲胺键上的氢，δ = 7.1～7.3 对应于 PBLG 中苯环上的氢，δ = 5.0～5.1 对应于苄基上的氢，δ = 4.5～4.7 为主链次甲基上的氢，δ = 2.8～2.9 对应于引发剂残基上亚甲基的氢，δ = 2.3～2.7 对应于支链上 β-亚甲基上的氢，δ = 2.0～2.1 对应于支链上 α-亚甲基上的氢。1H-NMR 结果显示，乙烯基 PBLG 的合成是成功的。如图 2 中交联聚合物的 1H-NMR 所示，δ = 7.8～8.0 对应于乙烯基 PBLG 主链上仲胺键上的氢，δ = 7.1～7.3 对应于乙烯基 PBLG 中苯环上的氢，δ = 5.0～5.1 对应于苄基上的氢，δ = 4.5～4.7 为主链次甲基上的氢，δ = 2.3～2.7 对应于乙烯基 PBLG 支链上 β-亚甲基上的氢，δ = 2.0～2.1 对应于乙烯基 PBLG 支链上 α-亚甲基上的氢，δ = 1.0～1.3 为 NIPAM 链段上甲基的氢，1H-NMR 结果显示，已成功制备交联聚合物。最后，通过腙键接载 DOX 制备交联聚合物载药胶束。交联聚合物载药胶束的 1H-NMR 结果如图 2 所示。δ = 7.8～8.1 对应于聚合物主链上仲胺键上的氢，δ = 7.1～7.3 对应于 DOX 中苯环上的氢，δ = 5.5～5.6 对应于 DOX 中的羟基上的氢，δ = 4.9～5.1 对应于 DOX 中叔碳上的氢，δ = 4.2～4.3 对应于乙烯基 PBLG 中叔碳上的氢，δ = 4.0～4.2 对应于 NIPAM 中支链次甲基上的氢，δ = 2.3～2.7 对应于乙烯基 PBLG 支链上 β-亚甲基上的氢，δ = 2.0～2.1 对应于乙烯基 PBLG 支链上 α-亚甲基上的氢，δ = 1.1～1.4 为 NIPAM 支链甲基上的氢，δ = 0.8～1.0 对应于 DOX 中甲基上的氢，1H-NMR 结果显示，交联聚合物载药胶束的制备是成功的。
图2
BACy、乙烯基 PBLG、交联聚合物以及交联聚合物载药胶束的 1H-NMR 图及化学结构式
Figure2.
1H-NMR spectra and the chemical structure of BACy, vinyl radical PBLG, cross-linked polymer and DOX-conjugated cross-linked micelle
为进一步验证 BACy，乙烯基 PBLG 以及交联聚合物的化学结构，本实验利用 FTIR 对以上化合物进行了表征。如图 3 所示为 BACy、乙烯基 PBLG 以及交联聚合物的 FTIR 图，其中，BACy 的曲线处 3 266 cm–1为氮氢键的伸缩振动吸收峰，1 560.13 cm–1为碳氧双键的伸缩振动吸收峰，1 049.71 cm–1为碳氮键的伸缩振动吸收峰，698.10 cm–1为碳硫键的伸缩振动吸收峰。结果显示，BACy 的制备是成功的。乙烯基 PBLG 的 FTIR 图显示，3 200～3 500 cm–1为氮氢键的伸缩振动吸收峰，3 080 cm–1为苯环上碳氢键的伸缩振动吸收峰，1 700 cm–1为碳氧双键的伸缩振动吸收峰，1 050～1 210 cm–1为醚键的特征吸收峰。结果显示，乙烯基 PBLG 的制备是成功的。由 NIPAM 和乙烯基 PBLG 的交联聚合物的 FTIR 谱图可知，3 200～3 500 cm–1为氮氢键的伸缩振动吸收峰，3 080 cm–1为苯环上碳氢键的伸缩振动吸收峰，1 700 cm–1为碳氧双键的伸缩振动吸收峰，1 397 cm–1为亚甲基的骨架振动吸收峰，1 050～1 210 cm–1为醚键的特征吸收，698.10 cm–1为碳硫键的伸缩振动吸收峰。结果显示，交联聚合物合成成功。
图3
BACy，乙烯基 PBLG 和交联聚合物的 FTIR 图
Figure3.
FTIR spectra of BACy, vinyl radical PBLG and cross-linked polymer
2.2 空白胶束的还原响应性
平均尺寸为 10～200 nm 的球形或近似球形的纳米形态能够提高载体材料对血管管壁的通透性和 EPR 效应，有利于药物传递。因此，本文对空白胶束的形貌及尺寸大小进行了表征。如图 4 所示，从空白胶束的 DLS 结果中可以看出，在 PBS（pH 7.4）未加入 GSH 的条件下，胶束的粒径为 100 nm 左右。空白胶束的 TEM 照片显示，空白胶束呈球形结构，且分散稳定性良好，其平均粒径为 70 nm 左右。TEM 测出的粒径数值小于 DLS 检测实验测出的粒径，是由于 TEM 实验过程中，胶束滴于铜网上，在干燥条件下进行实验，而空白胶束干燥过程中发生收缩，从而导致其粒径减小。
图4
空白胶束的形貌表征
Figure4.
The morphological characterization of blank micelles
为验证空白胶束的还原响应性，本文利用 DLS 实验对空白胶束在 GSH（10 mmol/L）条件下的粒径变化进行了测试，如图 5 所示。在 PBS（pH 7.4）未加入 GSH 的条件下，空白胶束的粒径在 24 h 内没有发生明显的变化，说明空白胶束在 PBS 条件下粒径形态能够保持稳定。当加入 10 mmol/L GSH 后，空白胶束的粒径随着时间增加而不断增加；而 4 h 后，空白胶束粒径随时间的增加而减小。出现上述现象的原因是由于在 0～4 h 内，空白胶束中的二硫键与 GSH 发生还原反应，使得二硫键断裂，空白胶束发生溶胀使得其粒径逐渐增大；4 h 后，空白胶束中断裂的聚合物分子链逐步脱落，造成其粒径反而减小。为进一步验证空白胶束的还原响应性，本实验中对空白胶束的相对吸光度进行了测试。如图 5 的相对吸光度变化谱图所示，在没有加入 GSH 的条件下，空白胶束的相对吸光度没有发生明显变化。加入 10 mmol/L GSH 后，相对吸光度明显下降。结果表明，空白胶束在 GSH 作用下发生降解；同时证明，所制备空白胶束中的二硫键结构对还原剂 GSH 的浓度变化有较好的响应性。
图5
加入 GSH 的空白胶束 DLS 及相对吸光度变化谱图
Figure5.
The size and the relative absorbance change of blank micelles in response to GSH
2.3 空白胶束的温度敏感性行为实验
温度敏感性聚合物的溶解度在 LCST 附近发生变化，当温度低于 LCST 时，聚合物中氮原子与水分子间的氢键结合使聚合物胶束可溶于水；而当温度高于 LCST 后，氢键被破坏，聚合物中疏水相互作用增强从而导致聚合物胶束崩解，并从水中析出。为测试所制备空白胶束的 LCST，本实验利用紫外可见分光光度计于 500 nm 波长处测量溶液透光率。实验测得空白胶束的 LCST 为 39.4℃，如图 6 中空白胶束随温度变化的透过率变化图所示。同时，从溶解度照片中可以看出，当温度低于 LCST 时，空白胶束可溶于水，形成透明溶液；而当温度高于 LCST 后，氢键被破坏，并从水中析出，溶液出现浑浊。实验测得的空白胶束有较高的 LCST，其原因是空白胶束核壳结构中有氨基酸组分存在，其酰胺键结构增强了空白胶束与水分子间的氢键作用，这也更有利于空白胶束在人体正常温度下的循环稳定性和药物的传递。由空白胶束在不同温度下的粒径图可知，温度为 25℃ 时，空白胶束的粒径大小为 220 nm，温度为 55℃ 时，空白胶束的粒径大小为 164 nm，结果说明空白胶束可在高温条件下发生收缩，证明了其具备温度敏感性。从图 6 中空白胶束随温度变化的粒径变化图可知，当将温度从 25℃ 升高至 45℃ 时，空白胶束的粒径从 220 nm 下降至 168 nm，同时，当将温度由 45℃ 冷却至 25℃ 时，空白胶束的粒径从 170 nm 增大至 221 nm，表明了空白胶束随温度变化的可逆性，显示了其作为载药材料的可控性。
图6
空白胶束的温度敏感性行为
Figure6.
Thermosensitive behavior of blank micelles
2.4 交联聚合物载药胶束对药物的控制释放
为进一步研究交联聚合物载药胶束的释药性能，本文对其可控释药的多重响应性条件进行了探索。首先，利用紫外可见分光光度计在 480 nm 处测定交联聚合物载药胶束的吸光度，计算得到交联聚合物的载药效率为 44.74%，表明交联聚合物对药物有较高的载药效率。本文设定了① 37℃，PBS（pH = 7.4）；② 37℃，PBS（pH = 7.4），GSH 10 mmol/L；③ 37℃，ABS（pH = 5.0）；④ 37℃，ABS（pH = 5.0），GSH 10 mmol/L；⑤ 42℃，ABS（pH = 5.0），GSH 10 mmol/L 共 5 种不同的微环境条件，并测试了在 5 种条件下交联聚合物载药胶束的药物释放性能。如图 7 所示，游离 DOX 在 5 h 内快速释放，其累积释放率达 95.04%。当交联聚合物载药胶束在① 条件下，24 h 的累积释放率仅为 1.12%；在 ② 条件下，其 24 h 累积释放率为 43.78%；在 ③ 条件下，其 24 h 累积释放率为 68.65%；在 ④ 条件下，其释放率为 86%；在 ⑤ 条件下，其 24 h 累积释放率达到最高，为 91.78%。实验数据表明：① 交联聚合物载药胶束在无刺激条件下仅存在微量的药物释放，表明其具有优异的药物稳定性；② GSH 条件下药物释放效率较大，表明其具有良好的还原响应性；③ 酸性条件下较中性条件药物释放效率增大，是由于交联聚合物载药胶束中腙键在酸性条件下断裂，表明其具有良好的 pH 敏感性；④ 高温条件下（42℃）药物释放效率较大，表明交联聚合物载药胶束具有温度敏感性。综上所述，由于肿瘤细胞内涵体的弱酸性微环境（pH 5.0），同时细胞内 GSH 浓度较高，温度也较正常细胞偏高，故本文所制备交联聚合物载药胶束有望在肿瘤细胞内快速高效释药；而在人体正常 pH 条件下微量释药，从而有效减小药物毒副作用，提高药物的传递效率。
图7
交联聚合物载药胶束的药物释放表征
Figure7.
DOX release profiles of DOX conjugated cross-linked micelle
2.5 交联聚合物载药胶束的细胞毒性研究
为了进一步研究交联聚合物载药胶束在细胞中的摄入和分布情况，本文对其进行了共聚焦显微镜实验。如图 8 所示为 HeLa 细胞分别在游离 DOX 和交联聚合物载药胶束溶液中培养 2 h 和 24 h 的激光共聚焦图像。从图中可以看出，与样品培养 2 h 后游离 DOX 在 HeLa 细胞内仅出现了较弱的 DOX 荧光信号；而交联聚合物载药胶束在 HeLa 细胞内出现了较强的 DOX 荧光信号。这是由于交联聚合物载药胶束在肿瘤细胞微环境条件下能够快速释放药物，而游离 DOX 是通过扩散机制进入细胞，因扩散速度较慢从而导致 DOX 的细胞摄入量较低。交联聚合物载药胶束与 HeLa 细胞培养 24 h 后，从游离 DOX 与从胶束中进入 HeLa 细胞内的 DOX 荧光信号相似，表明两者具有相似的 DOX 细胞摄入量。实验结果表明，交联聚合物载药胶束进入细胞后能快速释放出 DOX，并且能够进入细胞核，进而有效杀伤肿瘤细胞。
图8
HeLa 细胞激光共聚焦显微图像
Figure8.
The laser confocal micrograph of HeLa cells
在前述研究基础上，本文课题组采用 CCK8 法对 HUVEC 细胞以及 HeLa 细胞进行了细胞毒性实验，如图 9 所示。由 HUVEC 细胞活性实验可知，在空白胶束样品中细胞存活率较高，表明空白胶束有较好的生物相容性；通过对交联聚合物载药胶束对 HeLa 细胞的抑制率随浓度的变化曲线进行拟合计算可得，DOX 的半抑制率浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为 19.6 μg/mL；交联聚合物载药胶束的 IC50 为 33.2 μg/mL，其肿瘤细胞抑制率略低于 DOX。结果表明，随着交联聚合物载药胶束中 DOX 浓度的增强，交联聚合物载药胶束在肿瘤细胞微环境条件刺激下释放药物分子进而杀死癌细胞，因此其具备良好的抗肿瘤活性。HeLa 细胞活性实验的结果显示，细胞存活率随着空白胶束浓度增高而降低，空白胶束对 HeLa 细胞表现出了低毒性。这是由于 HeLa 细胞内 GSH 的浓度为 2～10 mmol/L，在此还原条件下空白胶束内二硫键断裂，降解产生 PBLG 分子链，因而对 HeLa 细胞造成一定的细胞毒性；然而，在 HUVEC 细胞内 GSH 的浓度较低，仅有 1.2 mmol/L，空白胶束内二硫键几乎未发生断裂，整体保持胶束原有结构，不会对 HUVEC 细胞造成明显细胞毒性，因此表现出较好的生物相容性。以上结果再次证实了本课题组最初期望将该交联聚合物载药胶束具有作为载药材料潜力的猜想。
图9
HUVEC 细胞和 HeLa 细胞存活率表征
Figure9.
Survival assay of HUVEC cells and HeLa cells
3 结论
本文利用自由基共聚法合成了交联聚合物，再通过腙键接载 DOX 制备具有还原响应性、温度敏感性以及 pH 敏感性的三重响应性交联聚合物载药胶束。实验结果显示，此交联聚合物载药胶束在 GSH 10 mmol/L 条件下发生二硫键断裂，交联聚合物载药胶束发生降解；其 LCST 为 39.4℃，在肿瘤细胞温度下发生收缩；在 pH 5.0 的弱酸性条件下腙键断裂释放药物。细胞毒性实验表明，该交联聚合物载药胶束具备较好的生物相容性和抗肿瘤活性趋势。综上所述，本文所制备的三重响应性交联聚合物载药胶束有望成为一种具备高效可控释药功能的理想载体材料。
引言
近年来，聚合物胶束由于其独特的双亲性结构受到了研究者们广泛的关注[1]。聚合物胶束可包载疏水性药物，在提高疏水性药物的溶解度以及生物利用度的同时，其纳米级的尺度可利用肿瘤组织的高通透性和滞留效应（enhanced permeation retention effect，EPR）增强药物对肿瘤组织血管壁的渗透[2-3]。而经过化学交联的聚合物胶束因具有稳定化学结构，可以防止胶束在体内循环中由于稀释以及化学环境变化等原因导致的分解，同时交联结构内部大量的空腔还可提高胶束载药量，有利于提高其对肿瘤的治疗效果[4-6]。
为了使药物在肿瘤组织达到高效释放的目的，交联聚合物载药胶束应具有对肿瘤细胞内微环境的响应性。研究发现，肿瘤细胞与正常细胞内微环境条件明显不同，如肿瘤细胞中内涵体和溶酶体 pH 为 4～6，正常细胞 pH 为 7.4[7-12]；同时，肿瘤细胞中谷胱甘肽（glutathione，GSH）浓度（2～10 mmol/L）比正常组织细胞（1.2 mmol/L）高数倍，因而肿瘤细胞微环境具有较高的还原响应性[13-15]；另外，肿瘤细胞内较高的糖酵解速率也使其处于高温环境（40～42℃）[16]。因此，构建一种结构稳定，同时能够响应细胞内多重刺激的“智能”药物载体体系是目前交联聚合物载药胶束的研究热点[17]。Lin 等[18]制备了一种以聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯为亲水段，聚 ε-己内酯为疏水段的可降解聚合物胶束，在 10 mmol/L 二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）以及 pH 5.0 条件的双重刺激下，药物实现了高效靶向释放。Gao 等[19]利用聚多肽合成了一种具有还原响应性以及温度敏感性的双响应性聚合物胶束，其临界聚集胶束浓度远小于未交联聚合物胶束的临界聚集胶束浓度，同时包裹阿霉素（doxorubicin，DOX）后能够有效杀伤人宫颈癌细胞系 HeLa 细胞。虽然研究者对刺激响应性交联聚合物胶束进行了广泛的研究，但同时具有还原响应性、温度敏感性以及 pH 敏感性的多重响应性交联聚合物载药胶束却报道较少。
基于以上原因，并参考前述文献所描述的肿瘤细胞内微环境的特征条件，本文利用乙烯基聚谷氨酸苄酯［poly（γ-benzyl-L-glutamate），PBLG］及 N-异丙基丙烯酰胺（N-isopropyl acrylamide，NIPAM）为共聚组分，偶氮二异丁氰（2,2-azobisisobutyronitrile，AIBN）为引发剂，N，N-双（丙稀酰）胱胺（N，N-bisacrylamide，BACy）为交联剂，利用自由基共聚法制备交联聚合物；再通过腙键接载 DOX 制备了一种具有还原响应性、温度敏感性以及 pH 敏感性的多重响应性交联聚合物载药胶束，以期提高聚合物胶束的体内循环稳定性，同时实现其在肿瘤细胞微环境中的高效可控释药，为药物传递体系的构建与研究提供一种新的选择。
1 实验部分
1.1 试剂
NIPAM：纯度 98%，购自萨恩化学技术（上海）有限公司；谷氨酸苄酯；分析纯，购自四川同晟氨基酸有限公司；丙烯胺：纯度 99%，购自成都贝斯特试剂有限公司；AIBN：纯度 99%，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；联肼：纯度 80%，购自天津市致远化学试剂有限公司；DOX：纯度 98%，购自北京华奉联博化学材料有限公司。其余溶剂和试剂均为分析纯，购自成都市科隆化学品有限公司。
1.2 实验过程
整体合成路线如图 1 所示。首先用丙烯胺与谷氨酸苄酯环内酸酐（γ-Benzyl-L-glutamate N-carboxyanhydride，Glu-NCA）反应制得乙烯基 PBLG；用胱胺盐酸盐与丙烯酰氯反应制得 BACy。然后，利用乙烯基 PBLG 及 NIPAM 为共聚组分，AIBN 为引发剂，BACy 为交联剂，并利用自由基共聚法制备交联聚合物；通过腙键接载 DOX 制备多重响应性交联聚合物载药胶束。
图1
载药胶束的合成路线以及药物释放过程
Figure1.
Synthesis route and DOX release process of the drug-conjugated cross-linked micelles
1.2.1 Glu-NCA 的制备
以乙酸乙酯为溶剂，在三口烧瓶中加入谷氨酸苄酯 7.12 g，在氮气保护下，搅拌回流 0.5 h，反应温度为 85℃，加入三光气，继续搅拌 2 h，待溶液澄清。利用正己烷作为溶剂进行纯化，干燥后即得产品。
1.2.2 乙烯基 PBLG 的制备
将丙烯胺 5 μL，Glu-NCA 0.70 g 和 4 mL 二甲基甲酰胺（dimethyl formamide，DMF）同时转移至聚合管中，通入氮气保护。冷冻-解冻循环 3 次后，室温下反应 24 h。反应结束后，将产品用冰乙醚沉淀、过滤、干燥后即得产品。
1.2.3 BACy 的制备
将胱胺盐酸盐 2.30 g，溶于 18 mL 水中；同时取 1.8 mL 丙烯酰氯，溶于 3.0 mL 二氯甲烷中，冰浴降温。用恒压漏斗同时滴加配置好的 NaOH 溶液和丙烯酰氯溶液，冰浴下反应 3 h。利用二氯甲烷对产品进行萃取，利用无水 MgSO4 干燥、过滤、旋蒸、重结晶后即得产品。
1.2.4 交联聚合物的制备
将 NIPAM 0.61 g，乙烯基 PBLG 0.20 g，BACy 0.04 g，AIBN 0.04 g 加入三口烧瓶中，以甲苯作为溶剂，在 85℃ 氮气保护下反应 12 h。反应后将产品再用冰乙醚和四氢呋喃混合液进行沉淀、过滤、干燥后即得产品。
1.2.5 空白胶束的制备
称取交联聚合物 10 mg，溶于 2 mL 的四氢呋喃中，放在磁力搅拌器上搅拌 1 h。将溶液逐滴滴加到 5 mL 的蒸馏水中形成空白胶束。用透析袋（MWCO12000，MYM 生物科技有限公司）透析 3 d，冻干。
1.2.6 交联聚合物载药胶束的制备
将上述交联聚合物溶解于 DMF 中，加入过量的 DOX，避光；室温下，氮气保护，加入联肼在甲苯溶液中反应 24 h。用透析袋（MWCO12000，MYM 生物科技有限公司）透析 3 d，冻干，所得红色粉末即为产品。
1.3 测试与表征
1.3.1 核磁共振分析
本文采用核磁共振仪（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）（Inova-400，美国瓦里安技术有限公司）进行测试，选择氘代三氯甲烷（CDCl3）为样品氘代试剂。
1.3.2 傅里叶变换红外光谱分析
采用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪（IR2000，美国热电公司）进行测试；利用 KBr 盐片涂膜法进行测定，扫描范围为 400～4 000 cm–1，分辨率为 4 cm–1。
1.3.3 紫外光谱分析
紫外吸收光谱（ultraviolet spectrum，UV）分析采用紫外可见光分光光度计（TU1950，上海美谱达仪器有限公司）测试。药物释放紫外吸收波长选择 480 nm。
1.3.4 纳米粒度分析
采用纳米粒度（dynamic light scattereing，DLS）仪（Zetasizer Nano-zs 90，英国马尔文仪器有限公司）进行测试。实验室温度为 25℃，溶剂水的折射率 n = 1.332，入射光波长 λ = 632.8 nm，样品测试持续时间为 300 s。
1.3.5 吸光度分析
利用紫外可见光分光光度计（TU1950，上海美谱达仪器有限公司）测量吸光度，吸收波长为 600 nm，通过测定不同吸光度值计算交联聚合物溶液的相对吸光度。
1.3.6 透射电镜观察
利用透射电镜（transmission electron microscope，TEM）（Hitachi-600 型，日立有限公司）进行测试，将产品滴于铜网的碳膜上，室温干燥后进行观察。
1.3.7 低临界溶液温度的测定
取 1.6 mg 空白胶束溶于 2 mL 去离子水中，配置为 0.8 mg/mL 的空白胶束水溶液，并将溶液从 20℃ 升高至 50℃，每升高 2℃ 恒温 10 min 后，即用紫外可见分光光度计于 500 nm 波长处测溶液透光率，当透光率变化 50% 时的温度即为空白胶束的低临界溶液温度（low critical solution temperature，LCST）。随后，本文又测定了空白胶束分别在 25℃ 和 55℃ 温度下的粒径大小以及空白胶束分别在温度由 25℃ 升高至 45℃ 和由 45℃ 降低至 25℃ 等不同变化趋势下的粒径大小变化情况，以求全面了解胶束粒径随温度变化的情况。
1.4 药物释放
配置 1.0 mg/mL 交联聚合物载药胶束溶液，分别在以下条件下进行实验：① 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS），pH = 7.4，37℃；② GSH，10 mmol/L，PBS（pH = 7.4），37℃；③ 醋酸盐缓冲液（acetate buffer solution，ABS），pH = 5.0，37℃；④ GSH，10 mmol/L，ABS（pH = 5.0），37℃；⑤ GSH，10 mmol/L，ABS（pH = 5.0），42℃。在不同时间间隔分别取出 1.5 mL 用于溶液吸光度测定，进而计算 DOX 累积释放率。依据公式（1）如下所示：
载药效率（%）= 载药量/投入药量 (1)
本文根据 DOX 标准曲线以及式（1）可计算交联聚合物的载药效率。
1.5 细胞毒性实验
在罗斯威尔·帕克纪念研究所 1640 （Roswell Park memorial institute-1640，RPMI-1640）培养基中培养 HeLa 细胞 24 h，然后配置浓度分别为 1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL 以及 80 μg/mL 的样品溶液，各取 200 μL 作用于已处理过的 HeLa 细胞，24 h 后，加入 100 μL 新鲜培养基和 10 μL 细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）试剂，用酶标仪在 450 nm 处检测光密度（optical density，OD）值。以同样方法处理人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），用于检测空白胶束对正常细胞的细胞毒性。
1.6 共聚焦显微镜成像
首先用处理好的 PBS 清洗细胞，然后用 4% 的多聚甲醛使细胞固定住，室温静置 30 min。在避光条件下进行 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，室温静置。然后将细胞与样品一同培养，一定时间后，弃掉培养液，利用激光共聚焦显微镜（AE31，麦克奥迪实业集团有限公司）进行观察拍照。
2 结果与讨论
2.1 交联聚合物以及相关分子的结构分析
利用胱胺盐酸盐与丙烯酰氯反应制得 BACy；用丙烯胺与 Glu-NCA 反应制得乙烯基 PBLG；最后，利用乙烯基 PBLG 及 NIPAM 为共聚组分，AIBN 为引发剂，BACy 为交联剂利用自由基共聚法制备交联聚合物。用1H-NMR 对 BACy、乙烯基 PBLG、交联聚合物以及交联聚合物载药胶束的结构进行了表征。如图 2 中 BACy 的 1H-NMR 所示，δ = 6.5～6.7 对应于仲胺键上的氢，δ = 6.2～6.4 对应于乙烯基上的氢，δ = 3.6～3.8 为二硫键旁 α-碳原子上的氢，δ = 2.7～2.9 为二硫键旁 β-碳原子上的氢。1H-NMR 结果显示，BACy 的合成是成功的。如图 2 中乙烯基 PBLG 的 1H-NMR 所示，δ = 7.8～8.0 对应于主链上仲胺键上的氢，δ = 7.1～7.3 对应于 PBLG 中苯环上的氢，δ = 5.0～5.1 对应于苄基上的氢，δ = 4.5～4.7 为主链次甲基上的氢，δ = 2.8～2.9 对应于引发剂残基上亚甲基的氢，δ = 2.3～2.7 对应于支链上 β-亚甲基上的氢，δ = 2.0～2.1 对应于支链上 α-亚甲基上的氢。1H-NMR 结果显示，乙烯基 PBLG 的合成是成功的。如图 2 中交联聚合物的 1H-NMR 所示，δ = 7.8～8.0 对应于乙烯基 PBLG 主链上仲胺键上的氢，δ = 7.1～7.3 对应于乙烯基 PBLG 中苯环上的氢，δ = 5.0～5.1 对应于苄基上的氢，δ = 4.5～4.7 为主链次甲基上的氢，δ = 2.3～2.7 对应于乙烯基 PBLG 支链上 β-亚甲基上的氢，δ = 2.0～2.1 对应于乙烯基 PBLG 支链上 α-亚甲基上的氢，δ = 1.0～1.3 为 NIPAM 链段上甲基的氢，1H-NMR 结果显示，已成功制备交联聚合物。最后，通过腙键接载 DOX 制备交联聚合物载药胶束。交联聚合物载药胶束的 1H-NMR 结果如图 2 所示。δ = 7.8～8.1 对应于聚合物主链上仲胺键上的氢，δ = 7.1～7.3 对应于 DOX 中苯环上的氢，δ = 5.5～5.6 对应于 DOX 中的羟基上的氢，δ = 4.9～5.1 对应于 DOX 中叔碳上的氢，δ = 4.2～4.3 对应于乙烯基 PBLG 中叔碳上的氢，δ = 4.0～4.2 对应于 NIPAM 中支链次甲基上的氢，δ = 2.3～2.7 对应于乙烯基 PBLG 支链上 β-亚甲基上的氢，δ = 2.0～2.1 对应于乙烯基 PBLG 支链上 α-亚甲基上的氢，δ = 1.1～1.4 为 NIPAM 支链甲基上的氢，δ = 0.8～1.0 对应于 DOX 中甲基上的氢，1H-NMR 结果显示，交联聚合物载药胶束的制备是成功的。
图2
BACy、乙烯基 PBLG、交联聚合物以及交联聚合物载药胶束的 1H-NMR 图及化学结构式
Figure2.
1H-NMR spectra and the chemical structure of BACy, vinyl radical PBLG, cross-linked polymer and DOX-conjugated cross-linked micelle
为进一步验证 BACy，乙烯基 PBLG 以及交联聚合物的化学结构，本实验利用 FTIR 对以上化合物进行了表征。如图 3 所示为 BACy、乙烯基 PBLG 以及交联聚合物的 FTIR 图，其中，BACy 的曲线处 3 266 cm–1为氮氢键的伸缩振动吸收峰，1 560.13 cm–1为碳氧双键的伸缩振动吸收峰，1 049.71 cm–1为碳氮键的伸缩振动吸收峰，698.10 cm–1为碳硫键的伸缩振动吸收峰。结果显示，BACy 的制备是成功的。乙烯基 PBLG 的 FTIR 图显示，3 200～3 500 cm–1为氮氢键的伸缩振动吸收峰，3 080 cm–1为苯环上碳氢键的伸缩振动吸收峰，1 700 cm–1为碳氧双键的伸缩振动吸收峰，1 050～1 210 cm–1为醚键的特征吸收峰。结果显示，乙烯基 PBLG 的制备是成功的。由 NIPAM 和乙烯基 PBLG 的交联聚合物的 FTIR 谱图可知，3 200～3 500 cm–1为氮氢键的伸缩振动吸收峰，3 080 cm–1为苯环上碳氢键的伸缩振动吸收峰，1 700 cm–1为碳氧双键的伸缩振动吸收峰，1 397 cm–1为亚甲基的骨架振动吸收峰，1 050～1 210 cm–1为醚键的特征吸收，698.10 cm–1为碳硫键的伸缩振动吸收峰。结果显示，交联聚合物合成成功。
图3
BACy，乙烯基 PBLG 和交联聚合物的 FTIR 图
Figure3.
FTIR spectra of BACy, vinyl radical PBLG and cross-linked polymer
2.2 空白胶束的还原响应性
平均尺寸为 10～200 nm 的球形或近似球形的纳米形态能够提高载体材料对血管管壁的通透性和 EPR 效应，有利于药物传递。因此，本文对空白胶束的形貌及尺寸大小进行了表征。如图 4 所示，从空白胶束的 DLS 结果中可以看出，在 PBS（pH 7.4）未加入 GSH 的条件下，胶束的粒径为 100 nm 左右。空白胶束的 TEM 照片显示，空白胶束呈球形结构，且分散稳定性良好，其平均粒径为 70 nm 左右。TEM 测出的粒径数值小于 DLS 检测实验测出的粒径，是由于 TEM 实验过程中，胶束滴于铜网上，在干燥条件下进行实验，而空白胶束干燥过程中发生收缩，从而导致其粒径减小。
图4
空白胶束的形貌表征
Figure4.
The morphological characterization of blank micelles
为验证空白胶束的还原响应性，本文利用 DLS 实验对空白胶束在 GSH（10 mmol/L）条件下的粒径变化进行了测试，如图 5 所示。在 PBS（pH 7.4）未加入 GSH 的条件下，空白胶束的粒径在 24 h 内没有发生明显的变化，说明空白胶束在 PBS 条件下粒径形态能够保持稳定。当加入 10 mmol/L GSH 后，空白胶束的粒径随着时间增加而不断增加；而 4 h 后，空白胶束粒径随时间的增加而减小。出现上述现象的原因是由于在 0～4 h 内，空白胶束中的二硫键与 GSH 发生还原反应，使得二硫键断裂，空白胶束发生溶胀使得其粒径逐渐增大；4 h 后，空白胶束中断裂的聚合物分子链逐步脱落，造成其粒径反而减小。为进一步验证空白胶束的还原响应性，本实验中对空白胶束的相对吸光度进行了测试。如图 5 的相对吸光度变化谱图所示，在没有加入 GSH 的条件下，空白胶束的相对吸光度没有发生明显变化。加入 10 mmol/L GSH 后，相对吸光度明显下降。结果表明，空白胶束在 GSH 作用下发生降解；同时证明，所制备空白胶束中的二硫键结构对还原剂 GSH 的浓度变化有较好的响应性。
图5
加入 GSH 的空白胶束 DLS 及相对吸光度变化谱图
Figure5.
The size and the relative absorbance change of blank micelles in response to GSH
2.3 空白胶束的温度敏感性行为实验
温度敏感性聚合物的溶解度在 LCST 附近发生变化，当温度低于 LCST 时，聚合物中氮原子与水分子间的氢键结合使聚合物胶束可溶于水；而当温度高于 LCST 后，氢键被破坏，聚合物中疏水相互作用增强从而导致聚合物胶束崩解，并从水中析出。为测试所制备空白胶束的 LCST，本实验利用紫外可见分光光度计于 500 nm 波长处测量溶液透光率。实验测得空白胶束的 LCST 为 39.4℃，如图 6 中空白胶束随温度变化的透过率变化图所示。同时，从溶解度照片中可以看出，当温度低于 LCST 时，空白胶束可溶于水，形成透明溶液；而当温度高于 LCST 后，氢键被破坏，并从水中析出，溶液出现浑浊。实验测得的空白胶束有较高的 LCST，其原因是空白胶束核壳结构中有氨基酸组分存在，其酰胺键结构增强了空白胶束与水分子间的氢键作用，这也更有利于空白胶束在人体正常温度下的循环稳定性和药物的传递。由空白胶束在不同温度下的粒径图可知，温度为 25℃ 时，空白胶束的粒径大小为 220 nm，温度为 55℃ 时，空白胶束的粒径大小为 164 nm，结果说明空白胶束可在高温条件下发生收缩，证明了其具备温度敏感性。从图 6 中空白胶束随温度变化的粒径变化图可知，当将温度从 25℃ 升高至 45℃ 时，空白胶束的粒径从 220 nm 下降至 168 nm，同时，当将温度由 45℃ 冷却至 25℃ 时，空白胶束的粒径从 170 nm 增大至 221 nm，表明了空白胶束随温度变化的可逆性，显示了其作为载药材料的可控性。
图6
空白胶束的温度敏感性行为
Figure6.
Thermosensitive behavior of blank micelles
2.4 交联聚合物载药胶束对药物的控制释放
为进一步研究交联聚合物载药胶束的释药性能，本文对其可控释药的多重响应性条件进行了探索。首先，利用紫外可见分光光度计在 480 nm 处测定交联聚合物载药胶束的吸光度，计算得到交联聚合物的载药效率为 44.74%，表明交联聚合物对药物有较高的载药效率。本文设定了① 37℃，PBS（pH = 7.4）；② 37℃，PBS（pH = 7.4），GSH 10 mmol/L；③ 37℃，ABS（pH = 5.0）；④ 37℃，ABS（pH = 5.0），GSH 10 mmol/L；⑤ 42℃，ABS（pH = 5.0），GSH 10 mmol/L 共 5 种不同的微环境条件，并测试了在 5 种条件下交联聚合物载药胶束的药物释放性能。如图 7 所示，游离 DOX 在 5 h 内快速释放，其累积释放率达 95.04%。当交联聚合物载药胶束在① 条件下，24 h 的累积释放率仅为 1.12%；在 ② 条件下，其 24 h 累积释放率为 43.78%；在 ③ 条件下，其 24 h 累积释放率为 68.65%；在 ④ 条件下，其释放率为 86%；在 ⑤ 条件下，其 24 h 累积释放率达到最高，为 91.78%。实验数据表明：① 交联聚合物载药胶束在无刺激条件下仅存在微量的药物释放，表明其具有优异的药物稳定性；② GSH 条件下药物释放效率较大，表明其具有良好的还原响应性；③ 酸性条件下较中性条件药物释放效率增大，是由于交联聚合物载药胶束中腙键在酸性条件下断裂，表明其具有良好的 pH 敏感性；④ 高温条件下（42℃）药物释放效率较大，表明交联聚合物载药胶束具有温度敏感性。综上所述，由于肿瘤细胞内涵体的弱酸性微环境（pH 5.0），同时细胞内 GSH 浓度较高，温度也较正常细胞偏高，故本文所制备交联聚合物载药胶束有望在肿瘤细胞内快速高效释药；而在人体正常 pH 条件下微量释药，从而有效减小药物毒副作用，提高药物的传递效率。
图7
交联聚合物载药胶束的药物释放表征
Figure7.
DOX release profiles of DOX conjugated cross-linked micelle
2.5 交联聚合物载药胶束的细胞毒性研究
为了进一步研究交联聚合物载药胶束在细胞中的摄入和分布情况，本文对其进行了共聚焦显微镜实验。如图 8 所示为 HeLa 细胞分别在游离 DOX 和交联聚合物载药胶束溶液中培养 2 h 和 24 h 的激光共聚焦图像。从图中可以看出，与样品培养 2 h 后游离 DOX 在 HeLa 细胞内仅出现了较弱的 DOX 荧光信号；而交联聚合物载药胶束在 HeLa 细胞内出现了较强的 DOX 荧光信号。这是由于交联聚合物载药胶束在肿瘤细胞微环境条件下能够快速释放药物，而游离 DOX 是通过扩散机制进入细胞，因扩散速度较慢从而导致 DOX 的细胞摄入量较低。交联聚合物载药胶束与 HeLa 细胞培养 24 h 后，从游离 DOX 与从胶束中进入 HeLa 细胞内的 DOX 荧光信号相似，表明两者具有相似的 DOX 细胞摄入量。实验结果表明，交联聚合物载药胶束进入细胞后能快速释放出 DOX，并且能够进入细胞核，进而有效杀伤肿瘤细胞。
图8
HeLa 细胞激光共聚焦显微图像
Figure8.
The laser confocal micrograph of HeLa cells
在前述研究基础上，本文课题组采用 CCK8 法对 HUVEC 细胞以及 HeLa 细胞进行了细胞毒性实验，如图 9 所示。由 HUVEC 细胞活性实验可知，在空白胶束样品中细胞存活率较高，表明空白胶束有较好的生物相容性；通过对交联聚合物载药胶束对 HeLa 细胞的抑制率随浓度的变化曲线进行拟合计算可得，DOX 的半抑制率浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为 19.6 μg/mL；交联聚合物载药胶束的 IC50 为 33.2 μg/mL，其肿瘤细胞抑制率略低于 DOX。结果表明，随着交联聚合物载药胶束中 DOX 浓度的增强，交联聚合物载药胶束在肿瘤细胞微环境条件刺激下释放药物分子进而杀死癌细胞，因此其具备良好的抗肿瘤活性。HeLa 细胞活性实验的结果显示，细胞存活率随着空白胶束浓度增高而降低，空白胶束对 HeLa 细胞表现出了低毒性。这是由于 HeLa 细胞内 GSH 的浓度为 2～10 mmol/L，在此还原条件下空白胶束内二硫键断裂，降解产生 PBLG 分子链，因而对 HeLa 细胞造成一定的细胞毒性；然而，在 HUVEC 细胞内 GSH 的浓度较低，仅有 1.2 mmol/L，空白胶束内二硫键几乎未发生断裂，整体保持胶束原有结构，不会对 HUVEC 细胞造成明显细胞毒性，因此表现出较好的生物相容性。以上结果再次证实了本课题组最初期望将该交联聚合物载药胶束具有作为载药材料潜力的猜想。
图9
HUVEC 细胞和 HeLa 细胞存活率表征
Figure9.
Survival assay of HUVEC cells and HeLa cells
3 结论
本文利用自由基共聚法合成了交联聚合物，再通过腙键接载 DOX 制备具有还原响应性、温度敏感性以及 pH 敏感性的三重响应性交联聚合物载药胶束。实验结果显示，此交联聚合物载药胶束在 GSH 10 mmol/L 条件下发生二硫键断裂，交联聚合物载药胶束发生降解；其 LCST 为 39.4℃，在肿瘤细胞温度下发生收缩；在 pH 5.0 的弱酸性条件下腙键断裂释放药物。细胞毒性实验表明，该交联聚合物载药胶束具备较好的生物相容性和抗肿瘤活性趋势。综上所述，本文所制备的三重响应性交联聚合物载药胶束有望成为一种具备高效可控释药功能的理想载体材料。
