为探讨等离子体射流（PJ）和等离子体活化水（PAW）对变形链球菌（S. mutans）灭菌效果的影响并对比两者优劣，以便于为龋齿的等离子体治疗提供基础，丰富龋齿治疗手段，本文搭建了一种大气压等离子体激发系统，研究了不同激励电压（Ue）和不同激励时间（te）下，PJ和PAW对S. mutans灭菌率的影响及处理过程中温度和pH的变化。结果表明，在PJ处理中，当Ue = 7 kV且te = 60 s时，处理组与对照组之间S. mutans存活率的差异具有统计学意义（P = 0.007，d = 2.66），且在Ue = 8 kV，te = 120 s时，PJ处理可实现完全灭菌；而在PAW处理中，当Ue = 7 kV且te = 30 s时，处理组与对照组之间S. mutans存活率的差异具有统计学意义（P = 0.029，d = 1.71），且当Ue = 9 kV，te = 60 s时，PAW处理可实现完全灭菌。而对温度和pH的监测表明，PJ和PAW处理过程中最大温升不超过4.3 ℃，而PAW处理后的pH值最低会降至3.02。综合而言，PJ最佳灭菌参数为Ue = 8 kV且90 s < te ≤ 120 s，而PAW最佳灭菌参数为Ue = 9 kV且30 s＜te ≤ 60 s，二者均能实现对S. mutans的非热灭菌，其中PJ只需要更小的Ue就能实现完全灭菌，而在pH < 4.7时，PAW只需更短的te就能实现完全灭菌，但其酸性环境会对牙齿造成一定的化学损伤。本研究可为等离子体治疗龋齿提供一定的参考价值。
引用本文： 覃思, 王闰宁, 李虎, 范铠源, 王港, 张镱议. 等离子体射流和等离子体活化水对变形链球菌灭菌效果的研究. 生物医学工程学杂志, 2023, 40(3): 559-565. doi: 10.7507/1001-5515.202212030 复制
0 引言
龋齿是人类最常见的口腔疾病之一，严重危害人类身体健康。变形链球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）通常被认为是致龋过程中的关键病原体，它是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，会产生胞外多糖形成牙菌斑，并且还会与其它细菌联合作用产生乳酸为主的糖代谢产物引发龋齿[1-8]。目前主要的龋齿治疗手段无法完全清除细菌又或者存在一些副作用[9-12]。
等离子体射流（plasma jet，PJ）作为一种新型的灭菌技术引起了医学界广泛的关注，它可以在日常环境下激发，产生大量气相活性物质，将其通入水中后，各类气相活性物质又会与水溶液发生一系列物理化学反应，形成富含更多种类液相活性物质的水溶液，即等离子体活化水（plasma activated water，PAW），这些气相和液相活性物质统称为活性氧和氮物质（reactive oxygen and nitrogen species，RONS），它们具有杀灭微生物的能力并且优点众多[13-14]，因此在灭菌方面存在巨大潜能[15-16]，也为龋齿的无痛治疗提供了可能。
针对PJ和PAW对S. mutans灭菌效果影响的研究中，现有的研究大都采用稀有气体作为放电气体，如氦气（helium，He）、氩气（argon，Ar）或混合气体等[17-28]，通常仅研究固定参数下PJ或PAW单独作用的灭菌效果。考虑到临床上的副作用、经济效益以及具体选择PJ或PAW进行治疗的优劣问题，本文在已有研究的基础上，搭建了一种大气压等离子体激发系统，以空气作为放电气体，研究不同激励条件［激励电压（Ue）、激励时间（te）］下PJ和PAW处理后的温度、pH对S. mutans的物理化学影响并对比两者的灭菌效果，以期为等离子体治疗龋齿提供实践指导，并指明潜在风险。
1 材料与方法
1.1 大气压等离子体激发系统
本文搭建的大气压等离子体激发系统如图1所示，主要由等离子体反应器、高压交流电源、空气采集器和测量装置等部分组成。等离子体反应器采用同轴型针环放电结构，主要由高压电极、介质管和地极组成，其中高压电极为一根直径为2 mm的钨针，介质管为内径5 mm、外径7 mm、长度为110 mm的石英管，管外裹有铜箔并接地，等离子体射流激发区域位于钨针和铜箔覆盖的环隙之间；高压交流电源由低压直流电源和高频逆变器组成，产生的Ue范围为0~9 kV；空气采集器由无刷隔膜气泵（D50H-42H，成都海霖科技有限公司，中国）和流量计组成，提供空气作为放电气体，并将流速控制在3.5 L/min；测量装置由高压探头（P6015A，Tektronix，美国）和示波器（TDS2024C，Tektronix，美国）组成，用于监测实时电压波形。
图1
大气压等离子体激发系统
Figure1.
Atmospheric pressure plasma excitation system
1.2 等离子体射流和等离子体活化水的获取和使用
PJ处理实验中，在Ue = 0、7、8、9 kV下，使用等离子体反应器对空气进行te = 0、30、60、90、120 s的激发，在激发过程中直接对下方2 cm处脑心浸液琼脂（brain heart infusion agar，BHIA）培养基上的S. mutans进行处理。PAW处理实验中，在Ue = 0、7、8、9 kV下，使用等离子体反应器对9.9 mL去离子水进行te = 0、30、60、90、120 s的激活，然后将S. mutans菌液加入其中，摇匀浸泡处理10 min。
1.3 菌株和培养条件
首先将冷冻的S. mutans原液（ATCC25175，上海保藏生物技术中心，中国）解冻后，取0.1 mL原液加入3 mL无菌脑心浸液（brain heart infusion，BHI）培养基中，在37 ℃低氧条件下静置培养48 h，接着取其中的1 mL菌液加入至100 mL无菌BHI培养基中，在37 ℃有氧条件下振荡培养24 h，以菌落形成单位（colony forming units，CFU）计数法，获得108~109 CFU/mL浓度的菌液。
1.4 等离子体射流灭菌处理
将高浓度的菌液稀释至103~104 CFU/mL，各取0.1 mL菌液涂布于不同BHIA培养基上，将其分成以下3组：① 对照组：不作任何处理；② PJ处理Ⅰ组：在Ue = 0 kV、te = 120 s下，使用PJ直接处理；③ PJ处理Ⅱ组：在Ue = 7、8、9 kV，te = 30、60、90、120 s下，使用PJ直接处理。
1.5 等离子体活化水灭菌处理
将高浓度的菌液稀释至106~107 CFU/mL，各取0.1 mL菌液分成以下3组：① 对照组：9.9 mL去离子水浸泡处理；② PAW处理Ⅰ组：在Ue = 0 kV，te = 120 s下，使用9.9 mL的PAW浸泡处理；③ PAW处理Ⅱ组：在Ue = 7、8、9 kV，te = 30、60、90、120 s下，使用9.9 mL的PAW浸泡处理。处理完成后分别取0.1 mL混合液涂布于BHIA培养基上。
1.6 温度和pH测量
首先使用热成像仪（UTi120S，优利德科技股份有限公司，中国）监测不同Ue下PJ和PAW处理区域在te = 0、120 s时的热成像图，然后通过热成像图左上角数据记录te = 0 s时的温度T1以及te = 120 s时的温度T2，并计算前后温差∆T = T2 − T1，用于定量分析PJ和PAW对S. mutans和牙齿的物理影响；使用pH计测量不同激励条件下PAW的pH值，用于定量评估PAW对S. mutans和牙齿的化学影响。
1.7 菌落形成单位计数和灭菌率计算
将PJ和PAW处理后的BHIA培养基放入37 ℃恒温箱中，静置培养12 h后进行CFU计数，然后计算出相应的灭菌率，如式（1）所示，并绘制灭菌率变化曲线，通过灭菌率定量分析PJ和PAW对S. mutans的灭菌效果。
 |
其中，RS为灭菌率，NC为对照组菌落数，NT为实验组菌落数。
1.8 统计学分析
统计学分析采用统计产品与服务解决方案软件SPSS 26.0（SPSS Inc.，美国），采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）考察不同激励条件下PJ和PAW处理组与对照组之间S. mutans细胞浓度或存活率的差异是否具有统计学意义，事后多重比较采用最小显著差异法（least significant difference，LSD）检验，P < 0.05表示差异具有统计学意义，效应值大小由科恩d值（Cohen’s d）（简称d值）衡量。
2 结果与讨论
2.1 温度监测结果
不同Ue下，PJ和PAW处理区域在te = 0、120 s的热成像图如图2所示。既往的研究表明，等离子体放电具有热效应，且S. mutans只有在超过60 ℃时才会失活[29-32]。
图2
不同Ue下PJ和PAW处理区域在te = 0、120 s的热成像图
Figure2.
Thermograms of PJ and PAW treatment regions at te = 0, 120 s under different Ue
在PJ处理区域中，不同Ue下PJ处理后，∆T > 0 ℃，且随着Ue的增大，|∆T|逐渐增大，在Ue = 9 kV时，前后温差最大值|∆T|max = 4.3 ℃。当Ue = 7、8、9 kV时，处理区域的温度T2分别为26.8、30.2、33.9 ℃，均小于60 ℃，不会导致S. mutans死亡，而牙齿能够耐受的温度范围为10～50 ℃，T2最小值T2min = 26.8 ℃>10 ℃且T2最大值T2max = 33.9 ℃<50 ℃，所以不会对牙齿造成物理损伤。
在PAW处理区域中，不同Ue下PAW处理后∆T < 0 ℃，且随着Ue的增大，|∆T|逐渐减小，这是由于Ue较小时，气泡使PAW在处理过程中散发的热量大于热效应增加的热量，在Ue = 7 kV时，|∆T|max = 3.9 ℃。当Ue = 7、8、9 kV时，处理区域的温度T2分别为29.0、30.3、33.2 ℃，均小于60 ℃，不会导致S. mutans死亡，由于T2min = 29.0 ℃ > 10 ℃且T2max = 33.2 ℃ < 50 ℃，所以也不会对牙齿造成物理损伤。
由此可见，PJ和PAW在处理过程中引起的微小温度变化不会导致S. mutans死亡，并且其处理区域的最低温度T2min和最高温度T2max都在牙齿的耐受范围内，所以不会对牙齿造成物理损伤。
2.2 pH测量结果
不同Ue下PAW的pH值随te的变化情况如图3所示。既往的研究表明，S. mutans具有产酸和耐酸的特性，pH低于3时才会造成其死亡[33]。由图3可知，PAW的pH值随着Ue和te的增加呈现逐渐降低的趋势，当Ue = 9 kV，te = 120 s时，PAW的最低pH=3.02 > 3，不会导致S. mutans死亡，而牙釉质脱矿的临界pH值约为5.5。由图3可知，在以下3种情况：① Ue = 7 kV且te > 90 s；② Ue = 8 kV且te > 60 s；③ Ue = 9 kV且te > 30 s时，相应的pH < 5.5，会对牙齿造成一定的腐蚀，因此PAW处理过程中引起的pH值变化不会导致S. mutans死亡，但会对牙齿表面产生一定的化学损伤。
图3
不同Ue下PAW的pH值随te的变化情况
Figure3.
Variation of pH value of PAW with te at different Ue
2.3 等离子体射流和等离子体活化水灭菌实验结果
不同Ue下PJ和PAW处理后的灭菌情况和细胞浓度（te = 120 s）如图4、图5所示。由图4和图5可知，在Ue = 0 kV时，通过LSD检验可知，处理组与对照组之间S. mutans细胞浓度的差异都不具有统计学意义（PJ处理Ⅰ组：P = 0.911；PAW处理Ⅰ组：P = 0.203）；而在Ue = 7、8、9 kV时，S. mutans细胞浓度都不同程度地减少，通过LSD检验可知，处理组与对照组之间S. mutans细胞浓度的差异均具有统计学意义（P < 0.001，PJ处理Ⅱ组：d = 4.31、15.98、15.98；PAW处理Ⅱ组：d = 4.38、10.07、12.08）。由此可见，在Ue = 0 kV下，空气激发的PJ和PAW处理后均不会导致S. mutans死亡。
图4
不同Ue下PJ和PAW处理后的灭菌情况（te = 120 s）
Figure4.
Sterilization after PJ and PAW treatment at different Ue (te = 120 s)
图5
不同Ue下PJ和PAW处理后的细胞浓度（te = 120 s）
Figure5.
Cell concentration after PJ and PAW treatment at different Ue (te = 120 s)
不同Ue下PJ和PAW灭菌率随te的变化情况如图6所示。由图6可知，PJ和PAW的灭菌率随Ue和te的增大都呈现逐渐升高的趋势。
图6
不同Ue下PJ和PAW灭菌率随te的变化情况
Figure6.
Variation of PJ and PAW sterilization rate with te at different Ue
在PJ处理实验中，当Ue = 7 kV且te = 60 s时，通过LSD检验可知，处理组与对照组之间S. mutans存活率的差异具有统计学意义（P = 0.007，d = 2.66），并且随着Ue和te的增加，PJ对S. mutans的灭菌效果逐渐增强。在Ue ≥ 8 kV且te ≥ 30 s时，灭菌率的变化趋势逐渐趋于平缓，当Ue = 8 kV，te = 120 s时，PJ处理可实现完全灭菌，由此可知PJ灭菌的最佳激励电压Ue = 8 kV，最佳激励时间90 s < te ≤ 120 s。
在PAW处理实验中，当Ue = 7 kV且te = 30 s时，通过LSD检验可知，处理组与对照组之间S. mutans存活率的差异具有统计学意义（P = 0.029，d = 1.71），并且随着Ue和te的增加，PAW对S. mutans的灭菌效果逐渐增强。在Ue ≥ 9 kV且te ≥ 30 s时，灭菌率的变化趋势逐渐趋于平缓，当Ue = 9 kV，te = 60 s时，PAW处理可实现完全灭菌，由此可知本实验中PAW灭菌的最佳激励电压Ue = 9 kV，最佳激励时间30 s < te ≤ 60 s。
由图6还可知，当Ue较低（即Ue = 7 kV）时，PJ和PAW的最高灭菌率均在40%左右，这主要是因为本系统激发等离子体的临界电压为7 kV左右，此时激发产生的RONS数量十分有限，导致灭菌率较低。而当Ue升高到8 kV后，PJ的灭菌率在短暂的te = 30 s内便快速到达94%以上，而PAW在te <120 s时，PAW的灭菌率均低于90%，且对应的pH值均大于4.7，但当pH值低于4.7时，PAW的灭菌率均在90%以上，说明确实存在pH值约为4.7的快速灭菌临界值，这与既往的研究一致[34-35]。当Ue升高到一定程度后，灭菌率逐渐饱和，这是由于RONS到达完全灭菌的最大需求量，灭菌率由于细菌数量接近检出限而趋于饱和。
由此可见，PJ和PAW均对S. mutans具有较强的杀灭作用，且灭菌效果随Ue、te的增大而逐渐增大，其中PJ只需要更小的Ue就能实现完全灭菌，而PAW则存在明显的过渡过程，表现出对pH值强烈的依赖性。
3 结论
本文搭建了一个大气压等离子体激发系统，以空气作为放电气体，对比研究了不同激励条件下PJ和PAW处理后的温度、pH对S. mutans的物理化学影响以及相应的灭菌效果。本文的主要研究结论如下：
（1）PJ和PAW处理过程中最大温升不超过4.3 ℃，此温升不会导致S. mutans死亡，也不会对牙齿表面造成物理损伤，对S. mutans的成功灭活是低温等离子体中活性基团作用的结果，从而实现了对S. mutans的非热灭菌处理。
（2）PAW处理后的最低pH值为3.02，该酸性环境不会导致S. mutans死亡，但会对牙齿表面造成一定的化学损伤，为实践应用指明了潜在风险和应注意的问题。
（3）PJ和PAW均对S. mutans具有较强的杀灭作用，且PJ和PAW的灭菌率均与Ue和te呈正相关，当Ue = 8 kV，te = 120 s时，PJ处理后可实现完全灭菌；当Ue = 9 kV，te = 60 s时，PAW处理后可实现完全灭菌。
（4）PJ的最佳灭菌参数为Ue = 8 kV且90 s < te ≤ 120 s，而PAW的最佳灭菌参数为Ue = 9 kV且30 s < te ≤ 60 s，其中PJ只需要更小的Ue就能实现完全灭菌，而PAW对pH值存在一定的依赖性，约在pH为4.7以下，PAW灭菌率在很短的te内显著提升。
此外，相比于Emi等[17]，Ye等[18]和Li等[19]的研究，首先本研究所设计的大气压等离子体激发系统实现完全灭菌所需的总处理时间更短，节省了一定的时间成本，其次本文给出了PJ和PAW最佳灭菌参数的范围，为具体实践应用提供了参考值，最后本文增加了对PJ和PAW在处理过程中温度和pH变化的研究，为PJ和PAW的实际应用指明了一些潜在的风险。在后续的研究中，可结合本文所获得的研究结果，进一步对激发参数和处理过程进行优化，实现更为理想的灭菌效果并规避处理过程中的潜在危害，同时可对PJ和PAW中活性成分的作用机制进行更深入的探讨。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：覃思和王闰宁参与论文的选题、实验以及论文初稿的撰写，李虎负责实验方案的优化，范铠源负责实验设备的搭建，王港负责论文审校，张镱议为论文提供了资助和支持。
0 引言
龋齿是人类最常见的口腔疾病之一，严重危害人类身体健康。变形链球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）通常被认为是致龋过程中的关键病原体，它是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，会产生胞外多糖形成牙菌斑，并且还会与其它细菌联合作用产生乳酸为主的糖代谢产物引发龋齿[1-8]。目前主要的龋齿治疗手段无法完全清除细菌又或者存在一些副作用[9-12]。
等离子体射流（plasma jet，PJ）作为一种新型的灭菌技术引起了医学界广泛的关注，它可以在日常环境下激发，产生大量气相活性物质，将其通入水中后，各类气相活性物质又会与水溶液发生一系列物理化学反应，形成富含更多种类液相活性物质的水溶液，即等离子体活化水（plasma activated water，PAW），这些气相和液相活性物质统称为活性氧和氮物质（reactive oxygen and nitrogen species，RONS），它们具有杀灭微生物的能力并且优点众多[13-14]，因此在灭菌方面存在巨大潜能[15-16]，也为龋齿的无痛治疗提供了可能。
针对PJ和PAW对S. mutans灭菌效果影响的研究中，现有的研究大都采用稀有气体作为放电气体，如氦气（helium，He）、氩气（argon，Ar）或混合气体等[17-28]，通常仅研究固定参数下PJ或PAW单独作用的灭菌效果。考虑到临床上的副作用、经济效益以及具体选择PJ或PAW进行治疗的优劣问题，本文在已有研究的基础上，搭建了一种大气压等离子体激发系统，以空气作为放电气体，研究不同激励条件［激励电压（Ue）、激励时间（te）］下PJ和PAW处理后的温度、pH对S. mutans的物理化学影响并对比两者的灭菌效果，以期为等离子体治疗龋齿提供实践指导，并指明潜在风险。
1 材料与方法
1.1 大气压等离子体激发系统
本文搭建的大气压等离子体激发系统如图1所示，主要由等离子体反应器、高压交流电源、空气采集器和测量装置等部分组成。等离子体反应器采用同轴型针环放电结构，主要由高压电极、介质管和地极组成，其中高压电极为一根直径为2 mm的钨针，介质管为内径5 mm、外径7 mm、长度为110 mm的石英管，管外裹有铜箔并接地，等离子体射流激发区域位于钨针和铜箔覆盖的环隙之间；高压交流电源由低压直流电源和高频逆变器组成，产生的Ue范围为0~9 kV；空气采集器由无刷隔膜气泵（D50H-42H，成都海霖科技有限公司，中国）和流量计组成，提供空气作为放电气体，并将流速控制在3.5 L/min；测量装置由高压探头（P6015A，Tektronix，美国）和示波器（TDS2024C，Tektronix，美国）组成，用于监测实时电压波形。
图1
大气压等离子体激发系统
Figure1.
Atmospheric pressure plasma excitation system
1.2 等离子体射流和等离子体活化水的获取和使用
PJ处理实验中，在Ue = 0、7、8、9 kV下，使用等离子体反应器对空气进行te = 0、30、60、90、120 s的激发，在激发过程中直接对下方2 cm处脑心浸液琼脂（brain heart infusion agar，BHIA）培养基上的S. mutans进行处理。PAW处理实验中，在Ue = 0、7、8、9 kV下，使用等离子体反应器对9.9 mL去离子水进行te = 0、30、60、90、120 s的激活，然后将S. mutans菌液加入其中，摇匀浸泡处理10 min。
1.3 菌株和培养条件
首先将冷冻的S. mutans原液（ATCC25175，上海保藏生物技术中心，中国）解冻后，取0.1 mL原液加入3 mL无菌脑心浸液（brain heart infusion，BHI）培养基中，在37 ℃低氧条件下静置培养48 h，接着取其中的1 mL菌液加入至100 mL无菌BHI培养基中，在37 ℃有氧条件下振荡培养24 h，以菌落形成单位（colony forming units，CFU）计数法，获得108~109 CFU/mL浓度的菌液。
1.4 等离子体射流灭菌处理
将高浓度的菌液稀释至103~104 CFU/mL，各取0.1 mL菌液涂布于不同BHIA培养基上，将其分成以下3组：① 对照组：不作任何处理；② PJ处理Ⅰ组：在Ue = 0 kV、te = 120 s下，使用PJ直接处理；③ PJ处理Ⅱ组：在Ue = 7、8、9 kV，te = 30、60、90、120 s下，使用PJ直接处理。
1.5 等离子体活化水灭菌处理
将高浓度的菌液稀释至106~107 CFU/mL，各取0.1 mL菌液分成以下3组：① 对照组：9.9 mL去离子水浸泡处理；② PAW处理Ⅰ组：在Ue = 0 kV，te = 120 s下，使用9.9 mL的PAW浸泡处理；③ PAW处理Ⅱ组：在Ue = 7、8、9 kV，te = 30、60、90、120 s下，使用9.9 mL的PAW浸泡处理。处理完成后分别取0.1 mL混合液涂布于BHIA培养基上。
1.6 温度和pH测量
首先使用热成像仪（UTi120S，优利德科技股份有限公司，中国）监测不同Ue下PJ和PAW处理区域在te = 0、120 s时的热成像图，然后通过热成像图左上角数据记录te = 0 s时的温度T1以及te = 120 s时的温度T2，并计算前后温差∆T = T2 − T1，用于定量分析PJ和PAW对S. mutans和牙齿的物理影响；使用pH计测量不同激励条件下PAW的pH值，用于定量评估PAW对S. mutans和牙齿的化学影响。
1.7 菌落形成单位计数和灭菌率计算
将PJ和PAW处理后的BHIA培养基放入37 ℃恒温箱中，静置培养12 h后进行CFU计数，然后计算出相应的灭菌率，如式（1）所示，并绘制灭菌率变化曲线，通过灭菌率定量分析PJ和PAW对S. mutans的灭菌效果。
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其中，RS为灭菌率，NC为对照组菌落数，NT为实验组菌落数。
1.8 统计学分析
统计学分析采用统计产品与服务解决方案软件SPSS 26.0（SPSS Inc.，美国），采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）考察不同激励条件下PJ和PAW处理组与对照组之间S. mutans细胞浓度或存活率的差异是否具有统计学意义，事后多重比较采用最小显著差异法（least significant difference，LSD）检验，P < 0.05表示差异具有统计学意义，效应值大小由科恩d值（Cohen’s d）（简称d值）衡量。
2 结果与讨论
2.1 温度监测结果
不同Ue下，PJ和PAW处理区域在te = 0、120 s的热成像图如图2所示。既往的研究表明，等离子体放电具有热效应，且S. mutans只有在超过60 ℃时才会失活[29-32]。
图2
不同Ue下PJ和PAW处理区域在te = 0、120 s的热成像图
Figure2.
Thermograms of PJ and PAW treatment regions at te = 0, 120 s under different Ue
在PJ处理区域中，不同Ue下PJ处理后，∆T > 0 ℃，且随着Ue的增大，|∆T|逐渐增大，在Ue = 9 kV时，前后温差最大值|∆T|max = 4.3 ℃。当Ue = 7、8、9 kV时，处理区域的温度T2分别为26.8、30.2、33.9 ℃，均小于60 ℃，不会导致S. mutans死亡，而牙齿能够耐受的温度范围为10～50 ℃，T2最小值T2min = 26.8 ℃>10 ℃且T2最大值T2max = 33.9 ℃<50 ℃，所以不会对牙齿造成物理损伤。
在PAW处理区域中，不同Ue下PAW处理后∆T < 0 ℃，且随着Ue的增大，|∆T|逐渐减小，这是由于Ue较小时，气泡使PAW在处理过程中散发的热量大于热效应增加的热量，在Ue = 7 kV时，|∆T|max = 3.9 ℃。当Ue = 7、8、9 kV时，处理区域的温度T2分别为29.0、30.3、33.2 ℃，均小于60 ℃，不会导致S. mutans死亡，由于T2min = 29.0 ℃ > 10 ℃且T2max = 33.2 ℃ < 50 ℃，所以也不会对牙齿造成物理损伤。
由此可见，PJ和PAW在处理过程中引起的微小温度变化不会导致S. mutans死亡，并且其处理区域的最低温度T2min和最高温度T2max都在牙齿的耐受范围内，所以不会对牙齿造成物理损伤。
2.2 pH测量结果
不同Ue下PAW的pH值随te的变化情况如图3所示。既往的研究表明，S. mutans具有产酸和耐酸的特性，pH低于3时才会造成其死亡[33]。由图3可知，PAW的pH值随着Ue和te的增加呈现逐渐降低的趋势，当Ue = 9 kV，te = 120 s时，PAW的最低pH=3.02 > 3，不会导致S. mutans死亡，而牙釉质脱矿的临界pH值约为5.5。由图3可知，在以下3种情况：① Ue = 7 kV且te > 90 s；② Ue = 8 kV且te > 60 s；③ Ue = 9 kV且te > 30 s时，相应的pH < 5.5，会对牙齿造成一定的腐蚀，因此PAW处理过程中引起的pH值变化不会导致S. mutans死亡，但会对牙齿表面产生一定的化学损伤。
图3
不同Ue下PAW的pH值随te的变化情况
Figure3.
Variation of pH value of PAW with te at different Ue
2.3 等离子体射流和等离子体活化水灭菌实验结果
不同Ue下PJ和PAW处理后的灭菌情况和细胞浓度（te = 120 s）如图4、图5所示。由图4和图5可知，在Ue = 0 kV时，通过LSD检验可知，处理组与对照组之间S. mutans细胞浓度的差异都不具有统计学意义（PJ处理Ⅰ组：P = 0.911；PAW处理Ⅰ组：P = 0.203）；而在Ue = 7、8、9 kV时，S. mutans细胞浓度都不同程度地减少，通过LSD检验可知，处理组与对照组之间S. mutans细胞浓度的差异均具有统计学意义（P < 0.001，PJ处理Ⅱ组：d = 4.31、15.98、15.98；PAW处理Ⅱ组：d = 4.38、10.07、12.08）。由此可见，在Ue = 0 kV下，空气激发的PJ和PAW处理后均不会导致S. mutans死亡。
图4
不同Ue下PJ和PAW处理后的灭菌情况（te = 120 s）
Figure4.
Sterilization after PJ and PAW treatment at different Ue (te = 120 s)
图5
不同Ue下PJ和PAW处理后的细胞浓度（te = 120 s）
Figure5.
Cell concentration after PJ and PAW treatment at different Ue (te = 120 s)
不同Ue下PJ和PAW灭菌率随te的变化情况如图6所示。由图6可知，PJ和PAW的灭菌率随Ue和te的增大都呈现逐渐升高的趋势。
图6
不同Ue下PJ和PAW灭菌率随te的变化情况
Figure6.
Variation of PJ and PAW sterilization rate with te at different Ue
在PJ处理实验中，当Ue = 7 kV且te = 60 s时，通过LSD检验可知，处理组与对照组之间S. mutans存活率的差异具有统计学意义（P = 0.007，d = 2.66），并且随着Ue和te的增加，PJ对S. mutans的灭菌效果逐渐增强。在Ue ≥ 8 kV且te ≥ 30 s时，灭菌率的变化趋势逐渐趋于平缓，当Ue = 8 kV，te = 120 s时，PJ处理可实现完全灭菌，由此可知PJ灭菌的最佳激励电压Ue = 8 kV，最佳激励时间90 s < te ≤ 120 s。
在PAW处理实验中，当Ue = 7 kV且te = 30 s时，通过LSD检验可知，处理组与对照组之间S. mutans存活率的差异具有统计学意义（P = 0.029，d = 1.71），并且随着Ue和te的增加，PAW对S. mutans的灭菌效果逐渐增强。在Ue ≥ 9 kV且te ≥ 30 s时，灭菌率的变化趋势逐渐趋于平缓，当Ue = 9 kV，te = 60 s时，PAW处理可实现完全灭菌，由此可知本实验中PAW灭菌的最佳激励电压Ue = 9 kV，最佳激励时间30 s < te ≤ 60 s。
由图6还可知，当Ue较低（即Ue = 7 kV）时，PJ和PAW的最高灭菌率均在40%左右，这主要是因为本系统激发等离子体的临界电压为7 kV左右，此时激发产生的RONS数量十分有限，导致灭菌率较低。而当Ue升高到8 kV后，PJ的灭菌率在短暂的te = 30 s内便快速到达94%以上，而PAW在te <120 s时，PAW的灭菌率均低于90%，且对应的pH值均大于4.7，但当pH值低于4.7时，PAW的灭菌率均在90%以上，说明确实存在pH值约为4.7的快速灭菌临界值，这与既往的研究一致[34-35]。当Ue升高到一定程度后，灭菌率逐渐饱和，这是由于RONS到达完全灭菌的最大需求量，灭菌率由于细菌数量接近检出限而趋于饱和。
由此可见，PJ和PAW均对S. mutans具有较强的杀灭作用，且灭菌效果随Ue、te的增大而逐渐增大，其中PJ只需要更小的Ue就能实现完全灭菌，而PAW则存在明显的过渡过程，表现出对pH值强烈的依赖性。
3 结论
本文搭建了一个大气压等离子体激发系统，以空气作为放电气体，对比研究了不同激励条件下PJ和PAW处理后的温度、pH对S. mutans的物理化学影响以及相应的灭菌效果。本文的主要研究结论如下：
（1）PJ和PAW处理过程中最大温升不超过4.3 ℃，此温升不会导致S. mutans死亡，也不会对牙齿表面造成物理损伤，对S. mutans的成功灭活是低温等离子体中活性基团作用的结果，从而实现了对S. mutans的非热灭菌处理。
（2）PAW处理后的最低pH值为3.02，该酸性环境不会导致S. mutans死亡，但会对牙齿表面造成一定的化学损伤，为实践应用指明了潜在风险和应注意的问题。
（3）PJ和PAW均对S. mutans具有较强的杀灭作用，且PJ和PAW的灭菌率均与Ue和te呈正相关，当Ue = 8 kV，te = 120 s时，PJ处理后可实现完全灭菌；当Ue = 9 kV，te = 60 s时，PAW处理后可实现完全灭菌。
（4）PJ的最佳灭菌参数为Ue = 8 kV且90 s < te ≤ 120 s，而PAW的最佳灭菌参数为Ue = 9 kV且30 s < te ≤ 60 s，其中PJ只需要更小的Ue就能实现完全灭菌，而PAW对pH值存在一定的依赖性，约在pH为4.7以下，PAW灭菌率在很短的te内显著提升。
此外，相比于Emi等[17]，Ye等[18]和Li等[19]的研究，首先本研究所设计的大气压等离子体激发系统实现完全灭菌所需的总处理时间更短，节省了一定的时间成本，其次本文给出了PJ和PAW最佳灭菌参数的范围，为具体实践应用提供了参考值，最后本文增加了对PJ和PAW在处理过程中温度和pH变化的研究，为PJ和PAW的实际应用指明了一些潜在的风险。在后续的研究中，可结合本文所获得的研究结果，进一步对激发参数和处理过程进行优化，实现更为理想的灭菌效果并规避处理过程中的潜在危害，同时可对PJ和PAW中活性成分的作用机制进行更深入的探讨。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：覃思和王闰宁参与论文的选题、实验以及论文初稿的撰写，李虎负责实验方案的优化，范铠源负责实验设备的搭建，王港负责论文审校，张镱议为论文提供了资助和支持。
