在胚胎发育过程的研究中，胚胎各阶段的形态特征是评价其发育优劣的重要依据，用于指导胚胎体外培养体系的优化和改进。本文为胚胎长时程培养设计了一种基于“低倍搜寻、高倍观察”策略的在线监测系统。首先，针对胚胎在发育过程中体积不断增大的情况，本系统配置了4倍相差、10倍和20倍霍夫曼调制相衬三种光学模块，以满足不同视场的观察需求；通过光机系统匹配设计、误差控制和装调试验，保证了成像光学分辨率，并获得了胚胎的高对比度的浮雕立体成像效果；然后，通过低倍大视场进行识别定位，高倍小视场捕获细节，本系统实现了胚胎的在线跟踪监测；最后，开发并验证了一种基于图像轮廓面积和清晰度评价的胚胎识别定位算法。本文开发的体外胚胎培养在线监测系统能在不影响胚胎发育的前提下，跟踪记录发育过程的形态特征，为胚胎发育评估和体外培养体系的优化提供依据。
引用本文： 曾维俊, 赵振英, 杨语谌, 周旻超, 王弼陡, 孙海旋. 胚胎长时程培养在线监测系统设计与试验. 生物医学工程学杂志, 2021, 38(6): 1134-1143. doi: 10.7507/1001-5515.202107053 复制
引言
随着2021年我国三胎政策的全面开放，预防和治疗新生儿的出生缺陷已成为生殖生物学领域重要的科研方向。但目前，对人类胚胎正常发育的生理学过程，尚有很多未解之谜。所以，对人类胚胎发育过程的研究，不仅有助于人们对生命起源和胚胎发育的进一步了解，更为解决出生缺陷等重大生殖健康问题提供了理论基础[1]。
国际伦理标准规定，人类胚胎的科学研究只能止步于受精后14天，而与出生缺陷相关的疾病，如无脑畸形、先天性心脏病等的发生，大多与以原肠运动为基础的三胚层分化异常密切相关，发生在受精14天之后[2]。因此科研人员只能借助于模式动物，如小鼠和猴子，探索胚胎更长时期的发育机制。目前，中国科学院动物研究所的科研人员已成功实现食蟹猴胚胎在体外长时程培养至受精后20天，并在此基础上研究了灵长类动物原肠运动的发生过程[3]。不过由于人员经验、实验技术和培养条件的限制，虽然在发育不同阶段鉴定了胚胎特征，但无法追踪到胚胎在整个发育过程中的动态变化，且胚胎体外培养不同批次之间稳定性和重复性差，发育至后期阶段的比例非常有限。因此急需开发一种新型全自动的胚胎培养设备，能对温湿度、气体组分、培养液成分、液流剪切力等参数进行在线调控，以实现更长时程的胚胎培养。同时，为追踪胚胎发育过程信息，培养设备需对胚胎发育全程进行在线监测，还原胚胎的形态变化，记录胚胎发育的关键事件。
胚胎早期（囊胚之前）的体外培养系统，目前主要采用微滴或微穴培养方式，胚胎从受精卵开始发育，经历原核期、卵裂期、桑椹胚和囊胚期，总体积变化不大，且胚胎处于静置状态，便于自动化显微成像和在线监测，基于微穴培养的观察方式已衍生多种临床应用的培养箱产品，如time-lapse培养箱，胚胎在培养期间不受外界干扰，由内置的光学模块对胚胎发育过程的形态进行延时拍摄，基于胚胎形态动力学参数评估其发育潜能，筛选出最优的胚胎[4-7]。然而，在体外长时程培养条件下，随时间推移，胚胎的发育体积变化巨大，以小鼠为例，其妊娠期为20天，受精后4.5天达到囊胚期，胚体大小约为0.1 mm，而到12.5天时胚体增长至约4.2 mm，增长约40倍[8]。因此采用微滴或微穴培养方式和单一光学观察方式显然已无法满足更长时程发育的培养和观测需求。另外受在线换液和液流剪切动作影响，胚胎在培养液中的位置会随液体流动在培养空间内改变，相应的光学系统成像视场中心和焦面位置也需要及时进行调整，极大地增加了在线自动观察的难度。
本文针对胚胎体外长时程培养过程中的形态观察需求，开发了一套在线培养监测装置和配套培养器皿，为胚胎不同发育阶段配置了不同放大倍数的光学观察模块，基于“低倍搜寻、高倍观察”的策略，采用多维运动机构对胚胎进行自动跟踪和捕捉，通过图像处理算法识别和定位胚胎在空间中的位置，最终拍摄得到清晰的胚胎图像。为了验证系统的可行性，本文以小鼠为试验对象，取小鼠受精后第3天的胚胎进行体外长时程培养，拍摄了胚胎从囊胚发育至原肠胚不同阶段的形态，验证了光学系统的成像质量；然后在装置内开展了胚胎的在线培养监测试验研究，将胚胎置于培养皿栅罩内的任意位置，系统按照设计的在线跟踪策略和图像处理算法对胚胎进行自动捕捉和成像，从而获得胚胎清晰图像。文中涉及的鼠胚动物试验得到了中国科学院苏州生物医学工程技术研究所实验动物伦理委员会的批准。
1 胚胎长时程培养装置方案
胚胎长时程培养装置作为体外生命孕育系统，用于模拟子宫内环境研究胚胎发育机制和不同因素对胚胎发育的影响，从而探索新型的胚胎体外培养体系。早期胚胎的体外培养和监测技术已较为成熟，而囊胚之后的培养目前只能依靠人工操作和经验技术，缺乏自动化设备，因此，长时程培养装置的开发目的，一方面研究优化培养参数，构建稳定的培养体系，做到高通量和高成活率培养，在此基础上探索更长时程的培养，另一方面通过在线监测记录胚胎发育的过程信息，动态评估胚胎发育优劣，为培养参数调控提供依据。
1.1 培养装置组成
胚胎长时程培养装置及配套培养器皿如图1所示，其中培养装置主要包括培养模块、液路模块、气路模块和光学模块。培养模块提供37 ℃恒温培养环境，由多个培养室组成，每个培养室内部可放置一个培养器皿，液路模块负责培养液的在线更换和液流剪切动作的实现，气路模块用于供应胚胎发育所必需的CO2混合气，光学模块负责培养期间对胚胎的在线监测。
图1
胚胎长时程培养装置及配套培养器皿
Figure1.
Long-term embryo culture device and matching culture utensils
胚胎培养器皿由栅罩和35 mm标准培养皿构成。栅罩贴于培养皿的底部，由两个长片和八个隔片拼接形成4个正方形的培养隔间，每个隔间内放置一枚胚胎，在培养隔间四周的相应区域开设栅孔，孔隙为0.1 mm左右，能允许培养液内外自由交换，同时阻挡胚胎逸出。培养隔间截面尺寸为4.5 mm × 4.5 mm，满足胚胎长时程培养的空间需求。培养隔间沿直线排列，与培养室排列方向一致，便于光学模块运动扫描和观察。
液路的进液针一分四对准每个培养隔间，换液时通过栅孔能将新鲜培养液灌注至培养隔间内，通过液路泵阀的控制可以实现进液针对培养液的吸吐动作，在培养隔间内部形成紊流，从而达到对胚胎的液流剪切效果。
1.2 在线监测方案
通过栅罩的空间约束，胚胎可以有效地约束在特定空间内，为光学观察提供了便利，但是由于换液和液流剪切动作的影响，胚胎在培养液中的位置会随液体流动在培养隔间内发生改变，极大地增加了在线自动观察的难度。
针对上述问题，本文提出了低倍搜寻、高倍观察的监测方案，如图2所示，首先低倍观察模式下，移动光学系统的视场中心至胚胎培养隔间的中央处，在低倍大视场物镜下拍摄培养隔间的完整图像，基于图像算法识别出胚胎的轮廓，并定位胚胎的中心坐标，计算其相对视场中心的偏离量，然后通过运动机构对光学系统进行位置补偿，将视场中心移动至胚胎中心处，再切换至高倍小视场物镜拍摄胚胎的细节。
图2
胚胎在线监测方案示意
Figure2.
Schematic diagram of online embryo monitoring
采用低倍搜寻、高倍观察的监测方案，可以应对不同发育阶段胚胎体积变化的情况，选用合适的光学系统进行观察或拍摄。欲实现理想的监测效果，需解决以下几个问题：
（1）光学系统匹配：为胚胎长时程培养匹配合适的光学系统，满足观察分辨率和立体感需求，记录胚胎发育过程的形态细节。
（2）光机运动模块设计：光学系统由低倍切换至高倍观察涉及到多自由度的机械运动，通过误差控制，既要保证光学成像分辨率，又要实现精确位置定位。
（3）胚胎在线跟踪策略：基于培养装置的系统控制架构，建立各个模块或部件的配合时序关系，实现对胚胎的自动化在线跟踪和拍摄。
（4）胚胎图像处理算法：图像处理算法用于识别胚胎轮廓并定位胚胎在培养隔间内的坐标，进而进行位置补偿并切换至高倍观察，是对胚胎进行跟踪和捕捉以实现长时程在线监测的核心。
2 光机系统设计与验证
胚胎细胞是透明的，在非荧光染色观察时利用光的干涉原理，将通过样品光线的相位差转换为人眼可以分辨的振幅差（即明暗），使样品便于观察，广泛运用的观察方式有相差、霍夫曼调制相衬和微分干涉相衬观察三种[9-12]。其中，相差系统简单经济，常用于活体细胞的鉴定和细胞计数，后两者可以使细胞产生较强的三维立体效果，对比度更高，观察更直观，尤其适合显微操作。
本文采用相差和霍夫曼调制相衬结合的方式对胚胎进行在线监测，低倍搜寻时采用相差成像，能分辨出胚胎的大致轮廓即可，高倍观察时采用霍夫曼调制相衬成像，能呈现对比度更高的胚胎内部形态细节。
2.1 光学系统匹配
胚胎在线监测的光学系统方案如图3所示，采用倒置显微镜结构，支持相差和霍夫曼调制相衬两种观察模式，照明光依次经过偏振片、光阑、聚光镜、胚胎样品、物镜、筒镜和合适的缩小镜后，在相机靶面上成像，通过切换物镜和相应的光阑，可以更改胚胎的观察方式为相差或霍夫曼调制相衬。
图3
光学系统方案
Figure3.
Optical system scheme
为适应胚胎发育不同阶段的观测需求，采用了3种不同放大倍数的物镜，分别为4 ×、10 × 和20 × 物镜，其中，4×为相差物镜，用于大视场成像和胚胎搜寻，后两者为霍夫曼调制相衬物镜，用于小视场胚胎细节的观察，光学系统元件选用奥林巴斯相关模块，其中关键的元件和参数配置如表1所示。
表1
光学系统主要元件及参数
Table1.
Main components and parameters of optical system
不同光谱成分对胚胎的发育影响不同，蓝紫光对胚胎发育损伤最大，绿光和红光几乎没有损伤[13-14]。本文胚胎培养装置的照明光选用对胚胎发育影响最小的红光，波长为635 nm，单色光可有效降低光学系统的色差影响。
根据光学元件相关参数可以由下式计算得到系统的光学分辨率[15]：
 |
式中，R为光学分辨率，λ为入射光波长，NA为物镜的数值孔径。
为了让被物镜分辨清楚的图像细节也被相机分辨清楚，相机理想像元尺寸需满足奈奎斯特采样定律[16]，由如下公式计算：
 |
式中，l为相机理想像元尺寸，R为光学分辨率，M为光学系统的综合放大倍率。
此外，在4×相差视场观察下，相机靶面要求能覆盖完整的单个培养隔间（4.5 mm × 4.5 mm）。
因此，光学系统的参数匹配要求如表2所示，最终选用相机为度申科技USB3.0大靶面相机，型号U3P2 100-H，分辨率5 480 × 3 648，像元大小3.45 μm，靶面尺寸18.9 mm × 12.6 mm。
表2
光学系统参数匹配表
Table2.
Parameter matching of optical system
2.2 光机运动模块设计
胚胎在线监测的光学系统采用倒置显微镜结构方案，如图4所示，所有光学元件安装在立柱上，呈C型结构，培养模块位于聚光镜和物镜模块之间，其中光阑和物镜均沿直线排布，可以通过相应的x向直线运动机构实现光阑和物镜的切换，使两者搭配进行观察。物镜模块搭载在调焦机构上，可沿z向作升降运动，调节物镜成像焦平面的高度，从而对样品不同层切面成像。
图4
光机运动模块实物图
Figure4.
Picture of optomechanical motion module
另外，采用低倍搜寻、高倍观察的监测方案，需根据胚胎偏离光学系统视场中心的坐标值对光学系统x和y方向的位置进行补偿，分别由平台x机构和平台y机构执行相应的动作，同时通过平台x机构可以将光学系统切换至不同培养室内的培养隔间进行观察。
所有直线运动单元采用步进电机+丝杆传动的方式，为保证机构的定位精度，步进电机配置了编码器，避免运动过程中的丢步现象，丝杆螺母通过消隙处理避免空回误差。
为保证光学系统的成像质量，立柱上了设置了x和y向定位基准，用以对安装在立柱上的光学元件的离轴误差进行控制，光学系统的综合离轴误差合成公式如下[17-18]：
 |
式中
为系统综合离轴误差，
和
为x和y向的离轴误差分量，其中以
为例，计算公式如下：
 |
式中
为第i个光学元件中心至x基准面的距离误差，主要由零件的尺寸加工误差引入，考虑到各光学元件的误差传递方式相同，装配尺寸相近，可以按等作用误差原则进行分配，计算公式如下：
 |
控制光学系统的综合离轴误差为0.05 mm，由于光阑和物镜x向是可移动的，通过运动机构精度保证，各光学元件中心至基准的误差分配结果详见表3，据此对相关结构件的尺寸误差进行约束。
表3
光学系统误差分配表（mm）
Table3.
Error distribution of optical system (mm)
2.3 系统装调与试验
为保证成像质量，达到设计分辨率要求和高对比度效果，光学系统装调最关键的环节便是满足相差光路环形光阑与物镜内置相位板的共轭关系，以及霍夫曼调制相衬光路矩形光阑与物镜内置调制板的共轭的关系，其装调示意图如图5所示。
图5
光学系统装调示意
Figure5.
Installation and adjustment of optical system
在相差观察视场内，照明光通过环形光阑呈现为明亮的圆环，而物镜后焦面内置相位板为灰暗的圆环，两者互相匹配，大小一致，需要通过x和y两个方向的平移，保证两者重合。
霍夫曼物镜后焦面内置调制板分为三个区域，依次是D区（透光率1%）、G区（透光率15%）和B区（透光率100%）。矩形光阑分两个区域，一是透射区（T区），另一个是亮度随偏振器而改变的偏振区（P区）。在霍夫曼观察视场内，调节x、y方向的平移和绕轴旋转，使矩形光阑的T区进入物镜调制板的G区，光阑的P区进入物镜调制板的B区。通过旋转位于光阑上部的偏振片的角度，可以改变图像对比度。
本研究对光学系统的成像质量进行了验证。利用Edmund USAF 1951分辨率测试目标板（空间频率最高645 lp/mm）对光学分辨率进行测试。取分辨率板成像图案中刚能分辨的某一单元线条，查找对应的空间频率的数值，由下式计算系统的光学分辨率。
 |
式中，R为光学分辨率（单位：μm），f为空间频率（单位：lp/mm）。
最终系统的光学分辨率测试结果如表4所示，考虑到光学系统不可避免存在像差，测量值与理论值接近，认为三种模式均达到了光学设计要求。
表4
光学分辨率测试结果
Table4.
Results of optical resolution test
2.4 胚胎成像试验
分辨率是表征光学成像系统解析物体细节的能力，而胚胎作为透明体，光线经过样品后产生的相位差转换成图像对比度的变化，所呈现出的直观立体效果可以通过实际胚胎成像进行观察和评价。胚胎从囊胚发育至原肠胚不同阶段的形态，在相差和霍夫曼观察模式下拍摄的图像如图6所示。
图6
胚胎拍摄图像
Figure6.
Images of embryos
从图6可见，低倍的相差成像系统能从背景中识别出胚胎大致轮廓，但内部细节无法看清，而霍夫曼调制相衬成像系统所呈现的胚胎图像具有更加明显的浮雕立体效果，且能清晰地表征出胚胎的形态细节。
3 胚胎跟踪和捕捉策略
培养装置光学模块的运动部件各自由度的执行器为步进电机，电机的运动控制模块通过控制器局域网络（controller area network，CAN）总线接口与上位机进行通讯，相机与上位机通过USB3.0进行通讯和数据传输，采用软件触发模式拍摄采集图像，所有电机运动和相机拍摄动作由上位机进行时序调度和控制。
在胚胎长时程培养过程中，采用低倍搜寻、高倍观察的在线监测方案，由光学模块的多自由度机构配合对胚胎进行跟踪和捕捉拍摄，基于图像处理算法定位胚胎的空间位置。
胚胎在线跟踪拍摄流程和原理详见图7，在所有机构零位状态下开始，首先将观察方式切换为4×相差模式，移动至要观察的胚胎，采用低倍系统进行粗调拍摄，记录得到多焦面图像数据，然后基于多焦面图像数据，通过图像识别和定位处理算法，获取胚胎在空间中的x、y和z的位置坐标，再由运动机构进行位置补偿，将光学视场中心移动至目标胚胎中心处，最后切换至高倍霍夫曼观察模式，对胚胎细节进行微调拍摄，记录胚胎细胞不同层切面的图像。
图7
胚胎在线跟踪拍摄流程和原理
Figure7.
Process and principle of embryo online tracking and capturing
上述在对某个胚胎进行在线跟踪拍摄期间，该培养室的液路暂停工作，包括换液操作和动态液流剪切动作，以确保拍摄期间内胚胎在培养隔间内的位置是固定的。
胚胎长时程培养过程中通过自动跟踪拍摄，实现在线监测的核心环节是胚胎的图像处理算法，基于低倍大视场光学系统拍摄的多焦面图像获取胚胎准确的空间位置坐标，进而转入高倍系统观察胚胎的细节形态。
4 胚胎图像处理与试验
胚胎在低倍视场下拍摄的图像随着物镜观察焦面高度位置的切换，样本会经历模糊—清晰—模糊的过程，需通过图像算法识别出胚胎最清晰的焦面图像，进而确定其在培养隔间中的x、y、z坐标。
目前广泛采用的清晰度识别方法基于图像边缘信息或图像的灰度梯度信息，认为对焦清晰的图像具有更尖锐的边缘，故具有更大的梯度函数值，主要包括绝对方差函数、Roberts梯度和函数、梯度向量平方函数、Brenner函数、Laplacian函数、Tenengrad函数和Variance函数等[19-20]。这些算法都是对全局图像进行清晰度评价，而胚胎在图像中占据面积一般很小，且往往出现背景清晰、胚胎模糊或背景模糊、胚胎清晰的现象，对评价结果的贡献量微弱，因此，无法直接基于清晰度识别来确定胚胎最为清晰的焦面。
为了实现胚胎低倍搜寻、高倍观察的在线监测效果，本文提出了另一种胚胎识别定位思路，并开展了图像算法的试验研究。首先对低倍视场拍摄的多焦面图像，进行去噪和灰度二值化预处理，然后基于轮廓查找和面积过滤算法，依此遍历各个焦面图像，确定出胚胎的质心坐标（x和y坐标），再以胚胎质心为中心对每张焦面图像截取胚胎所在的图像区域，最后对不同焦面截取的图像进行清晰度评价，找出最清晰的焦面，从而确定胚胎的z坐标。定位出胚胎的具体位置，便可以通过运动机构对光学系统的位置进行修正补偿，实现胚胎的对中和对焦，再切换至高倍模式观察胚胎的细节。胚胎识别定位的详细图像处理算法流程如图8所示。
图8
胚胎识别定位算法流程图
Figure8.
Flow chart of embryo identification and location algorithm
4.1 图像预处理
由于实验室操作环境的影响，制备胚胎时培养液内可能会混入杂质成分，并且随着胚胎发育的不断推进，胚胎周围也会逐渐滋生许多颗粒细胞，因此为避免杂质的干扰对胚胎轮廓提取的影响，需对图像进行去噪处理，保留重要的胚胎的轮廓信息，去除无用的杂质信息。
胚胎图像预处理效果如图9所示。图像取灰度化后，首先进行滤波处理和二值化阈值分割，选取阈值时，以保留胚胎图像部分的主要信息为准。滤波算法采用中值滤波，能消除和平滑图像中较小的椒盐噪声，而且能有效保护图像的边缘信息，不对后续的轮廓提取造成影响[21]。
图9
图像预处理效果
Figure9.
Effect of image preprocessing
对二值化图像通过膨胀及腐蚀算法进行处理能有效去除较大的杂质噪声[22]，膨胀运算后可以将胚胎培养隔间内的长条纹和小颗粒杂质完全滤除，虽然胚胎图像自身受膨胀运算也会出现收缩，但再进行腐蚀运算后，胚胎面积会恢复，同时原来离散的接近贴壁的干扰图像能与栅罩的内壁进一步联通，形成完整轮廓，为后续的轮廓提取和面积过滤做准备。
4.2 胚胎轮廓提取
预处理后的图像通过resize()函数缩放为800 × 600的分辨率，以左上角为图像的坐标原点，则视场中心的坐标为（400，300），图像总面积为480 000。
通过调用OpenCV函数库中的查找轮廓findContours()函数、轮廓面积contourArea()函数和图像矩moments()函数，提取出封闭区域的轮廓，并计算其面积和质心坐标。
轮廓提取结果如表5所示，找到4处轮廓，其中编号2即为胚胎的轮廓，与其他轮廓有明显的差别，经过简单的面积和质心过滤可以将其他过小过大或培养隔间之外的轮廓排除，便能定位出胚胎的坐标（443，218），其与视场中心（400，300）作差，可求得坐标的补偿量。
表5
轮廓提取结果
Table5.
Results of contour extraction
4.3 清晰度评价
以胚胎质心为中心，根据胚胎实际占据的面积，截取出不同焦平面图像中胚胎所在的图像区域，进行清晰度评价。本文选取了三种清晰度评价方法进行对比，分别是Tenengrad梯度方法、Laplacian梯度方法和方差方法。其中，Tenengrad梯度方法使用Sobel算子提取图像水平和垂直方向的梯度值，其清晰度评价函数 Ten 定义为如下公式[23-24]：
 |
式中，
，其中 
和 
分别是Sobel算子沿x向和y向的卷积核，
和 
分别为图像在点 
处的灰度值和灰度梯度值，
为图像总像素数。
Laplacian梯度方法和Tenengrad梯度方法原理相似，只是Laplacian算子是一种二阶导数算子，可以满足不同方向图像边缘锐化的要求。
方差方法认为清晰聚焦的图像有着比模糊图像更大的灰度差异，可以将方差函数F作为清晰度评价函数[25]：
 |
式中，
为整幅图像的平均灰度值，
为点 
处的灰度值，
为图像总像素数。
表6列出三种不同方法得出的清晰度评分结果，值越大表示图像越清晰，可以看出，不同评价方法的结论是一致的，均认为第3个焦面的胚胎最清晰，与肉眼判断的结果吻合。
表6
清晰度评分结果
Table6.
Results of definition evaluation
识别出最清晰的一层焦面，便可以定位胚胎在空间内z方向的坐标，进而通过位置补偿将光学系统移动至胚胎中心，切换至高倍观察模式对胚胎进行拍摄，获取胚胎清晰的形态图像。
5 结论
本文为胚胎体外长时程培养设计了一种在线监测系统，配置了4 × 相差、10 × 和20 × 霍夫曼调制相衬光学系统。实验证明，匹配的光学系统成像分辨率满足设计要求，并达到高对比度的浮雕立体效果。胚胎的在线监测系统采用“低倍搜寻、高倍观察”的跟踪和捕捉策略，并基于图像轮廓面积和清晰度评价对胚胎进行识别和定位，结果证明开发的图像处理算法具有较好的准确性和通用性。
本文开发的胚胎长时程培养在线监测系统可以准确捕捉胚胎发育过程中的形态信息，重现胚胎发育的动态过程，评价胚胎发育的优劣，为胚胎体外长时程培养体系的优化和迭代提供依据。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
引言
随着2021年我国三胎政策的全面开放，预防和治疗新生儿的出生缺陷已成为生殖生物学领域重要的科研方向。但目前，对人类胚胎正常发育的生理学过程，尚有很多未解之谜。所以，对人类胚胎发育过程的研究，不仅有助于人们对生命起源和胚胎发育的进一步了解，更为解决出生缺陷等重大生殖健康问题提供了理论基础[1]。
国际伦理标准规定，人类胚胎的科学研究只能止步于受精后14天，而与出生缺陷相关的疾病，如无脑畸形、先天性心脏病等的发生，大多与以原肠运动为基础的三胚层分化异常密切相关，发生在受精14天之后[2]。因此科研人员只能借助于模式动物，如小鼠和猴子，探索胚胎更长时期的发育机制。目前，中国科学院动物研究所的科研人员已成功实现食蟹猴胚胎在体外长时程培养至受精后20天，并在此基础上研究了灵长类动物原肠运动的发生过程[3]。不过由于人员经验、实验技术和培养条件的限制，虽然在发育不同阶段鉴定了胚胎特征，但无法追踪到胚胎在整个发育过程中的动态变化，且胚胎体外培养不同批次之间稳定性和重复性差，发育至后期阶段的比例非常有限。因此急需开发一种新型全自动的胚胎培养设备，能对温湿度、气体组分、培养液成分、液流剪切力等参数进行在线调控，以实现更长时程的胚胎培养。同时，为追踪胚胎发育过程信息，培养设备需对胚胎发育全程进行在线监测，还原胚胎的形态变化，记录胚胎发育的关键事件。
胚胎早期（囊胚之前）的体外培养系统，目前主要采用微滴或微穴培养方式，胚胎从受精卵开始发育，经历原核期、卵裂期、桑椹胚和囊胚期，总体积变化不大，且胚胎处于静置状态，便于自动化显微成像和在线监测，基于微穴培养的观察方式已衍生多种临床应用的培养箱产品，如time-lapse培养箱，胚胎在培养期间不受外界干扰，由内置的光学模块对胚胎发育过程的形态进行延时拍摄，基于胚胎形态动力学参数评估其发育潜能，筛选出最优的胚胎[4-7]。然而，在体外长时程培养条件下，随时间推移，胚胎的发育体积变化巨大，以小鼠为例，其妊娠期为20天，受精后4.5天达到囊胚期，胚体大小约为0.1 mm，而到12.5天时胚体增长至约4.2 mm，增长约40倍[8]。因此采用微滴或微穴培养方式和单一光学观察方式显然已无法满足更长时程发育的培养和观测需求。另外受在线换液和液流剪切动作影响，胚胎在培养液中的位置会随液体流动在培养空间内改变，相应的光学系统成像视场中心和焦面位置也需要及时进行调整，极大地增加了在线自动观察的难度。
本文针对胚胎体外长时程培养过程中的形态观察需求，开发了一套在线培养监测装置和配套培养器皿，为胚胎不同发育阶段配置了不同放大倍数的光学观察模块，基于“低倍搜寻、高倍观察”的策略，采用多维运动机构对胚胎进行自动跟踪和捕捉，通过图像处理算法识别和定位胚胎在空间中的位置，最终拍摄得到清晰的胚胎图像。为了验证系统的可行性，本文以小鼠为试验对象，取小鼠受精后第3天的胚胎进行体外长时程培养，拍摄了胚胎从囊胚发育至原肠胚不同阶段的形态，验证了光学系统的成像质量；然后在装置内开展了胚胎的在线培养监测试验研究，将胚胎置于培养皿栅罩内的任意位置，系统按照设计的在线跟踪策略和图像处理算法对胚胎进行自动捕捉和成像，从而获得胚胎清晰图像。文中涉及的鼠胚动物试验得到了中国科学院苏州生物医学工程技术研究所实验动物伦理委员会的批准。
1 胚胎长时程培养装置方案
胚胎长时程培养装置作为体外生命孕育系统，用于模拟子宫内环境研究胚胎发育机制和不同因素对胚胎发育的影响，从而探索新型的胚胎体外培养体系。早期胚胎的体外培养和监测技术已较为成熟，而囊胚之后的培养目前只能依靠人工操作和经验技术，缺乏自动化设备，因此，长时程培养装置的开发目的，一方面研究优化培养参数，构建稳定的培养体系，做到高通量和高成活率培养，在此基础上探索更长时程的培养，另一方面通过在线监测记录胚胎发育的过程信息，动态评估胚胎发育优劣，为培养参数调控提供依据。
1.1 培养装置组成
胚胎长时程培养装置及配套培养器皿如图1所示，其中培养装置主要包括培养模块、液路模块、气路模块和光学模块。培养模块提供37 ℃恒温培养环境，由多个培养室组成，每个培养室内部可放置一个培养器皿，液路模块负责培养液的在线更换和液流剪切动作的实现，气路模块用于供应胚胎发育所必需的CO2混合气，光学模块负责培养期间对胚胎的在线监测。
图1
胚胎长时程培养装置及配套培养器皿
Figure1.
Long-term embryo culture device and matching culture utensils
胚胎培养器皿由栅罩和35 mm标准培养皿构成。栅罩贴于培养皿的底部，由两个长片和八个隔片拼接形成4个正方形的培养隔间，每个隔间内放置一枚胚胎，在培养隔间四周的相应区域开设栅孔，孔隙为0.1 mm左右，能允许培养液内外自由交换，同时阻挡胚胎逸出。培养隔间截面尺寸为4.5 mm × 4.5 mm，满足胚胎长时程培养的空间需求。培养隔间沿直线排列，与培养室排列方向一致，便于光学模块运动扫描和观察。
液路的进液针一分四对准每个培养隔间，换液时通过栅孔能将新鲜培养液灌注至培养隔间内，通过液路泵阀的控制可以实现进液针对培养液的吸吐动作，在培养隔间内部形成紊流，从而达到对胚胎的液流剪切效果。
1.2 在线监测方案
通过栅罩的空间约束，胚胎可以有效地约束在特定空间内，为光学观察提供了便利，但是由于换液和液流剪切动作的影响，胚胎在培养液中的位置会随液体流动在培养隔间内发生改变，极大地增加了在线自动观察的难度。
针对上述问题，本文提出了低倍搜寻、高倍观察的监测方案，如图2所示，首先低倍观察模式下，移动光学系统的视场中心至胚胎培养隔间的中央处，在低倍大视场物镜下拍摄培养隔间的完整图像，基于图像算法识别出胚胎的轮廓，并定位胚胎的中心坐标，计算其相对视场中心的偏离量，然后通过运动机构对光学系统进行位置补偿，将视场中心移动至胚胎中心处，再切换至高倍小视场物镜拍摄胚胎的细节。
图2
胚胎在线监测方案示意
Figure2.
Schematic diagram of online embryo monitoring
采用低倍搜寻、高倍观察的监测方案，可以应对不同发育阶段胚胎体积变化的情况，选用合适的光学系统进行观察或拍摄。欲实现理想的监测效果，需解决以下几个问题：
（1）光学系统匹配：为胚胎长时程培养匹配合适的光学系统，满足观察分辨率和立体感需求，记录胚胎发育过程的形态细节。
（2）光机运动模块设计：光学系统由低倍切换至高倍观察涉及到多自由度的机械运动，通过误差控制，既要保证光学成像分辨率，又要实现精确位置定位。
（3）胚胎在线跟踪策略：基于培养装置的系统控制架构，建立各个模块或部件的配合时序关系，实现对胚胎的自动化在线跟踪和拍摄。
（4）胚胎图像处理算法：图像处理算法用于识别胚胎轮廓并定位胚胎在培养隔间内的坐标，进而进行位置补偿并切换至高倍观察，是对胚胎进行跟踪和捕捉以实现长时程在线监测的核心。
2 光机系统设计与验证
胚胎细胞是透明的，在非荧光染色观察时利用光的干涉原理，将通过样品光线的相位差转换为人眼可以分辨的振幅差（即明暗），使样品便于观察，广泛运用的观察方式有相差、霍夫曼调制相衬和微分干涉相衬观察三种[9-12]。其中，相差系统简单经济，常用于活体细胞的鉴定和细胞计数，后两者可以使细胞产生较强的三维立体效果，对比度更高，观察更直观，尤其适合显微操作。
本文采用相差和霍夫曼调制相衬结合的方式对胚胎进行在线监测，低倍搜寻时采用相差成像，能分辨出胚胎的大致轮廓即可，高倍观察时采用霍夫曼调制相衬成像，能呈现对比度更高的胚胎内部形态细节。
2.1 光学系统匹配
胚胎在线监测的光学系统方案如图3所示，采用倒置显微镜结构，支持相差和霍夫曼调制相衬两种观察模式，照明光依次经过偏振片、光阑、聚光镜、胚胎样品、物镜、筒镜和合适的缩小镜后，在相机靶面上成像，通过切换物镜和相应的光阑，可以更改胚胎的观察方式为相差或霍夫曼调制相衬。
图3
光学系统方案
Figure3.
Optical system scheme
为适应胚胎发育不同阶段的观测需求，采用了3种不同放大倍数的物镜，分别为4 ×、10 × 和20 × 物镜，其中，4×为相差物镜，用于大视场成像和胚胎搜寻，后两者为霍夫曼调制相衬物镜，用于小视场胚胎细节的观察，光学系统元件选用奥林巴斯相关模块，其中关键的元件和参数配置如表1所示。
表1
光学系统主要元件及参数
Table1.
Main components and parameters of optical system
不同光谱成分对胚胎的发育影响不同，蓝紫光对胚胎发育损伤最大，绿光和红光几乎没有损伤[13-14]。本文胚胎培养装置的照明光选用对胚胎发育影响最小的红光，波长为635 nm，单色光可有效降低光学系统的色差影响。
根据光学元件相关参数可以由下式计算得到系统的光学分辨率[15]：
|
式中，R为光学分辨率，λ为入射光波长，NA为物镜的数值孔径。
为了让被物镜分辨清楚的图像细节也被相机分辨清楚，相机理想像元尺寸需满足奈奎斯特采样定律[16]，由如下公式计算：
|
式中，l为相机理想像元尺寸，R为光学分辨率，M为光学系统的综合放大倍率。
此外，在4×相差视场观察下，相机靶面要求能覆盖完整的单个培养隔间（4.5 mm × 4.5 mm）。
因此，光学系统的参数匹配要求如表2所示，最终选用相机为度申科技USB3.0大靶面相机，型号U3P2 100-H，分辨率5 480 × 3 648，像元大小3.45 μm，靶面尺寸18.9 mm × 12.6 mm。
表2
光学系统参数匹配表
Table2.
Parameter matching of optical system
2.2 光机运动模块设计
胚胎在线监测的光学系统采用倒置显微镜结构方案，如图4所示，所有光学元件安装在立柱上，呈C型结构，培养模块位于聚光镜和物镜模块之间，其中光阑和物镜均沿直线排布，可以通过相应的x向直线运动机构实现光阑和物镜的切换，使两者搭配进行观察。物镜模块搭载在调焦机构上，可沿z向作升降运动，调节物镜成像焦平面的高度，从而对样品不同层切面成像。
图4
光机运动模块实物图
Figure4.
Picture of optomechanical motion module
另外，采用低倍搜寻、高倍观察的监测方案，需根据胚胎偏离光学系统视场中心的坐标值对光学系统x和y方向的位置进行补偿，分别由平台x机构和平台y机构执行相应的动作，同时通过平台x机构可以将光学系统切换至不同培养室内的培养隔间进行观察。
所有直线运动单元采用步进电机+丝杆传动的方式，为保证机构的定位精度，步进电机配置了编码器，避免运动过程中的丢步现象，丝杆螺母通过消隙处理避免空回误差。
为保证光学系统的成像质量，立柱上了设置了x和y向定位基准，用以对安装在立柱上的光学元件的离轴误差进行控制，光学系统的综合离轴误差合成公式如下[17-18]：
|
式中为系统综合离轴误差，和为x和y向的离轴误差分量，其中以为例，计算公式如下：
|
式中为第i个光学元件中心至x基准面的距离误差，主要由零件的尺寸加工误差引入，考虑到各光学元件的误差传递方式相同，装配尺寸相近，可以按等作用误差原则进行分配，计算公式如下：
|
控制光学系统的综合离轴误差为0.05 mm，由于光阑和物镜x向是可移动的，通过运动机构精度保证，各光学元件中心至基准的误差分配结果详见表3，据此对相关结构件的尺寸误差进行约束。
表3
光学系统误差分配表（mm）
Table3.
Error distribution of optical system (mm)
2.3 系统装调与试验
为保证成像质量，达到设计分辨率要求和高对比度效果，光学系统装调最关键的环节便是满足相差光路环形光阑与物镜内置相位板的共轭关系，以及霍夫曼调制相衬光路矩形光阑与物镜内置调制板的共轭的关系，其装调示意图如图5所示。
图5
光学系统装调示意
Figure5.
Installation and adjustment of optical system
在相差观察视场内，照明光通过环形光阑呈现为明亮的圆环，而物镜后焦面内置相位板为灰暗的圆环，两者互相匹配，大小一致，需要通过x和y两个方向的平移，保证两者重合。
霍夫曼物镜后焦面内置调制板分为三个区域，依次是D区（透光率1%）、G区（透光率15%）和B区（透光率100%）。矩形光阑分两个区域，一是透射区（T区），另一个是亮度随偏振器而改变的偏振区（P区）。在霍夫曼观察视场内，调节x、y方向的平移和绕轴旋转，使矩形光阑的T区进入物镜调制板的G区，光阑的P区进入物镜调制板的B区。通过旋转位于光阑上部的偏振片的角度，可以改变图像对比度。
本研究对光学系统的成像质量进行了验证。利用Edmund USAF 1951分辨率测试目标板（空间频率最高645 lp/mm）对光学分辨率进行测试。取分辨率板成像图案中刚能分辨的某一单元线条，查找对应的空间频率的数值，由下式计算系统的光学分辨率。
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式中，R为光学分辨率（单位：μm），f为空间频率（单位：lp/mm）。
最终系统的光学分辨率测试结果如表4所示，考虑到光学系统不可避免存在像差，测量值与理论值接近，认为三种模式均达到了光学设计要求。
表4
光学分辨率测试结果
Table4.
Results of optical resolution test
2.4 胚胎成像试验
分辨率是表征光学成像系统解析物体细节的能力，而胚胎作为透明体，光线经过样品后产生的相位差转换成图像对比度的变化，所呈现出的直观立体效果可以通过实际胚胎成像进行观察和评价。胚胎从囊胚发育至原肠胚不同阶段的形态，在相差和霍夫曼观察模式下拍摄的图像如图6所示。
图6
胚胎拍摄图像
Figure6.
Images of embryos
从图6可见，低倍的相差成像系统能从背景中识别出胚胎大致轮廓，但内部细节无法看清，而霍夫曼调制相衬成像系统所呈现的胚胎图像具有更加明显的浮雕立体效果，且能清晰地表征出胚胎的形态细节。
3 胚胎跟踪和捕捉策略
培养装置光学模块的运动部件各自由度的执行器为步进电机，电机的运动控制模块通过控制器局域网络（controller area network，CAN）总线接口与上位机进行通讯，相机与上位机通过USB3.0进行通讯和数据传输，采用软件触发模式拍摄采集图像，所有电机运动和相机拍摄动作由上位机进行时序调度和控制。
在胚胎长时程培养过程中，采用低倍搜寻、高倍观察的在线监测方案，由光学模块的多自由度机构配合对胚胎进行跟踪和捕捉拍摄，基于图像处理算法定位胚胎的空间位置。
胚胎在线跟踪拍摄流程和原理详见图7，在所有机构零位状态下开始，首先将观察方式切换为4×相差模式，移动至要观察的胚胎，采用低倍系统进行粗调拍摄，记录得到多焦面图像数据，然后基于多焦面图像数据，通过图像识别和定位处理算法，获取胚胎在空间中的x、y和z的位置坐标，再由运动机构进行位置补偿，将光学视场中心移动至目标胚胎中心处，最后切换至高倍霍夫曼观察模式，对胚胎细节进行微调拍摄，记录胚胎细胞不同层切面的图像。
图7
胚胎在线跟踪拍摄流程和原理
Figure7.
Process and principle of embryo online tracking and capturing
上述在对某个胚胎进行在线跟踪拍摄期间，该培养室的液路暂停工作，包括换液操作和动态液流剪切动作，以确保拍摄期间内胚胎在培养隔间内的位置是固定的。
胚胎长时程培养过程中通过自动跟踪拍摄，实现在线监测的核心环节是胚胎的图像处理算法，基于低倍大视场光学系统拍摄的多焦面图像获取胚胎准确的空间位置坐标，进而转入高倍系统观察胚胎的细节形态。
4 胚胎图像处理与试验
胚胎在低倍视场下拍摄的图像随着物镜观察焦面高度位置的切换，样本会经历模糊—清晰—模糊的过程，需通过图像算法识别出胚胎最清晰的焦面图像，进而确定其在培养隔间中的x、y、z坐标。
目前广泛采用的清晰度识别方法基于图像边缘信息或图像的灰度梯度信息，认为对焦清晰的图像具有更尖锐的边缘，故具有更大的梯度函数值，主要包括绝对方差函数、Roberts梯度和函数、梯度向量平方函数、Brenner函数、Laplacian函数、Tenengrad函数和Variance函数等[19-20]。这些算法都是对全局图像进行清晰度评价，而胚胎在图像中占据面积一般很小，且往往出现背景清晰、胚胎模糊或背景模糊、胚胎清晰的现象，对评价结果的贡献量微弱，因此，无法直接基于清晰度识别来确定胚胎最为清晰的焦面。
为了实现胚胎低倍搜寻、高倍观察的在线监测效果，本文提出了另一种胚胎识别定位思路，并开展了图像算法的试验研究。首先对低倍视场拍摄的多焦面图像，进行去噪和灰度二值化预处理，然后基于轮廓查找和面积过滤算法，依此遍历各个焦面图像，确定出胚胎的质心坐标（x和y坐标），再以胚胎质心为中心对每张焦面图像截取胚胎所在的图像区域，最后对不同焦面截取的图像进行清晰度评价，找出最清晰的焦面，从而确定胚胎的z坐标。定位出胚胎的具体位置，便可以通过运动机构对光学系统的位置进行修正补偿，实现胚胎的对中和对焦，再切换至高倍模式观察胚胎的细节。胚胎识别定位的详细图像处理算法流程如图8所示。
图8
胚胎识别定位算法流程图
Figure8.
Flow chart of embryo identification and location algorithm
4.1 图像预处理
由于实验室操作环境的影响，制备胚胎时培养液内可能会混入杂质成分，并且随着胚胎发育的不断推进，胚胎周围也会逐渐滋生许多颗粒细胞，因此为避免杂质的干扰对胚胎轮廓提取的影响，需对图像进行去噪处理，保留重要的胚胎的轮廓信息，去除无用的杂质信息。
胚胎图像预处理效果如图9所示。图像取灰度化后，首先进行滤波处理和二值化阈值分割，选取阈值时，以保留胚胎图像部分的主要信息为准。滤波算法采用中值滤波，能消除和平滑图像中较小的椒盐噪声，而且能有效保护图像的边缘信息，不对后续的轮廓提取造成影响[21]。
图9
图像预处理效果
Figure9.
Effect of image preprocessing
对二值化图像通过膨胀及腐蚀算法进行处理能有效去除较大的杂质噪声[22]，膨胀运算后可以将胚胎培养隔间内的长条纹和小颗粒杂质完全滤除，虽然胚胎图像自身受膨胀运算也会出现收缩，但再进行腐蚀运算后，胚胎面积会恢复，同时原来离散的接近贴壁的干扰图像能与栅罩的内壁进一步联通，形成完整轮廓，为后续的轮廓提取和面积过滤做准备。
4.2 胚胎轮廓提取
预处理后的图像通过resize()函数缩放为800 × 600的分辨率，以左上角为图像的坐标原点，则视场中心的坐标为（400，300），图像总面积为480 000。
通过调用OpenCV函数库中的查找轮廓findContours()函数、轮廓面积contourArea()函数和图像矩moments()函数，提取出封闭区域的轮廓，并计算其面积和质心坐标。
轮廓提取结果如表5所示，找到4处轮廓，其中编号2即为胚胎的轮廓，与其他轮廓有明显的差别，经过简单的面积和质心过滤可以将其他过小过大或培养隔间之外的轮廓排除，便能定位出胚胎的坐标（443，218），其与视场中心（400，300）作差，可求得坐标的补偿量。
表5
轮廓提取结果
Table5.
Results of contour extraction
4.3 清晰度评价
以胚胎质心为中心，根据胚胎实际占据的面积，截取出不同焦平面图像中胚胎所在的图像区域，进行清晰度评价。本文选取了三种清晰度评价方法进行对比，分别是Tenengrad梯度方法、Laplacian梯度方法和方差方法。其中，Tenengrad梯度方法使用Sobel算子提取图像水平和垂直方向的梯度值，其清晰度评价函数 Ten 定义为如下公式[23-24]：
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式中，，其中 和 分别是Sobel算子沿x向和y向的卷积核， 和 分别为图像在点 处的灰度值和灰度梯度值， 为图像总像素数。
Laplacian梯度方法和Tenengrad梯度方法原理相似，只是Laplacian算子是一种二阶导数算子，可以满足不同方向图像边缘锐化的要求。
方差方法认为清晰聚焦的图像有着比模糊图像更大的灰度差异，可以将方差函数F作为清晰度评价函数[25]：
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式中， 为整幅图像的平均灰度值， 为点 处的灰度值， 为图像总像素数。
表6列出三种不同方法得出的清晰度评分结果，值越大表示图像越清晰，可以看出，不同评价方法的结论是一致的，均认为第3个焦面的胚胎最清晰，与肉眼判断的结果吻合。
表6
清晰度评分结果
Table6.
Results of definition evaluation
识别出最清晰的一层焦面，便可以定位胚胎在空间内z方向的坐标，进而通过位置补偿将光学系统移动至胚胎中心，切换至高倍观察模式对胚胎进行拍摄，获取胚胎清晰的形态图像。
5 结论
本文为胚胎体外长时程培养设计了一种在线监测系统，配置了4 × 相差、10 × 和20 × 霍夫曼调制相衬光学系统。实验证明，匹配的光学系统成像分辨率满足设计要求，并达到高对比度的浮雕立体效果。胚胎的在线监测系统采用“低倍搜寻、高倍观察”的跟踪和捕捉策略，并基于图像轮廓面积和清晰度评价对胚胎进行识别和定位，结果证明开发的图像处理算法具有较好的准确性和通用性。
本文开发的胚胎长时程培养在线监测系统可以准确捕捉胚胎发育过程中的形态信息，重现胚胎发育的动态过程，评价胚胎发育的优劣，为胚胎体外长时程培养体系的优化和迭代提供依据。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
