为了给鲤鱼机器人脑电极准确植入进行定位导航，本研究拟建立脑结构及脑电极三维立体模型。借助脑立体定位仪将钨电极植入鲤鱼小脑，通过离水电刺激实验和水下控制实验发现脑运动区并获取其三维坐标值，应用 3.0 T 磁共振成像仪对颅脑及电极成像，应用 3D-DOCTOR 和 Mimics 软件进行三维重建。结果显示，所发现的脑运动区及坐标值是准确的，构建的脑组织及脑电极三维重建图再现了脑立体结构，可观察到脑电极与脑组织、脑组织与颅骨表面的相对空间位置关系；通过构建的脑组织三维重建综合显示图，可观察到三维重建的脑组织在磁共振图像中的解剖位置，以及脑组织与颅骨表面的相对空间位置关系。本研究所构建的三维重建模型可为脑电极植入提供定位导航工具。
引用本文： 彭勇, 王爱迪, 王婷婷, 李京龙, 王占秋, 赵洋, 王子霖, 赵政. 面向生物控制的鲤鱼脑组织及脑电极三维重建. 生物医学工程学杂志, 2020, 37(5): 885-891. doi: 10.7507/1001-5515.201911011 复制
引言
生物机器人是人类通过控制技术施加干预信号调控生物行为从而实现人类操控的生物[1]，可应用于环境监测、生态研究、地貌勘探、灾难搜救和反恐侦查等方面，是具有潜在广泛应用前景的重要领域。对于动物机器人的研究工作，目前多集中于对其脑运动区及脑控神经机制的探索，实现对脑的控制是最本质的控制，这样才有可能使动物机器人按照人类的意愿去行动[2]。目前国际上对各种动物机器人的控制主要是应用控脑技术，通过植入在脑运动区的脑电极施加模拟电刺激信号来控制动物的运动，因此，脑电极能否准确植入脑运动区是一个关键问题，也是生物控制领域的一个重要课题。在鲤鱼水生动物机器人控制中也需植入脑电极，为有助于解决这个问题，本研究应用磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和三维重建技术建立鲤鱼脑结构及脑电极的三维立体模型，该模型可为脑电极的精准植入直观显示脑电极的植入方向和植入位点，可为脑电极的精准植入提供定位与导航。
MRI 是利用射频脉冲激发处于磁场中的原子核（如氢核），再利用原子核退激弛豫时释放的能量成像[3]。基于 MRI 的优势和特点，MRI 技术在临床医学和科研方面的应用越来越成为无法替代的技术手段，迅速扩大了多学科领域的发展空间，也为生物脑的研究提供了一种更为精准且可靠的技术支持。
三维医学图像的重建与可视化技术是利用人类的视觉特性对图像进行研究处理的一种技术[4]，是在二维平面上展示物体的三维形态，可以对该物体的三维立体形态进行还原，用于观察组织结构的内部信息，在结构成像和功能成像融合中起着重要的作用。由于目前利用磁共振成像仪扫描得到的图像是二维图像，对于结构复杂的组织器官来说，并不能完整地显示出其立体结构信息，无法直观了解组织器官与周围结构的相对空间位置关系，不能提供直观的立体印象。而三维重建技术可以解决这些问题，在结构和功能成像融合中发挥作用，尤其是从 MRI 图像入手来重建三维模型更是得到了广泛应用。
在鲤鱼机器人控制中需植入脑电极，通过脑电极对脑运动区进行电刺激实现对鲤鱼机器人水下运动的控制。由于植入式电极比较细，一般成像手段不易观察到电极针道和植入位点，难以直观确定鲤鱼脑组织与脑电极的相对空间位置关系，而且由于鲤鱼脑组织较小，也不易观察到脑组织结构及形态。为此，本研究借助脑立体定位仪将钨电极植入鲤鱼小脑脑运动区，通过离水电刺激实验和水下控制实验两种方法来发现脑运动区并获取其三维坐标值，应用 3.0 T 磁共振成像仪对脑组织及脑电极同时扫描成像，再利用 3D-DOCTOR 软件和 Mimics 软件实现脑组织及植入脑电极的三维可视化，构建出鲤鱼脑结构及脑电极的三维立体模型。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
68025 数显式脑立体定位仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；F013020058 FZ-10 华瑞电动磨具（上海豪海设备有限公司）；生理药理电子刺激仪（北京众实迪创科技发展有限公司）；自制钨电极；自制无线遥控系统；3.0 T 磁共振成像仪（德国 SIEMENS TRIO）；丁香酚水门汀（上海荣祥齿科材料有限公司）；3D-DOCTOR 软件（美国 Able Software Corp）；Mimics 20.0 软件（比利时 Materialise 公司）。
1.2 鲤鱼机器人离水电刺激实验
1.2.1 实验动物
30 尾成年鲤鱼，体重（1.16 ± 0.12）kg，购于秦皇岛市兴龙广缘超市。
1.2.2 鲤鱼麻醉
配置丁香酚麻醉剂，将鲤鱼放入麻醉剂溶液中进行药浴麻醉。
1.2.3 实验方法
将实验鲤鱼（n = 30）按照小脑的左侧区、右侧区、中间区随机等分，每个脑区实验用鱼 10 尾，每个脑区实验重复 3 次，则每个脑区实验次数合计为 30 次。应用开颅法，使用电动磨具开颅，充分暴露小脑。将鲤鱼固定在脑立体定位仪上，借助脑立体定位仪将自制钨电极植入在小脑中（见图 1），测量脑电极的 X、Y、Z 三维坐标值范围。将电子刺激仪的输出端正极连接刺激电极，输出端负极连接参考电极，进行浅麻醉状态下的鲤鱼离水电刺激实验，观察电刺激小脑不同脑区过程中鲤鱼出现的动作。电刺激参数：刺激方式为连续波输出，正负脉冲，引起鲤鱼兴奋所需电压阈值为 5 V，电压范围为 5～15 V，刺激时间为 10～20 s，每一个位点重复刺激 3 次，每两次重复刺激的间隔时间为 30 s。
图1
借助脑立体定位仪植入脑电极
Figure1.
Implantation of brain electrodes with brain stereotaxic instrument
1.3 鲤鱼机器人水下控制实验
1.3.1 实验动物
30 尾成年鲤鱼，体重（1.18 ± 0.12）kg，购于秦皇岛市兴龙广缘超市。
1.3.2 实验方法
将实验鲤鱼（n = 30）按照小脑的左侧区、右侧区、中间区随机等分，每个脑区实验用鱼 10 尾，每个脑区实验重复 3 次，则每个脑区实验次数合计为 30 次。应用不开颅法，按照离水电刺激实验获得的脑电极刺激位点 X、Y、Z 坐标值，应用脑立体定位仪将自制钨电极植入在小脑中，再应用本团队发明的一种颅腔防水封固方法（CN107789088A）[5]处理。置鲤鱼机器人于水池中，应用自制无线遥控系统[6]，观察电刺激小脑不同脑区过程中鲤鱼机器人的水中动作。电刺激参数：刺激方式为连续波输出，正负脉冲，刺激频率 0～20 Hz，波宽 0～30 ms，电压强度 0～10 V，刺激时间 0～255 s。
1.4 鲤鱼脑组织磁共振扫描成像
将进行水下控制实验后的鲤鱼保留脑电极，对其进行药浴麻醉，再应用 3.0 T 磁共振成像仪对植入脑电极的鲤鱼颅脑进行轴状位扫描，主要扫描参数见表 1。
表1
鲤鱼颅脑轴状位的 MRI 扫描参数
Table1.
The MRI scanning parameters for the axial position of carp brain
为了更好地再现鲤鱼整体脑组织的解剖形态及特征，应用 3.0 T 磁共振成像仪对鲤鱼颅脑的轴状位、冠状位、矢状位三个方向进行扫描，主要扫描参数见表 2。
表2
鲤鱼颅脑的磁共振扫描参数
Table2.
The MRI scanning parameters of carp brain
1.5 植入脑电极的鲤鱼脑组织三维重建
将鲤鱼颅脑 MRI 轴状位的全部磁共振图像导入 3D-DOCTOR 软件中，对鲤鱼脑组织及脑电极的磁共振图像进行表面重建。为同时观察到三根脑电极在鲤鱼脑组织中的植入针道和植入位点，本文只显示鲤鱼小脑的部分结构。
1.6 鲤鱼脑组织的三维重建
将鲤鱼脑组织的轴状位、冠状位、矢状位三个方向的磁共振图像导入 Mimics 软件中。通过手动勾勒感兴趣区域和调节阈值进行轴状位、冠状位、矢状位的鲤鱼脑组织显影，再对选中的感兴趣区域进行三维重建，编辑 3D 模型，进行鲤鱼整体脑组织的模型提取，实现鲤鱼脑组织结构的识别。将三维重建后的鲤鱼脑组织与三个方向的 MRI 图像进行综合显示，根据三个方向的脑组织成像中的焦点位置则可对应出重建后脑组织的实际位置，也可在脑组织重建后的任意部位显示其三个不同方向的具体位点。
2 结果
2.1 鲤鱼机器人离水电刺激实验
通过在浅麻醉状态下的离水电刺激实验鲤鱼（n = 30）小脑的左侧区、右侧区、中间区，诱发鲤鱼出现左侧单向摆尾、右侧单向摆尾、双侧摆尾的动作，发现了控制摆尾运动的小脑脑运动区并测量出脑运动区的 X、Y、Z 三维坐标值范围（见表 3）。
表3
鲤鱼脑运动区三维坐标值范围（n = 30）
Table3.
The three-dimensional coordinate values range of carp brain motor areas (n = 30)
2.2 鲤鱼机器人水下控制实验
参照离水电刺激实验数据，在实验鲤鱼（n = 30）小脑运动区植入电极，并在鲤鱼清醒状态下给予电刺激。实验结果如表 4 所示，应用无线遥控系统电刺激实验鲤鱼小脑的左侧区、右侧区、中间区三个脑区，鲤鱼机器人水下控制实验的成功率均超过 76%。实验表明：电刺激小脑左侧区，鲤鱼出现左转运动；电刺激小脑右侧区，鲤鱼出现右转运动；电刺激小脑中间区，鲤鱼出现前进运动。
表4
鲤鱼机器人水下控制实验成功率（n = 30）
Table4.
The success rates of underwater control test of carp robots (n = 30)
2.3 鲤鱼脑组织磁共振扫描成像
应用 3.0 T 磁共振成像仪对植入钨电极的鲤鱼颅脑进行轴状位扫描成像（见图 2）。
图2
植入脑电极的鲤鱼颅脑 MRI
a. 出现左转向的脑电极针孔；b. 出现前进的脑电极针孔；c. 出现右转向的脑电极针孔
Figure2. MRI of carp brain after the implantation of brain electrodesa. brain electrode pinhole of left turning; b. brain electrode pinhole of forward; c. brain electrode pinhole of right turning
2.4 植入脑电极的鲤鱼脑组织三维重建
利用 3D-DOCTOR 软件对植入脑电极的鲤鱼脑组织进行三维重建，对鲤鱼各部分脑组织进行识别，可观察到三根脑电极在鲤鱼小脑中的植入方向和植入位点，将鲤鱼小脑的一半结构不做处理，只对部分脑组织进行三维重建，三维重建效果见图 3。
图3
植入脑电极的鲤鱼脑组织三维重建图
a. 出现左转向的脑电极；b. 出现前进的脑电极；c. 出现右转向的脑电极
Figure3. The chart of three-dimensional reconstruction on carp brain tissue with implanted brain electrodesa. brain electrode of left turning; b. brain electrode of forward; c. brain electrode of right turning
2.5 鲤鱼脑组织的三维重建
利用 Mimics 软件通过手动勾勒感兴趣区域和调节阈值进行轴状位、冠状位、矢状位的鲤鱼脑组织显影（见图 4），再对选中的感兴趣区域进行三维重建，编辑 3D 模型，三维重建后的鲤鱼脑组织整体结构显示出嗅球、嗅茎、端脑、中脑、小脑、迷叶、延脑等组织结构（见图 5）。
图4
鲤鱼脑组织阈值提取
Figure4.
Threshold extraction of carp brain tissue
图5
鲤鱼脑组织的三维重建图
Figure5.
The chart of three-dimensional reconstruction on carp brain tissue
将鲤鱼脑组织轴状位、冠状位、矢状位的三个 MRI 图像与三维重建后的脑组织模型进行融合（见图 6），融合后的图像能够直观观察到三维重建后的脑组织在 MRI 图像中的解剖位置和形态，也能够直观观察到脑组织与颅骨表面的相对位置关系。
图6
鲤鱼脑组织三维重建综合显示图
Figure6.
The comprehensive display of three-dimensional reconstruction on carp brain tissue
3 讨论
生物机器人是当今世界多学科交叉融合的一个崭新的前沿科技领域，国内外已进行了相关研究，如蟑螂机器人[7]、大鼠机器人[8]、猴子机器人[9]、蜻蜓机器人[10]、大壁虎机器人[11]、蜜蜂机器人[12]、鸽子机器人[13]、肠道生物机器人[14]、家兔机器人[15]和鲤鱼机器人[16]等，这些都是通过对动物脑运动区或其他运动神经植入电极施以电刺激来控制其运动[17]。
脑运动区的发现与定位对人类认识和理解动物脑组织的行为控制机制起着关键作用，是控制动物机器人运动行为的重要前提和工作基础。本研究进行了离水电刺激实验和水下控制实验，通过离水电刺激实验发现控制鲤鱼出现运动行为的小脑脑运动区并测定出其三维立体坐标值范围（见表 3）；水下控制实验结果如表 4 所示，鲤鱼小脑的左侧区、右侧区、中间区的三个脑区实验成功率均超过 76%，表明鲤鱼机器人的左右转向及前进运动是可以通过电刺激小脑运动区实现的。通过水下控制实验，我们也对离水电刺激实验结果进行了验证，并由此推断：控制鲤鱼出现左侧单向摆尾的小脑左侧区为控制左转运动的脑运动区，控制鲤鱼出现右侧单向摆尾的小脑右侧区为控制右转运动的脑运动区，控制鲤鱼出现双侧摆尾的小脑中间区为控制前进运动的脑运动区。通过水下控制实验与离水电刺激实验的相互印证，我们认为本研究发现的鲤鱼小脑脑运动区是可信的，且测量的脑运动区三维立体坐标值也是准确的。
本团队在前期研究中应用常规石蜡组织切片与苏木精—伊红染色方法观察脑电极的电极针道与植入位点，由于鲤鱼脑组织体积较小，电极又较细，且脑细胞会随着时间的推移而发生细胞自溶，因而电极针道与植入位点会逐渐消失，故应用常规石蜡组织切片与苏木精—伊红染色方法不容易观察到脑电极的植入针道与植入位点。对此，本研究提出应用 MRI 技术来解决这个问题，选用钨丝为脑电极材料，由于钨材料不影响磁共振的扫描成像，因此可以将钨电极保留在脑组织中，并可直接将植入钨电极后的鲤鱼进行磁共振扫描，从磁共振图像中就可观察到电极针道与植入位点（见图 2），避免了脑电极针道与植入位点消失的问题。
三维重建技术是把一系列断层二维图像导入计算机中进行处理，利用计算机图像处理功能及图形生成理论，在二维平面上显示出目标物体的三维模型，从而还原目标物体三维立体结构的一种技术，已经得到越来越广泛的应用。例如，在科学研究领域，通过对豚鼠颞骨的三维重建，测量其听骨链、耳蜗及半规管等结构，为进一步研究豚鼠耳科学动物模型提供了三维解剖学参考[18]；在医学领域，建立人丘脑的可视化三维模型，为大脑立体定向手术提供了解剖学基础[19]。利用二维图像重建三维结构并展示三维特征以及空间的相对位置关系，在各领域研究中均起到了重要作用。
由于二维的磁共振图像不能观察到脑组织的三维立体结构与形态特征，因此本研究利用 3D-DOCTOR 软件和 Mimics 软件实现鲤鱼脑组织及植入脑电极的三维重建。图 3 是植入脑电极的鲤鱼脑组织三维重建图，能够显示电极植入方向和植入位点，能够观察到脑电极与脑组织的相对空间位置关系。利用 Mimics 软件通过手动勾勒感兴趣区域和调节阈值，进行了轴状位、冠状位、矢状位的鲤鱼脑组织显影（见图 4）。在此基础上，进行脑组织的三维重建，图 5 是鲤鱼脑组织的三维重建图，构建出了嗅球、嗅茎、端脑、中脑、小脑、迷叶、延脑等结构，其中嗅茎连接于端脑，直达鼻部嗅囊，嗅茎末端各有一椭圆形的嗅球；端脑位于脑的最前部，含有嗅觉中枢；中脑较大，是视觉中枢所在区域；小脑是运动的主要协调中枢；迷叶在小脑后侧面；此后是延脑。本文鲤鱼脑组织三维重建图与秉志[20]在《鲤鱼解剖》专著中所述的脑结构基本一致，表明本文鲤鱼脑组织三维重建图不仅是成功的也是可信的。
如图 6 所示，本研究将鲤鱼脑组织轴状位、冠状位、矢状位三个方向的二维磁共振图像与重建后的三维脑组织立体模型进行融合，构建出鲤鱼脑组织三维重建综合显示图。通过比对，可以看出三维重建脑组织立体模型的外轮廓与二维脑组织磁共振图像的外轮廓相契合，无论是轴状位、冠状位还是矢状位都能够吻合，三维重建后的鲤鱼脑组织结构、形状和大小均不失真。通过三维重建综合显示图，可以直观观察到三维重建的脑组织在磁共振图像中的解剖位置和形状，有利于观察脑组织与颅骨表面的相对空间位置关系。脑结构及脑电极三维立体模型的构建，可为脑电极的精准植入提供定位与导航的依据和工具，对提升动物机器人控制的精确性和有效性具有重要的研究价值和意义。
4 结论
本研究将钨电极植入鲤鱼小脑的左侧区、右侧区、中间区，通过离水电刺激实验和水下控制实验两种方法发现了鲤鱼小脑运动区并获取其三维立体坐标值范围；应用 3.0 T 磁共振成像仪对脑组织及脑电极同时进行扫描成像；利用 3D-DOCTOR 和 Mimics 软件实现了鲤鱼脑组织及脑电极的三维可视化，观察到脑电极与脑组织的相对空间位置关系以及脑结构，再现脑组织的三维立体结构及特征。构建的脑组织及脑电极三维重建图，有助于掌握脑结构以及脑组织与脑电极的相对位置关系，为脑电极精准植入提供形态学基础；构建的脑组织三维重建综合显示图，有助于观察三维重建的脑组织在 MRI 图像中解剖位置以及脑组织与颅骨表面的相对空间位置关系。经三维重建的脑立体模型既能够为研究脑运动区提供形态学基础，又能够为脑电极植入提供定位与导航的工具。鲤鱼脑结构及脑电极三维立体模型的构建，将有助于提升鲤鱼水生动物机器人控制的精准度和有效性。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
引言
生物机器人是人类通过控制技术施加干预信号调控生物行为从而实现人类操控的生物[1]，可应用于环境监测、生态研究、地貌勘探、灾难搜救和反恐侦查等方面，是具有潜在广泛应用前景的重要领域。对于动物机器人的研究工作，目前多集中于对其脑运动区及脑控神经机制的探索，实现对脑的控制是最本质的控制，这样才有可能使动物机器人按照人类的意愿去行动[2]。目前国际上对各种动物机器人的控制主要是应用控脑技术，通过植入在脑运动区的脑电极施加模拟电刺激信号来控制动物的运动，因此，脑电极能否准确植入脑运动区是一个关键问题，也是生物控制领域的一个重要课题。在鲤鱼水生动物机器人控制中也需植入脑电极，为有助于解决这个问题，本研究应用磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和三维重建技术建立鲤鱼脑结构及脑电极的三维立体模型，该模型可为脑电极的精准植入直观显示脑电极的植入方向和植入位点，可为脑电极的精准植入提供定位与导航。
MRI 是利用射频脉冲激发处于磁场中的原子核（如氢核），再利用原子核退激弛豫时释放的能量成像[3]。基于 MRI 的优势和特点，MRI 技术在临床医学和科研方面的应用越来越成为无法替代的技术手段，迅速扩大了多学科领域的发展空间，也为生物脑的研究提供了一种更为精准且可靠的技术支持。
三维医学图像的重建与可视化技术是利用人类的视觉特性对图像进行研究处理的一种技术[4]，是在二维平面上展示物体的三维形态，可以对该物体的三维立体形态进行还原，用于观察组织结构的内部信息，在结构成像和功能成像融合中起着重要的作用。由于目前利用磁共振成像仪扫描得到的图像是二维图像，对于结构复杂的组织器官来说，并不能完整地显示出其立体结构信息，无法直观了解组织器官与周围结构的相对空间位置关系，不能提供直观的立体印象。而三维重建技术可以解决这些问题，在结构和功能成像融合中发挥作用，尤其是从 MRI 图像入手来重建三维模型更是得到了广泛应用。
在鲤鱼机器人控制中需植入脑电极，通过脑电极对脑运动区进行电刺激实现对鲤鱼机器人水下运动的控制。由于植入式电极比较细，一般成像手段不易观察到电极针道和植入位点，难以直观确定鲤鱼脑组织与脑电极的相对空间位置关系，而且由于鲤鱼脑组织较小，也不易观察到脑组织结构及形态。为此，本研究借助脑立体定位仪将钨电极植入鲤鱼小脑脑运动区，通过离水电刺激实验和水下控制实验两种方法来发现脑运动区并获取其三维坐标值，应用 3.0 T 磁共振成像仪对脑组织及脑电极同时扫描成像，再利用 3D-DOCTOR 软件和 Mimics 软件实现脑组织及植入脑电极的三维可视化，构建出鲤鱼脑结构及脑电极的三维立体模型。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
68025 数显式脑立体定位仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；F013020058 FZ-10 华瑞电动磨具（上海豪海设备有限公司）；生理药理电子刺激仪（北京众实迪创科技发展有限公司）；自制钨电极；自制无线遥控系统；3.0 T 磁共振成像仪（德国 SIEMENS TRIO）；丁香酚水门汀（上海荣祥齿科材料有限公司）；3D-DOCTOR 软件（美国 Able Software Corp）；Mimics 20.0 软件（比利时 Materialise 公司）。
1.2 鲤鱼机器人离水电刺激实验
1.2.1 实验动物
30 尾成年鲤鱼，体重（1.16 ± 0.12）kg，购于秦皇岛市兴龙广缘超市。
1.2.2 鲤鱼麻醉
配置丁香酚麻醉剂，将鲤鱼放入麻醉剂溶液中进行药浴麻醉。
1.2.3 实验方法
将实验鲤鱼（n = 30）按照小脑的左侧区、右侧区、中间区随机等分，每个脑区实验用鱼 10 尾，每个脑区实验重复 3 次，则每个脑区实验次数合计为 30 次。应用开颅法，使用电动磨具开颅，充分暴露小脑。将鲤鱼固定在脑立体定位仪上，借助脑立体定位仪将自制钨电极植入在小脑中（见图 1），测量脑电极的 X、Y、Z 三维坐标值范围。将电子刺激仪的输出端正极连接刺激电极，输出端负极连接参考电极，进行浅麻醉状态下的鲤鱼离水电刺激实验，观察电刺激小脑不同脑区过程中鲤鱼出现的动作。电刺激参数：刺激方式为连续波输出，正负脉冲，引起鲤鱼兴奋所需电压阈值为 5 V，电压范围为 5～15 V，刺激时间为 10～20 s，每一个位点重复刺激 3 次，每两次重复刺激的间隔时间为 30 s。
图1
借助脑立体定位仪植入脑电极
Figure1.
Implantation of brain electrodes with brain stereotaxic instrument
1.3 鲤鱼机器人水下控制实验
1.3.1 实验动物
30 尾成年鲤鱼，体重（1.18 ± 0.12）kg，购于秦皇岛市兴龙广缘超市。
1.3.2 实验方法
将实验鲤鱼（n = 30）按照小脑的左侧区、右侧区、中间区随机等分，每个脑区实验用鱼 10 尾，每个脑区实验重复 3 次，则每个脑区实验次数合计为 30 次。应用不开颅法，按照离水电刺激实验获得的脑电极刺激位点 X、Y、Z 坐标值，应用脑立体定位仪将自制钨电极植入在小脑中，再应用本团队发明的一种颅腔防水封固方法（CN107789088A）[5]处理。置鲤鱼机器人于水池中，应用自制无线遥控系统[6]，观察电刺激小脑不同脑区过程中鲤鱼机器人的水中动作。电刺激参数：刺激方式为连续波输出，正负脉冲，刺激频率 0～20 Hz，波宽 0～30 ms，电压强度 0～10 V，刺激时间 0～255 s。
1.4 鲤鱼脑组织磁共振扫描成像
将进行水下控制实验后的鲤鱼保留脑电极，对其进行药浴麻醉，再应用 3.0 T 磁共振成像仪对植入脑电极的鲤鱼颅脑进行轴状位扫描，主要扫描参数见表 1。
表1
鲤鱼颅脑轴状位的 MRI 扫描参数
Table1.
The MRI scanning parameters for the axial position of carp brain
为了更好地再现鲤鱼整体脑组织的解剖形态及特征，应用 3.0 T 磁共振成像仪对鲤鱼颅脑的轴状位、冠状位、矢状位三个方向进行扫描，主要扫描参数见表 2。
表2
鲤鱼颅脑的磁共振扫描参数
Table2.
The MRI scanning parameters of carp brain
1.5 植入脑电极的鲤鱼脑组织三维重建
将鲤鱼颅脑 MRI 轴状位的全部磁共振图像导入 3D-DOCTOR 软件中，对鲤鱼脑组织及脑电极的磁共振图像进行表面重建。为同时观察到三根脑电极在鲤鱼脑组织中的植入针道和植入位点，本文只显示鲤鱼小脑的部分结构。
1.6 鲤鱼脑组织的三维重建
将鲤鱼脑组织的轴状位、冠状位、矢状位三个方向的磁共振图像导入 Mimics 软件中。通过手动勾勒感兴趣区域和调节阈值进行轴状位、冠状位、矢状位的鲤鱼脑组织显影，再对选中的感兴趣区域进行三维重建，编辑 3D 模型，进行鲤鱼整体脑组织的模型提取，实现鲤鱼脑组织结构的识别。将三维重建后的鲤鱼脑组织与三个方向的 MRI 图像进行综合显示，根据三个方向的脑组织成像中的焦点位置则可对应出重建后脑组织的实际位置，也可在脑组织重建后的任意部位显示其三个不同方向的具体位点。
2 结果
2.1 鲤鱼机器人离水电刺激实验
通过在浅麻醉状态下的离水电刺激实验鲤鱼（n = 30）小脑的左侧区、右侧区、中间区，诱发鲤鱼出现左侧单向摆尾、右侧单向摆尾、双侧摆尾的动作，发现了控制摆尾运动的小脑脑运动区并测量出脑运动区的 X、Y、Z 三维坐标值范围（见表 3）。
表3
鲤鱼脑运动区三维坐标值范围（n = 30）
Table3.
The three-dimensional coordinate values range of carp brain motor areas (n = 30)
2.2 鲤鱼机器人水下控制实验
参照离水电刺激实验数据，在实验鲤鱼（n = 30）小脑运动区植入电极，并在鲤鱼清醒状态下给予电刺激。实验结果如表 4 所示，应用无线遥控系统电刺激实验鲤鱼小脑的左侧区、右侧区、中间区三个脑区，鲤鱼机器人水下控制实验的成功率均超过 76%。实验表明：电刺激小脑左侧区，鲤鱼出现左转运动；电刺激小脑右侧区，鲤鱼出现右转运动；电刺激小脑中间区，鲤鱼出现前进运动。
表4
鲤鱼机器人水下控制实验成功率（n = 30）
Table4.
The success rates of underwater control test of carp robots (n = 30)
2.3 鲤鱼脑组织磁共振扫描成像
应用 3.0 T 磁共振成像仪对植入钨电极的鲤鱼颅脑进行轴状位扫描成像（见图 2）。
图2
植入脑电极的鲤鱼颅脑 MRI
a. 出现左转向的脑电极针孔；b. 出现前进的脑电极针孔；c. 出现右转向的脑电极针孔
Figure2. MRI of carp brain after the implantation of brain electrodesa. brain electrode pinhole of left turning; b. brain electrode pinhole of forward; c. brain electrode pinhole of right turning
2.4 植入脑电极的鲤鱼脑组织三维重建
利用 3D-DOCTOR 软件对植入脑电极的鲤鱼脑组织进行三维重建，对鲤鱼各部分脑组织进行识别，可观察到三根脑电极在鲤鱼小脑中的植入方向和植入位点，将鲤鱼小脑的一半结构不做处理，只对部分脑组织进行三维重建，三维重建效果见图 3。
图3
植入脑电极的鲤鱼脑组织三维重建图
a. 出现左转向的脑电极；b. 出现前进的脑电极；c. 出现右转向的脑电极
Figure3. The chart of three-dimensional reconstruction on carp brain tissue with implanted brain electrodesa. brain electrode of left turning; b. brain electrode of forward; c. brain electrode of right turning
2.5 鲤鱼脑组织的三维重建
利用 Mimics 软件通过手动勾勒感兴趣区域和调节阈值进行轴状位、冠状位、矢状位的鲤鱼脑组织显影（见图 4），再对选中的感兴趣区域进行三维重建，编辑 3D 模型，三维重建后的鲤鱼脑组织整体结构显示出嗅球、嗅茎、端脑、中脑、小脑、迷叶、延脑等组织结构（见图 5）。
图4
鲤鱼脑组织阈值提取
Figure4.
Threshold extraction of carp brain tissue
图5
鲤鱼脑组织的三维重建图
Figure5.
The chart of three-dimensional reconstruction on carp brain tissue
将鲤鱼脑组织轴状位、冠状位、矢状位的三个 MRI 图像与三维重建后的脑组织模型进行融合（见图 6），融合后的图像能够直观观察到三维重建后的脑组织在 MRI 图像中的解剖位置和形态，也能够直观观察到脑组织与颅骨表面的相对位置关系。
图6
鲤鱼脑组织三维重建综合显示图
Figure6.
The comprehensive display of three-dimensional reconstruction on carp brain tissue
3 讨论
生物机器人是当今世界多学科交叉融合的一个崭新的前沿科技领域，国内外已进行了相关研究，如蟑螂机器人[7]、大鼠机器人[8]、猴子机器人[9]、蜻蜓机器人[10]、大壁虎机器人[11]、蜜蜂机器人[12]、鸽子机器人[13]、肠道生物机器人[14]、家兔机器人[15]和鲤鱼机器人[16]等，这些都是通过对动物脑运动区或其他运动神经植入电极施以电刺激来控制其运动[17]。
脑运动区的发现与定位对人类认识和理解动物脑组织的行为控制机制起着关键作用，是控制动物机器人运动行为的重要前提和工作基础。本研究进行了离水电刺激实验和水下控制实验，通过离水电刺激实验发现控制鲤鱼出现运动行为的小脑脑运动区并测定出其三维立体坐标值范围（见表 3）；水下控制实验结果如表 4 所示，鲤鱼小脑的左侧区、右侧区、中间区的三个脑区实验成功率均超过 76%，表明鲤鱼机器人的左右转向及前进运动是可以通过电刺激小脑运动区实现的。通过水下控制实验，我们也对离水电刺激实验结果进行了验证，并由此推断：控制鲤鱼出现左侧单向摆尾的小脑左侧区为控制左转运动的脑运动区，控制鲤鱼出现右侧单向摆尾的小脑右侧区为控制右转运动的脑运动区，控制鲤鱼出现双侧摆尾的小脑中间区为控制前进运动的脑运动区。通过水下控制实验与离水电刺激实验的相互印证，我们认为本研究发现的鲤鱼小脑脑运动区是可信的，且测量的脑运动区三维立体坐标值也是准确的。
本团队在前期研究中应用常规石蜡组织切片与苏木精—伊红染色方法观察脑电极的电极针道与植入位点，由于鲤鱼脑组织体积较小，电极又较细，且脑细胞会随着时间的推移而发生细胞自溶，因而电极针道与植入位点会逐渐消失，故应用常规石蜡组织切片与苏木精—伊红染色方法不容易观察到脑电极的植入针道与植入位点。对此，本研究提出应用 MRI 技术来解决这个问题，选用钨丝为脑电极材料，由于钨材料不影响磁共振的扫描成像，因此可以将钨电极保留在脑组织中，并可直接将植入钨电极后的鲤鱼进行磁共振扫描，从磁共振图像中就可观察到电极针道与植入位点（见图 2），避免了脑电极针道与植入位点消失的问题。
三维重建技术是把一系列断层二维图像导入计算机中进行处理，利用计算机图像处理功能及图形生成理论，在二维平面上显示出目标物体的三维模型，从而还原目标物体三维立体结构的一种技术，已经得到越来越广泛的应用。例如，在科学研究领域，通过对豚鼠颞骨的三维重建，测量其听骨链、耳蜗及半规管等结构，为进一步研究豚鼠耳科学动物模型提供了三维解剖学参考[18]；在医学领域，建立人丘脑的可视化三维模型，为大脑立体定向手术提供了解剖学基础[19]。利用二维图像重建三维结构并展示三维特征以及空间的相对位置关系，在各领域研究中均起到了重要作用。
由于二维的磁共振图像不能观察到脑组织的三维立体结构与形态特征，因此本研究利用 3D-DOCTOR 软件和 Mimics 软件实现鲤鱼脑组织及植入脑电极的三维重建。图 3 是植入脑电极的鲤鱼脑组织三维重建图，能够显示电极植入方向和植入位点，能够观察到脑电极与脑组织的相对空间位置关系。利用 Mimics 软件通过手动勾勒感兴趣区域和调节阈值，进行了轴状位、冠状位、矢状位的鲤鱼脑组织显影（见图 4）。在此基础上，进行脑组织的三维重建，图 5 是鲤鱼脑组织的三维重建图，构建出了嗅球、嗅茎、端脑、中脑、小脑、迷叶、延脑等结构，其中嗅茎连接于端脑，直达鼻部嗅囊，嗅茎末端各有一椭圆形的嗅球；端脑位于脑的最前部，含有嗅觉中枢；中脑较大，是视觉中枢所在区域；小脑是运动的主要协调中枢；迷叶在小脑后侧面；此后是延脑。本文鲤鱼脑组织三维重建图与秉志[20]在《鲤鱼解剖》专著中所述的脑结构基本一致，表明本文鲤鱼脑组织三维重建图不仅是成功的也是可信的。
如图 6 所示，本研究将鲤鱼脑组织轴状位、冠状位、矢状位三个方向的二维磁共振图像与重建后的三维脑组织立体模型进行融合，构建出鲤鱼脑组织三维重建综合显示图。通过比对，可以看出三维重建脑组织立体模型的外轮廓与二维脑组织磁共振图像的外轮廓相契合，无论是轴状位、冠状位还是矢状位都能够吻合，三维重建后的鲤鱼脑组织结构、形状和大小均不失真。通过三维重建综合显示图，可以直观观察到三维重建的脑组织在磁共振图像中的解剖位置和形状，有利于观察脑组织与颅骨表面的相对空间位置关系。脑结构及脑电极三维立体模型的构建，可为脑电极的精准植入提供定位与导航的依据和工具，对提升动物机器人控制的精确性和有效性具有重要的研究价值和意义。
4 结论
本研究将钨电极植入鲤鱼小脑的左侧区、右侧区、中间区，通过离水电刺激实验和水下控制实验两种方法发现了鲤鱼小脑运动区并获取其三维立体坐标值范围；应用 3.0 T 磁共振成像仪对脑组织及脑电极同时进行扫描成像；利用 3D-DOCTOR 和 Mimics 软件实现了鲤鱼脑组织及脑电极的三维可视化，观察到脑电极与脑组织的相对空间位置关系以及脑结构，再现脑组织的三维立体结构及特征。构建的脑组织及脑电极三维重建图，有助于掌握脑结构以及脑组织与脑电极的相对位置关系，为脑电极精准植入提供形态学基础；构建的脑组织三维重建综合显示图，有助于观察三维重建的脑组织在 MRI 图像中解剖位置以及脑组织与颅骨表面的相对空间位置关系。经三维重建的脑立体模型既能够为研究脑运动区提供形态学基础，又能够为脑电极植入提供定位与导航的工具。鲤鱼脑结构及脑电极三维立体模型的构建，将有助于提升鲤鱼水生动物机器人控制的精准度和有效性。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
