巨噬细胞是机体免疫系统中重要的免疫效应细胞，具有显著的可塑性和异质性，在正常生理条件下和炎症反应过程中均发挥着重要作用。研究发现，巨噬细胞极化涉及多种细胞因子，是免疫调控的关键环节。纳米颗粒靶向巨噬细胞可对多种疾病的发生发展产生一定影响，其中氧化铁纳米颗粒因其特性被作为癌症诊断和治疗的介质与载体，可充分利用肿瘤的特殊微环境，将药物主动或被动地聚集于肿瘤组织，具有良好的应用前景。但利用氧化铁纳米颗粒重编程巨噬细胞的具体调控机制仍需深入探究。本文首先阐述了巨噬细胞的分类、极化效应及代谢机制，其次对氧化铁纳米颗粒的应用以及诱导巨噬细胞重编程进行综述，最后讨论了氧化铁纳米颗粒的研究前景和面临的困难与挑战，为进一步探讨纳米颗粒对巨噬细胞极化效应的机制研究提供基础数据和理论支持。
引用本文： 张皓杰, 张新雨, 冯亚婵, 杜朝, 王英泽, 郭学玲. 氧化铁纳米颗粒对巨噬细胞极化效应影响的研究进展. 生物医学工程学杂志, 2023, 40(2): 384-391. doi: 10.7507/1001-5515.202209027 复制
0 引言
巨噬细胞（macrophages，Mø）由单核细胞分化而成，一般呈圆形或椭圆形，表面有短小突起，在功能活跃状态下常具有较长伪足而呈不规则形状。巨噬细胞对维持机体稳态起重要作用，不仅能清除病原体和异物，还能诱导愈合和修复受损组织[1]。巨噬细胞极化过程呈可逆、不稳定状态，参与众多疾病的发生和发展，如自身免疫病、心血管疾病和癌症等。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）作为肿瘤微环境中影响肿瘤生长和疾病进展的关键组成部分，可以抑制或支持肿瘤生长，这取决于向经典激活的巨噬细胞（M1）或选择性激活的巨噬细胞（M2）两种表型极化方向的选择[2]。因此，巨噬细胞因其可塑性和异质性成为细胞免疫治疗的新兴靶点和研究热点。
近年来，纳米颗粒因良好的生物相容性、药物缓释和稳定性等特点被广泛应用于多种疾病治疗，尤其是靶向巨噬细胞的细胞免疫治疗已成为纳米医学极具前景的新策略。氧化铁纳米颗粒因高效性和特异性等特点在癌症诊断和治疗中发挥着重要作用，能充分利用肿瘤微环境，主动或被动地聚集于肿瘤组织[3]。临床上氧化铁纳米颗粒被用作铁替代疗法，同时可作为药物传递系统。例如Feraheme（也称为ferumoxytol）是FDA批准的羧甲基右旋糖酐包被氧化铁纳米颗粒，用于治疗缺铁性贫血，同时也被用作抗癌药物和造影剂的药物输送系统[4-5]。目前，氧化铁纳米颗粒对TAMs极化的影响以及诱导巨噬细胞极化的治疗效果已被广泛研究。
氧化铁纳米颗粒通过加工修饰可改变TAMs的表型，从而改善肿瘤微环境。研究表明，氧化铁纳米颗粒工程化能够针对性地改变巨噬细胞的性能，但关于氧化铁纳米颗粒免疫原性及其尺寸效应的研究目前尚未见相关报道。本文阐述了巨噬细胞极化调控机制及其在肿瘤治疗中的作用，总结了氧化铁纳米颗粒在医学领域的应用，并讨论和分析了氧化铁纳米颗粒诱导巨噬细胞的重编程作用及意义，以期为采用纳米技术治疗肿瘤的研究提供基础数据和理论支持。
1 巨噬细胞
巨噬细胞在机体内复杂的微环境中，具有独特的表型和功能，在生理条件以及炎症过程中均发挥着重要作用[6-7]。巨噬细胞通过改变其表型以响应细胞因子、微生物代谢物等不同刺激进行动态极化，该过程不仅涉及组织微环境，也涉及多种细胞信号通路。因此，深入探讨巨噬细胞极化的分子机制对实现纳米颗粒靶向巨噬细胞进行免疫治疗具有重要的临床意义。
1.1 巨噬细胞的类型
M1型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子和趋化因子，诱导炎症反应的发生并专职提呈抗原，参与正向免疫应答，发挥免疫监视的功能，可抑制肿瘤细胞的增殖；M2型巨噬细胞能够释放抑炎性细胞因子，在缓解炎性疾病中发挥作用，抑制炎症反应发生，修复受损组织，且促进肿瘤的生成[8-9]。如图1所示，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）的分泌、一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表达和活性以及膜蛋白CD16/32的表达可用于鉴定M1型巨噬细胞；精氨酸酶-1（arginine-1，Arg-1）的表达和活性、CD206和CD163的表达可用于鉴定M 2型巨噬细胞。通过表型鉴定巨噬细胞的类型，对于研究巨噬细胞在不同生理和病理条件下所发挥的功能具有重要意义。
图1
巨噬细胞的类型
Figure1.
The type of macrophage
1.2 代谢支持巨噬细胞活化
巨噬细胞在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的诱导下极化为M1型，同时巨噬细胞的能量代谢方式发生转变，主要表现为细胞获取能量的途径发生改变，氧化磷酸化减弱，糖酵解途径增强，如图2所示。葡萄糖进入细胞后，在己糖激酶（hexokinase，HK）等一系列糖酵解酶的作用下逐步释放能量进入线粒体，同时HK也会促进炎症小体（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）的产生，增强炎性反应。在线粒体中，三羧酸循环途径被破坏，引起柠檬酸和琥珀酸的积累，导致NO和ROS的产生。琥珀酸的积累亦会抑制脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase，PHD）对缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor 1，HIF1）的羟化作用，同时可与M2型丙酮酸激酶结合从而增强炎性反应及糖酵解酶活性。M1型巨噬细胞除糖酵解途径明显增强外，还伴随着相关蛋白分子的一系列变化，如铁离子贮存蛋白（铁蛋白）高表达，谷胱甘肽水平升高，膜铁转运蛋白低表达，精氨酸活性减弱等[10-11]。此外HIFα分为HIF-1α和HIF-2α，HIF-2α则主要在M2型巨噬细胞中表达[12]。
图2
M1型巨噬细胞的代谢机制
Figure2.
Metabolic mechanism of M1-type macrophages
1.3 巨噬细胞极化调控
γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）是被发现的第一种诱导巨噬细胞极化的细胞因子，随后LPS通过toll样受体4（toll like receptor 4，TLR4）促进M1型巨噬细胞的活化和IFN-β的自分泌相继被大量研究。二者主要通过Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK-STAT）信号通路作用于细胞，从而诱导巨噬细胞活化，其中STAT1和STAT2诱导Ⅰ型IFN（-α和-β）和Ⅱ型IFN（-γ）的基因表达介导M1型巨噬细胞极化，STAT3和STAT6分别调控IL-10、IL-4和IL-13介导M2型巨噬细胞极化[13-14]。核转录因子NF-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）调控许多炎症基因的表达，通过MyD88或TRIF/TIRAP途径激活IKK–NFκB级联反应以响应各种生理和环境刺激[15]。LPS还激活有丝分裂原激活蛋白激酶，最终激活另一转录因子激活蛋白-1（activator protein 1，AP-1）。此外，干扰素调节因子（interferon regulatory factors，IRFs）为Ⅰ型干扰素的调节因子，在巨噬细胞的调节功能中发挥着重要作用[16]。
过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR-γ）是促炎基因的负调节因子，通过下调STAT、NFκB和AP-1的表达抑制M1型巨噬细胞极化，同时IL-4和IL-13也能诱导PPAR-γ的表达[17-18]。糖皮质激素受体的激活通过抑制AP-1和NF-κB的功能损害TLR4信号，最终抑制炎症信号[19]。Krüppel样因子（Krüppel-like factors，KLFs）是DNA结合转录调控因子锌指类的一个亚家族，KLF2和KLF4通过降低NF-κB的活性抑制细胞因子介导巨噬细胞活化[20]。小分子RNA（microRNAs，miRs）是一类调控RNA分子的家族，类似于RNA干扰的内源性介体，调节许多生理过程，包括凋亡、分化和免疫细胞的激活。转录调节因子C/EBPβ在TAMS中表达，并通过削弱对肿瘤细胞的细胞毒性免疫反应，促进M2样表型支持肿瘤生长。
鉴于巨噬细胞亚群及其产物在机体稳态中的重要性，巨噬细胞一直是科研人员深入研究的重要对象。巨噬细胞形态分化的主要控制点在转录水平上，上述途径已被确认为巨噬细胞亚型转变的必要调控途径。
2 氧化铁纳米颗粒
近年来利用纳米技术治疗癌症备受关注，众多的纳米粒子被开发为纳米药物，参与癌症等多种疾病的诊断和治疗[21]。利用纳米材料靶向免疫系统是非常热门的研究领域，而癌症治疗的关键问题是在靶向肿瘤部位的同时达到理想的药物浓度，在对肿瘤细胞进行杀伤的同时降低对正常细胞的伤害[22]。纳米粒子的免疫活性取决于其理化性质及随后的细胞内化，随着潜在因素的阐明，更多的纳米颗粒被用来设计和评估诱导免疫抑制和补充免疫抑制药物。磁性氧化铁纳米粒子作为一种具有独特磁学性质的纳米颗粒，在磁共振成像、靶向药物运输、磁性分离提纯、磁致发热治疗和基因治疗、诊断等生物医学方面表现出卓越的性能和巨大的发展潜力[23-24]。
2.1 磁共振成像
超顺磁性氧化铁纳米颗粒（superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs）作为磁共振造影剂被广泛用于肿瘤诊断、肿瘤定位及病变部位造影显示，如动脉粥样硬化斑块等。SPIONs同其他纳米颗粒一样，通过静脉注射后，最终会被肝脏、脾脏、淋巴结和骨髓中的巨噬细胞清除[25]。超小的超顺磁性氧化铁颗粒被聚集在炎症部位的单核巨噬细胞摄取后，可增强心血管磁共振成像效果以便分析心血管疾病的关键炎性成分，可提供关于心肌和血管疾病细胞炎症成分的有价值的额外信息[26]。随着研究的不断深入，其尺寸优势在磁共振成像上逐渐凸显出来，但是对造影成像后病变部位中巨噬细胞的变化还有待深入探究。
2.2 靶向运输
为了提高基于SPIONs的药物传递系统的靶向性，在表面进行涂层修饰成为首要考虑的方式。涂层/载体可以为输送系统提供合适的亲水性，使SPIONs易于在所需介质中分散，同时可提供进一步修饰的官能团，以此达到药物可控释放或肿瘤靶向性的目的[27]。Kono等[28]将SPIONs负载质粒DNA后改善了巨噬细胞在结肠的转运，能够治疗结肠炎性疾病，实现了巨噬细胞的磁化和工程化。Kang等[29]利用氧化铁纳米颗粒携带的球形神经团在外磁场作用下改善了干细胞向脑内的转运，促进了脑出血后功能的恢复，靶向递送神经细胞为脑出血开发了新的治疗策略。在磁性药物靶向中，SPIONs还可以通过外部磁场梯度引导到特定的靶侧，通过交变磁场诱导热疗或药物释放。磁性药物靶向通常是为了增强载有化疗药物的氧化铁纳米粒子的积聚和疗效，但因磁性药物靶向需要非常强的磁场才能在人体内成功应用，这增加了硬件设备的成本，限制了其临床应用。
2.3 磁致发热治疗
磁流体热疗是纳米技术和热疗相结合的一种新兴方法，具有高度的靶向性和特异性。通过静脉注射SPIONs的磁流体热疗引起的温度升高通常不足以激活机体免疫系统，这是因为纳米颗粒在肿瘤部位的局部浓度太低[30-31]。而磁性氧化铁纳米粒子暴露在交变磁场中会触发粒子的运动和局部加热，可导致纳米颗粒周围区域的组织损伤，并已应用于肿瘤治疗[32]。其主要原理是温度升高到42 ℃以上，蛋白质变性，导致细胞死亡[33]。交变磁场治疗被认为是一种控制SPIONs释放药物和诱导肿瘤热疗的方法，但交变磁场对巨噬细胞极化作用的研究还较少。
2.4 重编程巨噬细胞和免疫调节
在许多癌症中，TAMs主要表现为M2型巨噬细胞，促进肿瘤细胞的发展，因此将TAMs复极化为M1型巨噬细胞对肿瘤进行杀伤成为一种行之有效的癌症治疗策略。M2型巨噬细胞可在局部微环境发生改变的条件下迅速极化为M1型，而M1型巨噬细胞是通过NO和TNF-α直接杀死肿瘤细胞的效应细胞，可发挥抗肿瘤效应，其对M2型巨噬细胞的免疫活性起拮抗作用[34]。通过改变肿瘤组织中浸润巨噬细胞的亚型，可使细胞向促炎方向发展，抑制肿瘤的发生发展。
氧化铁纳米颗粒被证明具有药理学特性，通过加工修饰，改变了聚集的巨噬细胞的极化，如表1所示。含羧酸的氧化铁纳米颗粒与乳酸氧化酶结合提高了肿瘤微环境中M1巨噬细胞的比例；抗CD206抗体偶联的聚乳酸聚乙醇酸纳米粒（CD206-Fe3O4）能靶向结合M2巨噬细胞，并通过释放氧化铁颗粒将M2型巨噬细胞复极化为M1型巨噬细胞，增强了抗肿瘤效果；通过用透明质酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子（HIONs）对巨噬细胞进行人工重编程，实质性地改善了细胞固有免疫能力[35-37]。除此之外，带正电的SPION（S+）和带负电的SPION（S–）在体外均能有效地使M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞重新极化，并显著增强了巨噬细胞的芬顿效应和趋化作用，且S+具有更高的细胞摄取和巨噬细胞极化效应[38]。
表1
不同修饰的氧化铁纳米颗粒诱导巨噬细胞的靶点及效果
Table1.
Targets and effects of macrophages induced by different modified iron oxide nanoparticles
SPIONs的生物学效应可能是由于其氧化铁核心的固有特性，诱导ROS产生，调节细胞内氧化还原和铁的代谢。齐奥等[39]通过体内研究表明氧化铁纳米颗粒在被巨噬细胞吞噬后能够释放Fe2+，Fe2+与巨噬细胞中的H2O2发生芬顿反应生成OH·释放到细胞外，杀伤肿瘤细胞，即在体内通过诱导巨噬细胞产生ROS抑制肿瘤活性，促进肿瘤细胞的死亡。在SPIONs的诱导下，伴随着铁蛋白和组织蛋白酶L水平的增加，铁相关蛋白胞内水平和活性可能决定着巨噬细胞内铁浓度的改变，进而影响细胞亚型的分化[40]。将高表达膜铁转运蛋白的巨噬细胞作为铁的储存库，为体内靶向输送Fe3O4-NPs和铁离子提供基础，能够把Fe3O4纳米粒子和铁离子直接输送到肿瘤部位。CD86+、TNF-α、铁蛋白和组织蛋白酶L水平的上升标志着在SPIONs中铁的诱导下巨噬细胞M2表型可向M1表型转变。
由于氧化铁纳米颗粒优先在巨噬细胞内聚集，并且细胞内铁平衡对调节巨噬细胞极化状态的基因与蛋白表达至关重要，因此氧化铁纳米颗粒被认为是潜在的癌症治疗工具。铁在生物系统内以Fe2+和Fe3+两种形态存在并通过氧化还原反应相互转化，巨噬细胞作为铁代谢调节器控制着细胞内铁的输入和输出[41]。如图3所示，氧化铁纳米颗粒重编程巨噬细胞始于与细胞表面受体的相互作用，包括TLR、清道夫受体、FCγ受体（Fc γ receptors，FcγRs）和补体受体（complement receptor，CR）。同时氧化铁纳米颗粒与受体结合能够促进下游MAPK/mTOR级联和转录因子STATs、NF-κB和IRF的激活，进而激活免疫，促进炎症发生。巨噬细胞吞噬氧化铁纳米颗粒后，在溶酶体内降解后能够引发芬顿反应。同时PHD的氧合作用被抑制，促进转铁蛋白受体1和二价金属转运体1的表达[42]。
图3
氧化铁纳米颗粒诱导巨噬细胞的分子机制
Figure3.
Molecular mechanism of iron oxide nanoparticles inducing macrophages
由于氧化铁纳米颗粒越来越广泛地被应用于癌症诊断和治疗的临床实践，纳米颗粒对肿瘤微环境的影响具有直接而广泛的现实意义。磁性氧化铁纳米颗粒在神经再生领域也显示出巨大的研究价值，中空氧化铁纳米颗粒能有效地诱导巨噬细胞极化，促进神经干细胞的增殖和血管内皮细胞的迁移[43]。聚合物复合SPIONs作为磁共振造影剂能够在炎症诱导的细胞氧化还原条件下激活，得到炎症性疾病严重程度或分期的报告[44]。顺磁性纳米颗粒包裹的T细胞可以通过外加磁场聚集于T细胞受体，增加细胞之间的接触和沟通，增强肿瘤杀伤能力。体外磁场还可以引导过继转移的磁性纳米颗粒包被T细胞到体内的靶部位，从而显著提高细胞治疗的效率[45]。
氧化铁纳米颗粒的形态和大小是导致颗粒细胞毒性的主要因素，研究表明棒状氧化铁纳米颗粒比球形氧化铁纳米颗粒更具毒性[46]。氧化铁纳米颗粒诱导巨噬细胞释放IL-1β具有大小和剂量依赖性，聚乙二醇包被的10 nm氧化铁纳米颗粒显示出比30 nm更高的细胞摄取率，同时也有研究表明略大尺寸的氧化铁纳米颗粒更能干扰巨噬细胞炎性因子的释放。氧化铁纳米颗粒调节促炎巨噬细胞的作用并不一致，原因可归结于不同涂层修饰和尺寸大小，因此在其应用中考虑尺寸和涂层性能是至关重要的[47-48]。
3 总结与展望
纳米技术在癌症诊断、治疗和预防等领域中的应用愈来愈广泛，因纳米颗粒的物理和生物特性，使之与免疫细胞相互作用，成为肿瘤治疗的新兴手段。巨噬细胞作为异质性细胞群体在免疫系统中发挥着重要的作用，根据巨噬细胞的极化效应将之分为经典激活的M1型巨噬细胞和选择性激活的M2型巨噬细胞，且巨噬细胞的极化过程受多条信号通路的众多细胞因子调控。
氧化铁纳米颗粒作为癌症诊断和治疗的介质和载体，应用前景广泛，磁性氧化铁纳米粒子、SPIONs以及添加各种修饰的SPIONs等形态各异纳米颗粒的制备和修饰已在诸多实验研究中逐步成熟。探究氧化铁纳米颗粒对巨噬细胞极化的影响，并根据疾病发生的机制来研究氧化铁纳米颗粒对病变部位的影响机制有助于揭示氧化铁纳米颗粒的药效学基础。氧化铁纳米颗粒对巨噬细胞重新编程的能力使之成为癌症治疗的一个很有希望的候选者，但是基于氧化铁纳米颗粒对巨噬细胞进行重新编程的研究进展在很大程度上仍然是经验性的。
目前，将相关研究结果转移到临床上仍然存在许多困难和挑战，氧化铁纳米颗粒缺乏制备和研究的标准，同时面临试验条件的可变性，导致该研究领域发展较慢。不同修饰和不同涂层的氧化铁纳米颗粒的配方都是独特的，标准化生产和临床转化较为困难，且在进入临床阶段前还面临理化性质、安全性、给药途径药代动力学等众多挑战。在免疫系统中，纳米颗粒对巨噬细胞的固有免疫研究颇多，但针对有机体的适应性免疫方面的研究有待进一步深入。因此，应继续努力探索氧化铁纳米颗粒自身将巨噬细胞重新编程为M1样表型的能力与作用机制。目前，存在以下几个问题需要解决：① 氧化铁纳米颗粒从研究性制备到临床应用的转化。② 阐明氧化铁纳米颗粒重编程巨噬细胞后细胞功能调控机制变化，同时为调节其抗肿瘤功能提供策略。③ 研究氧化铁纳米颗粒的物化性质颗粒，以更大程度地发挥其自身的治疗效果。④ 研究氧化铁纳米颗粒重编程巨噬细胞是否可与其他免疫治疗策略联用作为免疫增强剂。结合上述问题展开研究将为完善氧化铁纳米颗粒的生物学效应提供新的策略和依据。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：张皓杰撰写论文初稿；张新雨和冯亚婵参与修改；杜朝和王英泽负责指导和修改；郭学玲负责审校。
0 引言
巨噬细胞（macrophages，Mø）由单核细胞分化而成，一般呈圆形或椭圆形，表面有短小突起，在功能活跃状态下常具有较长伪足而呈不规则形状。巨噬细胞对维持机体稳态起重要作用，不仅能清除病原体和异物，还能诱导愈合和修复受损组织[1]。巨噬细胞极化过程呈可逆、不稳定状态，参与众多疾病的发生和发展，如自身免疫病、心血管疾病和癌症等。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）作为肿瘤微环境中影响肿瘤生长和疾病进展的关键组成部分，可以抑制或支持肿瘤生长，这取决于向经典激活的巨噬细胞（M1）或选择性激活的巨噬细胞（M2）两种表型极化方向的选择[2]。因此，巨噬细胞因其可塑性和异质性成为细胞免疫治疗的新兴靶点和研究热点。
近年来，纳米颗粒因良好的生物相容性、药物缓释和稳定性等特点被广泛应用于多种疾病治疗，尤其是靶向巨噬细胞的细胞免疫治疗已成为纳米医学极具前景的新策略。氧化铁纳米颗粒因高效性和特异性等特点在癌症诊断和治疗中发挥着重要作用，能充分利用肿瘤微环境，主动或被动地聚集于肿瘤组织[3]。临床上氧化铁纳米颗粒被用作铁替代疗法，同时可作为药物传递系统。例如Feraheme（也称为ferumoxytol）是FDA批准的羧甲基右旋糖酐包被氧化铁纳米颗粒，用于治疗缺铁性贫血，同时也被用作抗癌药物和造影剂的药物输送系统[4-5]。目前，氧化铁纳米颗粒对TAMs极化的影响以及诱导巨噬细胞极化的治疗效果已被广泛研究。
氧化铁纳米颗粒通过加工修饰可改变TAMs的表型，从而改善肿瘤微环境。研究表明，氧化铁纳米颗粒工程化能够针对性地改变巨噬细胞的性能，但关于氧化铁纳米颗粒免疫原性及其尺寸效应的研究目前尚未见相关报道。本文阐述了巨噬细胞极化调控机制及其在肿瘤治疗中的作用，总结了氧化铁纳米颗粒在医学领域的应用，并讨论和分析了氧化铁纳米颗粒诱导巨噬细胞的重编程作用及意义，以期为采用纳米技术治疗肿瘤的研究提供基础数据和理论支持。
1 巨噬细胞
巨噬细胞在机体内复杂的微环境中，具有独特的表型和功能，在生理条件以及炎症过程中均发挥着重要作用[6-7]。巨噬细胞通过改变其表型以响应细胞因子、微生物代谢物等不同刺激进行动态极化，该过程不仅涉及组织微环境，也涉及多种细胞信号通路。因此，深入探讨巨噬细胞极化的分子机制对实现纳米颗粒靶向巨噬细胞进行免疫治疗具有重要的临床意义。
1.1 巨噬细胞的类型
M1型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子和趋化因子，诱导炎症反应的发生并专职提呈抗原，参与正向免疫应答，发挥免疫监视的功能，可抑制肿瘤细胞的增殖；M2型巨噬细胞能够释放抑炎性细胞因子，在缓解炎性疾病中发挥作用，抑制炎症反应发生，修复受损组织，且促进肿瘤的生成[8-9]。如图1所示，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）的分泌、一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表达和活性以及膜蛋白CD16/32的表达可用于鉴定M1型巨噬细胞；精氨酸酶-1（arginine-1，Arg-1）的表达和活性、CD206和CD163的表达可用于鉴定M 2型巨噬细胞。通过表型鉴定巨噬细胞的类型，对于研究巨噬细胞在不同生理和病理条件下所发挥的功能具有重要意义。
图1
巨噬细胞的类型
Figure1.
The type of macrophage
1.2 代谢支持巨噬细胞活化
巨噬细胞在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的诱导下极化为M1型，同时巨噬细胞的能量代谢方式发生转变，主要表现为细胞获取能量的途径发生改变，氧化磷酸化减弱，糖酵解途径增强，如图2所示。葡萄糖进入细胞后，在己糖激酶（hexokinase，HK）等一系列糖酵解酶的作用下逐步释放能量进入线粒体，同时HK也会促进炎症小体（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）的产生，增强炎性反应。在线粒体中，三羧酸循环途径被破坏，引起柠檬酸和琥珀酸的积累，导致NO和ROS的产生。琥珀酸的积累亦会抑制脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase，PHD）对缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor 1，HIF1）的羟化作用，同时可与M2型丙酮酸激酶结合从而增强炎性反应及糖酵解酶活性。M1型巨噬细胞除糖酵解途径明显增强外，还伴随着相关蛋白分子的一系列变化，如铁离子贮存蛋白（铁蛋白）高表达，谷胱甘肽水平升高，膜铁转运蛋白低表达，精氨酸活性减弱等[10-11]。此外HIFα分为HIF-1α和HIF-2α，HIF-2α则主要在M2型巨噬细胞中表达[12]。
图2
M1型巨噬细胞的代谢机制
Figure2.
Metabolic mechanism of M1-type macrophages
1.3 巨噬细胞极化调控
γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）是被发现的第一种诱导巨噬细胞极化的细胞因子，随后LPS通过toll样受体4（toll like receptor 4，TLR4）促进M1型巨噬细胞的活化和IFN-β的自分泌相继被大量研究。二者主要通过Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK-STAT）信号通路作用于细胞，从而诱导巨噬细胞活化，其中STAT1和STAT2诱导Ⅰ型IFN（-α和-β）和Ⅱ型IFN（-γ）的基因表达介导M1型巨噬细胞极化，STAT3和STAT6分别调控IL-10、IL-4和IL-13介导M2型巨噬细胞极化[13-14]。核转录因子NF-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）调控许多炎症基因的表达，通过MyD88或TRIF/TIRAP途径激活IKK–NFκB级联反应以响应各种生理和环境刺激[15]。LPS还激活有丝分裂原激活蛋白激酶，最终激活另一转录因子激活蛋白-1（activator protein 1，AP-1）。此外，干扰素调节因子（interferon regulatory factors，IRFs）为Ⅰ型干扰素的调节因子，在巨噬细胞的调节功能中发挥着重要作用[16]。
过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR-γ）是促炎基因的负调节因子，通过下调STAT、NFκB和AP-1的表达抑制M1型巨噬细胞极化，同时IL-4和IL-13也能诱导PPAR-γ的表达[17-18]。糖皮质激素受体的激活通过抑制AP-1和NF-κB的功能损害TLR4信号，最终抑制炎症信号[19]。Krüppel样因子（Krüppel-like factors，KLFs）是DNA结合转录调控因子锌指类的一个亚家族，KLF2和KLF4通过降低NF-κB的活性抑制细胞因子介导巨噬细胞活化[20]。小分子RNA（microRNAs，miRs）是一类调控RNA分子的家族，类似于RNA干扰的内源性介体，调节许多生理过程，包括凋亡、分化和免疫细胞的激活。转录调节因子C/EBPβ在TAMS中表达，并通过削弱对肿瘤细胞的细胞毒性免疫反应，促进M2样表型支持肿瘤生长。
鉴于巨噬细胞亚群及其产物在机体稳态中的重要性，巨噬细胞一直是科研人员深入研究的重要对象。巨噬细胞形态分化的主要控制点在转录水平上，上述途径已被确认为巨噬细胞亚型转变的必要调控途径。
2 氧化铁纳米颗粒
近年来利用纳米技术治疗癌症备受关注，众多的纳米粒子被开发为纳米药物，参与癌症等多种疾病的诊断和治疗[21]。利用纳米材料靶向免疫系统是非常热门的研究领域，而癌症治疗的关键问题是在靶向肿瘤部位的同时达到理想的药物浓度，在对肿瘤细胞进行杀伤的同时降低对正常细胞的伤害[22]。纳米粒子的免疫活性取决于其理化性质及随后的细胞内化，随着潜在因素的阐明，更多的纳米颗粒被用来设计和评估诱导免疫抑制和补充免疫抑制药物。磁性氧化铁纳米粒子作为一种具有独特磁学性质的纳米颗粒，在磁共振成像、靶向药物运输、磁性分离提纯、磁致发热治疗和基因治疗、诊断等生物医学方面表现出卓越的性能和巨大的发展潜力[23-24]。
2.1 磁共振成像
超顺磁性氧化铁纳米颗粒（superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs）作为磁共振造影剂被广泛用于肿瘤诊断、肿瘤定位及病变部位造影显示，如动脉粥样硬化斑块等。SPIONs同其他纳米颗粒一样，通过静脉注射后，最终会被肝脏、脾脏、淋巴结和骨髓中的巨噬细胞清除[25]。超小的超顺磁性氧化铁颗粒被聚集在炎症部位的单核巨噬细胞摄取后，可增强心血管磁共振成像效果以便分析心血管疾病的关键炎性成分，可提供关于心肌和血管疾病细胞炎症成分的有价值的额外信息[26]。随着研究的不断深入，其尺寸优势在磁共振成像上逐渐凸显出来，但是对造影成像后病变部位中巨噬细胞的变化还有待深入探究。
2.2 靶向运输
为了提高基于SPIONs的药物传递系统的靶向性，在表面进行涂层修饰成为首要考虑的方式。涂层/载体可以为输送系统提供合适的亲水性，使SPIONs易于在所需介质中分散，同时可提供进一步修饰的官能团，以此达到药物可控释放或肿瘤靶向性的目的[27]。Kono等[28]将SPIONs负载质粒DNA后改善了巨噬细胞在结肠的转运，能够治疗结肠炎性疾病，实现了巨噬细胞的磁化和工程化。Kang等[29]利用氧化铁纳米颗粒携带的球形神经团在外磁场作用下改善了干细胞向脑内的转运，促进了脑出血后功能的恢复，靶向递送神经细胞为脑出血开发了新的治疗策略。在磁性药物靶向中，SPIONs还可以通过外部磁场梯度引导到特定的靶侧，通过交变磁场诱导热疗或药物释放。磁性药物靶向通常是为了增强载有化疗药物的氧化铁纳米粒子的积聚和疗效，但因磁性药物靶向需要非常强的磁场才能在人体内成功应用，这增加了硬件设备的成本，限制了其临床应用。
2.3 磁致发热治疗
磁流体热疗是纳米技术和热疗相结合的一种新兴方法，具有高度的靶向性和特异性。通过静脉注射SPIONs的磁流体热疗引起的温度升高通常不足以激活机体免疫系统，这是因为纳米颗粒在肿瘤部位的局部浓度太低[30-31]。而磁性氧化铁纳米粒子暴露在交变磁场中会触发粒子的运动和局部加热，可导致纳米颗粒周围区域的组织损伤，并已应用于肿瘤治疗[32]。其主要原理是温度升高到42 ℃以上，蛋白质变性，导致细胞死亡[33]。交变磁场治疗被认为是一种控制SPIONs释放药物和诱导肿瘤热疗的方法，但交变磁场对巨噬细胞极化作用的研究还较少。
2.4 重编程巨噬细胞和免疫调节
在许多癌症中，TAMs主要表现为M2型巨噬细胞，促进肿瘤细胞的发展，因此将TAMs复极化为M1型巨噬细胞对肿瘤进行杀伤成为一种行之有效的癌症治疗策略。M2型巨噬细胞可在局部微环境发生改变的条件下迅速极化为M1型，而M1型巨噬细胞是通过NO和TNF-α直接杀死肿瘤细胞的效应细胞，可发挥抗肿瘤效应，其对M2型巨噬细胞的免疫活性起拮抗作用[34]。通过改变肿瘤组织中浸润巨噬细胞的亚型，可使细胞向促炎方向发展，抑制肿瘤的发生发展。
氧化铁纳米颗粒被证明具有药理学特性，通过加工修饰，改变了聚集的巨噬细胞的极化，如表1所示。含羧酸的氧化铁纳米颗粒与乳酸氧化酶结合提高了肿瘤微环境中M1巨噬细胞的比例；抗CD206抗体偶联的聚乳酸聚乙醇酸纳米粒（CD206-Fe3O4）能靶向结合M2巨噬细胞，并通过释放氧化铁颗粒将M2型巨噬细胞复极化为M1型巨噬细胞，增强了抗肿瘤效果；通过用透明质酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子（HIONs）对巨噬细胞进行人工重编程，实质性地改善了细胞固有免疫能力[35-37]。除此之外，带正电的SPION（S+）和带负电的SPION（S–）在体外均能有效地使M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞重新极化，并显著增强了巨噬细胞的芬顿效应和趋化作用，且S+具有更高的细胞摄取和巨噬细胞极化效应[38]。
表1
不同修饰的氧化铁纳米颗粒诱导巨噬细胞的靶点及效果
Table1.
Targets and effects of macrophages induced by different modified iron oxide nanoparticles
SPIONs的生物学效应可能是由于其氧化铁核心的固有特性，诱导ROS产生，调节细胞内氧化还原和铁的代谢。齐奥等[39]通过体内研究表明氧化铁纳米颗粒在被巨噬细胞吞噬后能够释放Fe2+，Fe2+与巨噬细胞中的H2O2发生芬顿反应生成OH·释放到细胞外，杀伤肿瘤细胞，即在体内通过诱导巨噬细胞产生ROS抑制肿瘤活性，促进肿瘤细胞的死亡。在SPIONs的诱导下，伴随着铁蛋白和组织蛋白酶L水平的增加，铁相关蛋白胞内水平和活性可能决定着巨噬细胞内铁浓度的改变，进而影响细胞亚型的分化[40]。将高表达膜铁转运蛋白的巨噬细胞作为铁的储存库，为体内靶向输送Fe3O4-NPs和铁离子提供基础，能够把Fe3O4纳米粒子和铁离子直接输送到肿瘤部位。CD86+、TNF-α、铁蛋白和组织蛋白酶L水平的上升标志着在SPIONs中铁的诱导下巨噬细胞M2表型可向M1表型转变。
由于氧化铁纳米颗粒优先在巨噬细胞内聚集，并且细胞内铁平衡对调节巨噬细胞极化状态的基因与蛋白表达至关重要，因此氧化铁纳米颗粒被认为是潜在的癌症治疗工具。铁在生物系统内以Fe2+和Fe3+两种形态存在并通过氧化还原反应相互转化，巨噬细胞作为铁代谢调节器控制着细胞内铁的输入和输出[41]。如图3所示，氧化铁纳米颗粒重编程巨噬细胞始于与细胞表面受体的相互作用，包括TLR、清道夫受体、FCγ受体（Fc γ receptors，FcγRs）和补体受体（complement receptor，CR）。同时氧化铁纳米颗粒与受体结合能够促进下游MAPK/mTOR级联和转录因子STATs、NF-κB和IRF的激活，进而激活免疫，促进炎症发生。巨噬细胞吞噬氧化铁纳米颗粒后，在溶酶体内降解后能够引发芬顿反应。同时PHD的氧合作用被抑制，促进转铁蛋白受体1和二价金属转运体1的表达[42]。
图3
氧化铁纳米颗粒诱导巨噬细胞的分子机制
Figure3.
Molecular mechanism of iron oxide nanoparticles inducing macrophages
由于氧化铁纳米颗粒越来越广泛地被应用于癌症诊断和治疗的临床实践，纳米颗粒对肿瘤微环境的影响具有直接而广泛的现实意义。磁性氧化铁纳米颗粒在神经再生领域也显示出巨大的研究价值，中空氧化铁纳米颗粒能有效地诱导巨噬细胞极化，促进神经干细胞的增殖和血管内皮细胞的迁移[43]。聚合物复合SPIONs作为磁共振造影剂能够在炎症诱导的细胞氧化还原条件下激活，得到炎症性疾病严重程度或分期的报告[44]。顺磁性纳米颗粒包裹的T细胞可以通过外加磁场聚集于T细胞受体，增加细胞之间的接触和沟通，增强肿瘤杀伤能力。体外磁场还可以引导过继转移的磁性纳米颗粒包被T细胞到体内的靶部位，从而显著提高细胞治疗的效率[45]。
氧化铁纳米颗粒的形态和大小是导致颗粒细胞毒性的主要因素，研究表明棒状氧化铁纳米颗粒比球形氧化铁纳米颗粒更具毒性[46]。氧化铁纳米颗粒诱导巨噬细胞释放IL-1β具有大小和剂量依赖性，聚乙二醇包被的10 nm氧化铁纳米颗粒显示出比30 nm更高的细胞摄取率，同时也有研究表明略大尺寸的氧化铁纳米颗粒更能干扰巨噬细胞炎性因子的释放。氧化铁纳米颗粒调节促炎巨噬细胞的作用并不一致，原因可归结于不同涂层修饰和尺寸大小，因此在其应用中考虑尺寸和涂层性能是至关重要的[47-48]。
3 总结与展望
纳米技术在癌症诊断、治疗和预防等领域中的应用愈来愈广泛，因纳米颗粒的物理和生物特性，使之与免疫细胞相互作用，成为肿瘤治疗的新兴手段。巨噬细胞作为异质性细胞群体在免疫系统中发挥着重要的作用，根据巨噬细胞的极化效应将之分为经典激活的M1型巨噬细胞和选择性激活的M2型巨噬细胞，且巨噬细胞的极化过程受多条信号通路的众多细胞因子调控。
氧化铁纳米颗粒作为癌症诊断和治疗的介质和载体，应用前景广泛，磁性氧化铁纳米粒子、SPIONs以及添加各种修饰的SPIONs等形态各异纳米颗粒的制备和修饰已在诸多实验研究中逐步成熟。探究氧化铁纳米颗粒对巨噬细胞极化的影响，并根据疾病发生的机制来研究氧化铁纳米颗粒对病变部位的影响机制有助于揭示氧化铁纳米颗粒的药效学基础。氧化铁纳米颗粒对巨噬细胞重新编程的能力使之成为癌症治疗的一个很有希望的候选者，但是基于氧化铁纳米颗粒对巨噬细胞进行重新编程的研究进展在很大程度上仍然是经验性的。
目前，将相关研究结果转移到临床上仍然存在许多困难和挑战，氧化铁纳米颗粒缺乏制备和研究的标准，同时面临试验条件的可变性，导致该研究领域发展较慢。不同修饰和不同涂层的氧化铁纳米颗粒的配方都是独特的，标准化生产和临床转化较为困难，且在进入临床阶段前还面临理化性质、安全性、给药途径药代动力学等众多挑战。在免疫系统中，纳米颗粒对巨噬细胞的固有免疫研究颇多，但针对有机体的适应性免疫方面的研究有待进一步深入。因此，应继续努力探索氧化铁纳米颗粒自身将巨噬细胞重新编程为M1样表型的能力与作用机制。目前，存在以下几个问题需要解决：① 氧化铁纳米颗粒从研究性制备到临床应用的转化。② 阐明氧化铁纳米颗粒重编程巨噬细胞后细胞功能调控机制变化，同时为调节其抗肿瘤功能提供策略。③ 研究氧化铁纳米颗粒的物化性质颗粒，以更大程度地发挥其自身的治疗效果。④ 研究氧化铁纳米颗粒重编程巨噬细胞是否可与其他免疫治疗策略联用作为免疫增强剂。结合上述问题展开研究将为完善氧化铁纳米颗粒的生物学效应提供新的策略和依据。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：张皓杰撰写论文初稿；张新雨和冯亚婵参与修改；杜朝和王英泽负责指导和修改；郭学玲负责审校。
