针对传统超声设备存在的交叉污染、样本破碎不均匀等问题，本文研制了一种小型化、低成本的高强度聚焦超声装置。该装置通过凹球面自聚焦型压电陶瓷片产生超声波，在聚焦区域形成空化效应，实现样本裂解。首先，本文通过物理仿真证明装置的可行性，然后制作功率可调的驱动电路，实现0～22.4 W声功率输出，最后进行石蜡包埋样本脱蜡实验验证装置的有效性。实验结果表明，高强度聚焦超声装置的脱蜡效率和安全性明显优于传统化学方法，与商用超声仪器具有可比性。综上，本文研发的高强度聚焦超声装置有望应用于自动化核酸提取和纯化设备中，在样本前处理领域具有广阔的应用前景。
引用本文： 雷祝兵, 庞欣佩, 李力, 梅茜, 董文飞. 用于生物样品处理的高强度聚焦超声装置开发研究. 生物医学工程学杂志, 2024, 41(1): 152-159. doi: 10.7507/1001-5515.202304061 复制
0 引言
超声波是指频率超过20 kHz的机械波，被广泛应用于疾病诊断、癌症治疗、药物递送等医学领域[1-5]。利用超声波产生的空化效应，可实现细胞破碎、组织匀浆等功能，因此超声技术可用于处理复杂的生物样本[6]。目前市场上的超声波破碎仪大多属于接触式，需要将换能器浸入样本溶液。该方式存在以下缺陷：每次实验需要清洗换能器，无法彻底规避交叉污染的风险；样本溶液中声压分布不均匀，不利于实验的可重复性；换能器工作产生的热量直接传递到样本溶液中，影响实验结果。
由于传统接触式超声仪器存在以上不足，非接触式超声技术开始受到研究者重视。乔龙学等[7]设计了一种非接触式超声裂解系统，但是该系统机械结构复杂，体积较大。Holmes等[8]在凹球面上固定多个换能器，产生聚焦超声，实现从组织中快速提取核酸。Bigelow等[9]通过高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound，HIFU）技术裂解微藻。Bomsztyk等[10]将HIFU技术应用于表观遗传学。目前，市面上的聚焦超声仪器较少，且价格昂贵，如非接触式超声波破碎仪M220（Covaris Inc.，美国）（以下全文简称M220），不利于集成到自动化、便携式设备中。
针对以上问题，本文研制了一种小型化、低成本的HIFU装置。该装置通过凹球面自聚焦型压电陶瓷片发射超声波，在聚焦区域产生空化效应，实现样本裂解。本研究通过物理场仿真验证该装置的可行性，并设计了能够稳定驱动换能器的功率放大电路。最后利用HIFU装置处理小鼠肺部的石蜡包埋福尔马林浸泡（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）样本，并与二甲苯脱蜡法、商用仪器M220进行对比，测试装置的有效性。
1 方法
1.1 换能器选型
HIFU换能器的工作频率通常在100 kHz～10 MHz，为选择合适的换能器，本文通过声学频域仿真，定性分析声场与频率之间的关系。首先建立HIFU声场的二维对称仿真模型，如图1所示，R轴为径向轴，Z轴为垂直轴；仿真区域为换能器、水域，模型外围添加完美匹配层，匹配层的边界设置为硬声场边界；固定频率以外的条件，设换能器的聚焦半径r为38 mm，外半径r’为19 mm，向内法向位移为100 nm；分别设置频率f为100 kHz、500 kHz、1 MHz、2 MHz，仿真计算得到的结果如图1所示。聚焦区域呈梭形分布，其范围大小与频率呈负相关；f=100 kHz时，最大绝对压强仅0.3 MPa；而f=2 MHz时，最大绝对压强为80.0 MPa；该结果表明，频率越高，能量越集中。因此，使用HIFU技术处理生物样品时，需根据样品和容器的体积与结构，选择合适的换能器。
图1
不同工作频率下HIFU换能器的声场仿真
Figure1.
Acoustic field simulation of HIFU transducers with different operating frequencies
本研究的生物样品处理实验中，样品体积为0.5～1.5 mL，容器采用2.0 mL离心管(T2-EP0200-B-N-S-ZX，上海泰坦科技股份有限公司，中国)，其底部直径约10 mm。市面上工作频率高于2 MHz的换能器的尺寸比仿真模型更小，聚焦区域偏小，不适用于本研究。由于需同时考虑到换能器装配、防水等问题，故选用中心无开孔、凹面电极引至凸面的换能器。综合以上因素，本文采用谐振频率为500 kHz的换能器，其聚焦半径为67 mm，外半径为30 mm。
1.2 HIFU装置
本研究设计的HIFU装置的结构和实物如图2所示，主要包括顶盖、水槽、换能器和底盖，长、宽、高分别为75、87、120 mm。水槽通过三维打印技术加工，顶盖作为试管的夹具，容器为2.0 mL离心管，内部装有待处理的生物样本；水槽内部装有去离子水，作为超声波传输的媒介；侧边有矩形窗口，粘贴透明亚克力板，便于观察实验现象；下方接口处安装卡扣配合型连接器（bayonet nut connector，BNC）母座；用防水密封胶将换能器固定于水槽底部，正负电极与BNC母座连接，最后经射频传输线连接到电路板。
图2
HIFU装置的示意图
Figure2.
The diagram of HIFU device
对上述装置进行物理场仿真，定性分析结构的可行性。首先建立二维仿真模型，如图3所示，底部的曲线为换能器，向内法向位移为100 nm；聚焦区域放置2.0 mL离心管，材质为聚丙烯；其余部分均为水；模型边界添加完美匹配层；环境的初始温度设为20 ℃。
图3
HIFU装置的物理场仿真
Figure3.
The physics field simulation of HIFU device
通过声学频域仿真，计算绝对压强，结果如图3所示，试管中间区域的绝对压强较大，最大约9.6 MPa，然而试管底部同样具有较高的压强。然后，进行固体和流体传热的时域仿真，热源Q的计算，如式(1)所示：
 |
其中，I为声学仿真计算的声强，α为材料的吸声系数[11]。热源持续5 min，得到如图3所示的温度分布图。试管底部温度最高，升高约10 ℃，试管内部温度上升3～9 ℃。
通过仿真实验可知，超声波主要聚集在试管内部，能够用于样本处理。试管内部温升较小，有利于生物实验，如保持酶的活性、核酸完整性等。但是2.0 mL离心管底部吸收声能发热，因此会对仪器的性能有所限制。
1.3 驱动电路
1.3.1 电路设计
HIFU换能器为容性器件，在谐振频率点处的阻抗幅值最小[12]。换能器的驱动电路可分为线性型和开关型，由于线性型放大电路工作效率低[13]，故大功率应用中基本采用开关型电路，主要有以下几种：双极性半桥型D类功放[14-17]、多极性阶梯型D类功放[18-22]、变压器耦合型D类功放[23]和E类功率放大电路[24-25]。本文基于变压器耦合型D类功率放大电路进行设计，开发的驱动电路如图4所示。
图4
驱动电路与相关波形
Figure4.
Driving circuit and related waveforms
功率放大部分采用推挽式结构，其中数字可调电源供电电压（volt current condenser，VCC）为电路提供能量，型号为DKP6012（深圳寰球信瑞电子科技有限公司，中国）；Q1和Q2（IRF610, Infineon Technologies Inc., 德国）为具有低导通电阻、低输入电容和高耐压值的N型金属氧化物半导体场效应晶体管（metal oxide semiconductor field effect transistor，MOSFET）；栅极驱动器1和2用于驱动MOSFET，可提高开关速率，降低功率损耗；瞬态抑制二极管D1和D2用于吸收因变压器漏感引起的电压尖峰，保护Q1和Q2；T1为高频环形变压器，磁环材质为镍锌铁氧体，两初级线圈和次级线圈的匝数比为5:5:10。
电路的基本工作原理为：Q2导通，Q1关闭时，电流从VCC经变压器流向Q2，负载两端产生正感应电压；Q1导通，Q2关闭时，负载两端产生负感应电压；以500 kHz频率交替导通Q1和Q2，即可在负载两端产生500 kHz的方波。
1.3.2 谐波抑制
直接用方波驱动HIFU换能器会产生较大的奇数次谐波，Tang等[23]提出了一种抑制三次谐波的方法，并指出更高阶次的谐波会因换能器的带通特性被滤除，然而Tang等[23]设计的电路需两套推挽电路配合工作，结构复杂、成本高。本文基于STM32单片机（STM32F103C8T6，意法半导体，意大利），以低成本方案实现谐波抑制功能。
本文设计的信号源如图4所示，单片机的高级定时器1产生互补输出的一对脉冲宽度调制（pulse width modulation，PWM）波形，记作SigA和SigB，其中定时器1的配置参数如表1所示。普通定时器产生的PWM信号分别与SigA和SigB进行与运算，得到的Sig1和Sig2作为栅极驱动器的输入信号。当PWM信号为高电平时，Sig1、Sig2信号如图4所示，理论上输出波形的三次谐波分量为0；当PWM为低电平时，Sig1和Sig2为低电平，电路无输出。因此可通过修改PWM信号的占空比，调节电路输出的有效功率。
表1
单片机高级定时器1的配置参数
Table1.
Configuration parameters for advanced timer 1 of microcontroller
2 结果
2.1 电路测试
2.1.1 谐波抑制功能
对有无谐波抑制功能的实际电路分别进行测试，并固定电源VCC为8 V。无谐波抑制的电路中，为防止Q1和Q2同时导通，添加了约40 ns的死区保护时间。通过示波器（PicoScope 6404D，Pico Technology Inc.，英国）测量输出波形，同时记录相应的频谱分布情况。结果如图5所示，无谐波抑制时，输出波形具有较大的谐波分量，从频谱图可知主要为三次谐波；经过谐波抑制的输出波形接近三角波，其中三次谐波分量降低9.59 dB。因此，经过谐波抑制方法改进后的电路，能够更稳定地驱动HIFU换能器。
图5
有无谐波抑制功能时电路的输出波形及其频谱分布
Figure5.
Output waveforms and spectrum distribution of the circuit with or without harmonic suppression
2.1.2 输出功率
用HIFU技术处理各类生物样品时，需要使用不同的声功率进行实验，以得到最优的结果。通过调节本文电路的峰值电功率和有效电功率，可使HIFU换能器输出不同的声功率。为研究电功率与声功率之间的关系，本文采用辐射力天平（RFB-LF，Precision Acoustics Ltd，英国）测量不同电功率下的声功率。测量过程中，每种条件均测三组数据，取均值作为结果。受限于辐射力天平的测量功率范围，实验中仅测量低于10 W的声功率。
峰值电功率调节：单片机通过串口与数字可调电源建立通信，调节功放的输入电源VCC，从而改变输出波形的峰峰值，实现峰值电功率调节。结果如表2所示，以二次多项式进行拟合，如式(2)所示：
表2
峰值电功率调节的结果
Table2.
The result of peak electrical power regulation
 |
式中，P声代表测量的声功率，u为电源VCC的电压值，拟合结果的决定系数R2=0.999 45，拟合效果较好。而实际电路中电源VCC的最大输出电压为24 V，计算可知最大声功率约为22.4 W。
有效电功率调节：设置电源VCC为10 V，调节PWM信号的占空比，测量相应的声功率，结果如表3所示。以一次函数进行拟合，如式(3)所示：
表3
有效电功率调节的结果
Table3.
The result of effective electrical power regulation
 |
其中，
为PWM信号的占空比，拟合结果的决定系数R2 = 0.998 28，表明声功率与占空比 
具有较好的线性相关性。
综上所述，输出声功率P声与VCC电压u和PWM信号占空比λ的关系如式(4)所示：
 |
计算声功率与电功率的比值，可知系统的总电声转换效率约19%，影响因素主要有换能器的机电耦合系数、功率放大电路的工作效率等。
2.1.3 工作频率
通过STM32的高级定时器1产生不同频率的信号源，并用示波器获取负载两端的波形，根据波形的振铃、失真等情况，判断电路是否正常工作，从而确定电路的工作频率。由于超声换能器的阻抗随频率在变化，因此以50 Ω金属膜电阻作为负载。测试结果如下：
无谐波抑制功能时，电路的工作频率为20 kHz～2 MHz。低于20 kHz时，输出波形出现较大振铃，原因是变压器无法在此频率内工作，需更换磁环材料，且增加绕线匝数；而高于2 MHz时，电路受限于MOSFET的开关速率。
添加谐波抑制功能后，工作频率为100 kHz～1 MHz。低于100 kHz时，单片机的定时器无法产生足够长的死区时间，需采取其他方案制作信号源；而谐波抑制功能要求电路具有更快的开关频率，因此上限频率下降至1 MHz。
2.2 石蜡包埋样品脱蜡实验
2.2.1 FFPE样本脱蜡
为验证本文HIFU装置的有效性，本研究进行了FFPE脱蜡实验，并与传统的二甲苯脱蜡法和商用仪器M220进行对比。FFPE技术是一种常用的组织样品保存方法，在医学研究、临床诊断等领域具有重要意义[26-27]。然而，从FFPE样本中提取高质量的核酸分子具有较高难度，因为石蜡对组织的保护作用，阻碍了试剂的渗透[28-29]。传统的脱蜡方法采用二甲苯溶剂，然而二甲苯具有毒性，威胁实验人员的健康和自然环境，且脱蜡时间较长[30]。
本研究进行了以下对比实验：分别采用本文HIFU装置、二甲苯和商用仪器M220，对多份厚度为10 μm的小鼠肺部FFPE切片进行脱蜡处理，然后进行核酸提取与纯化，以及扩增实验，比较各方法的优劣。每种方法进行三组独立实验。
本文HIFU装置的脱蜡过程如下：将2块FFPE切片放置于含有组织裂解缓冲液和蛋白酶K的2.0 mL离心管中，在本文HIFU装置上超声6 min。其中，电源VCC设为15 V，PWM信号的周期为100 ms，占空比为20%，输出电功率约8.9 W，输出声功率约1.7 W。
二甲苯脱蜡步骤如下：将2块FFPE切片浸泡在二甲苯溶液中，剧烈涡旋10 s；离心弃上清，保留组织沉淀；加入无水乙醇，剧烈涡旋10 s；离心弃上清，保留组织沉淀；全过程约15 min。
商用仪器M220的脱蜡过程如下：将2块FFPE切片装入含有组织裂解缓冲液和蛋白酶K的试管microTUBE-500（Covaris Inc.，美国）中，在M220仪器上超声6 min。其中，仪器的峰值电功率为75 W，占空比为20%，平均电功率约15 W，声功率未知。
脱蜡后采用FFPE核酸提取纯化试剂盒（truXTRAC FFPE NA，Covaris Inc.，美国），按照说明书分别提取DNA和RNA。
2.2.2 核酸浓度与纯度分析
核酸的浓度和纯度分别用荧光仪（Qubit 4，Thermo Fisher Scientific Inc.，美国）和分光光度计（NanoDrop 2000，Thermo Fisher Scientific Inc.，美国）测得，结果如表4所示。对于DNA，三种方法得到的A260/280比值和A260/230比值均在1.8～2.2之间，说明DNA纯度较高，几乎没有蛋白和化学试剂残留。对比RNA的浓度，本文HIFU装置的脱蜡效果优于另外两种方法。对比RNA的纯度，本文HIFU装置和商用仪器M220对应的A260/280比值都在1.8～2.2之间，而二甲苯脱蜡法对应的A260/280比值低于1.8，虽然三种提取方法对应的A260/230比值都低于1.8，但二甲苯脱蜡法的A260/230比值最低，说明本文HIFU装置和商用仪器M220有助于去除后续核酸纯化过程中的残留蛋白和化学试剂。
表4
DNA和RNA的浓度和纯度
Table4.
Concentration and purity of DNA and RNA
2.2.3 核酸扩增
对小鼠管家基因β-actin进行聚合酶链式反应，设计引物扩增207 bp长度的DNA片段，扩增后进行凝胶电泳实验，结果如图6所示。DNA扩增产物电泳图中的标号1、2、3分别对应三种脱蜡方式：本文HIFU装置、二甲苯脱蜡法和商用仪器M220；“—”表示阴性对照组；“M”为标记（marker）。使用科学图像分析软件ImageJ 1.53（National Institutes of Health，美国）对条带积分灰度值进行归一化，可以看出，采用三种脱蜡方式所提取出的DNA均具备良好的可扩增性，且电泳条带积分灰度值之间无肉眼可见差异。
图6
DNA扩增产物的电泳结果
Figure6.
Electrophoresis results of DNA amplification products
3 讨论
超声技术可应用于生物样本处理，相对于传统的水浴式和探头式超声，HIFU将超声波聚焦在试管内部，能够无接触地处理样本，具有功耗低、重复性好等优势。目前商用的聚焦超声仪器较少，且体积大、价格昂贵，不利于集成到自动化设备中。本研究设计的HIFU装置体积小、成本低，可以实现样品快速破碎，易于集成到便携式设备、自动化平台。
本文通过物理场仿真，对HIFU换能器的声场进行了定性分析。换能器的工作频率越高，聚焦范围越小，能量越集中。针对不同的使用场景，应根据换能器的频率、聚焦半径、外直径等参数进行选型。本文HIFU装置适配实验室常用的2.0 mL离心管，能够完成FFPE脱蜡实验。然而，仿真发现其锥形底部会吸收声能而发热，对超声的功率会有一定限制。为规避该影响，应根据换能器尺寸设计合适的容器，使得容器底部的切平面与声波的入射方向保持垂直，从而降低声能损耗。
为高效、稳定地驱动HIFU换能器，本研究采用变压器耦合的D类功率放大电路，并通过谐波抑制方法对电路进行改进，有效降低了输出的三次谐波分量。本文通过调节电路输出的峰值电功率和有效电功率，使超声换能器输出0～22.4 W的声功率，满足不同参数的超声处理需求。
通过本文HIFU装置、二甲苯和商用仪器M220对小鼠肺部FFPE样品进行脱蜡实验，结果如下：对比脱蜡效果，三种方式均能成功脱蜡，且提取的核酸具有可扩增性，能够用于分子生物学检测；对比DNA的浓度和纯度，三种方法未见明显差异；对比RNA的纯度和浓度，本文HIFU装置明显优于二甲苯脱蜡法，与商用仪器M220的结果接近。对比扩增产物的电泳条带，三种脱蜡方式无肉眼可见差异；对比脱蜡效率，二甲苯脱蜡过程中需要离心、涡旋等操作，而本文HIFU装置和商用仪器M220操作流程简单，减小了因操作人员所导致的实验误差，同时缩短了脱蜡时间；对比安全性，二甲苯具有毒性，不利于实验人员的健康和环境保护。对比装置体积：本文HIFU装置体积较小，既可以作为独立设备使用，也可以作为样品前处理模块，集成到核酸一体检测设备中。
4 结论
为解决传统超声仪器存在交叉污染、样本破碎不均匀等问题，本研究设计了一种小型化、低成本的HIFU装置。首先通过物理仿真证明装置的可行性，然后制作功率可调的HIFU换能器驱动电路，最后通过FFPE样本脱蜡实验测试装置的有效性。实验结果表明：相比于二甲苯脱蜡法，本文HIFU装置具有更好的脱蜡效果、效率和安全性；而与商用仪器M220相比，本文HIFU装置体积小、成本低。综上所述，本文设计的小型化HIFU装置有望应用于自动化核酸提取和纯化设备中，在样本前处理领域具有广阔的应用前景。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：雷祝兵主要负责声场仿真、机械、电路、编程和论文撰写；庞欣佩负责生物实验和论文修改；李力主要负责生物实验设计与指导；梅茜指导工程设计和论文审阅修订；董文飞主要负责项目整体指导和论文修订。
0 引言
超声波是指频率超过20 kHz的机械波，被广泛应用于疾病诊断、癌症治疗、药物递送等医学领域[1-5]。利用超声波产生的空化效应，可实现细胞破碎、组织匀浆等功能，因此超声技术可用于处理复杂的生物样本[6]。目前市场上的超声波破碎仪大多属于接触式，需要将换能器浸入样本溶液。该方式存在以下缺陷：每次实验需要清洗换能器，无法彻底规避交叉污染的风险；样本溶液中声压分布不均匀，不利于实验的可重复性；换能器工作产生的热量直接传递到样本溶液中，影响实验结果。
由于传统接触式超声仪器存在以上不足，非接触式超声技术开始受到研究者重视。乔龙学等[7]设计了一种非接触式超声裂解系统，但是该系统机械结构复杂，体积较大。Holmes等[8]在凹球面上固定多个换能器，产生聚焦超声，实现从组织中快速提取核酸。Bigelow等[9]通过高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound，HIFU）技术裂解微藻。Bomsztyk等[10]将HIFU技术应用于表观遗传学。目前，市面上的聚焦超声仪器较少，且价格昂贵，如非接触式超声波破碎仪M220（Covaris Inc.，美国）（以下全文简称M220），不利于集成到自动化、便携式设备中。
针对以上问题，本文研制了一种小型化、低成本的HIFU装置。该装置通过凹球面自聚焦型压电陶瓷片发射超声波，在聚焦区域产生空化效应，实现样本裂解。本研究通过物理场仿真验证该装置的可行性，并设计了能够稳定驱动换能器的功率放大电路。最后利用HIFU装置处理小鼠肺部的石蜡包埋福尔马林浸泡（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）样本，并与二甲苯脱蜡法、商用仪器M220进行对比，测试装置的有效性。
1 方法
1.1 换能器选型
HIFU换能器的工作频率通常在100 kHz～10 MHz，为选择合适的换能器，本文通过声学频域仿真，定性分析声场与频率之间的关系。首先建立HIFU声场的二维对称仿真模型，如图1所示，R轴为径向轴，Z轴为垂直轴；仿真区域为换能器、水域，模型外围添加完美匹配层，匹配层的边界设置为硬声场边界；固定频率以外的条件，设换能器的聚焦半径r为38 mm，外半径r’为19 mm，向内法向位移为100 nm；分别设置频率f为100 kHz、500 kHz、1 MHz、2 MHz，仿真计算得到的结果如图1所示。聚焦区域呈梭形分布，其范围大小与频率呈负相关；f=100 kHz时，最大绝对压强仅0.3 MPa；而f=2 MHz时，最大绝对压强为80.0 MPa；该结果表明，频率越高，能量越集中。因此，使用HIFU技术处理生物样品时，需根据样品和容器的体积与结构，选择合适的换能器。
图1
不同工作频率下HIFU换能器的声场仿真
Figure1.
Acoustic field simulation of HIFU transducers with different operating frequencies
本研究的生物样品处理实验中，样品体积为0.5～1.5 mL，容器采用2.0 mL离心管(T2-EP0200-B-N-S-ZX，上海泰坦科技股份有限公司，中国)，其底部直径约10 mm。市面上工作频率高于2 MHz的换能器的尺寸比仿真模型更小，聚焦区域偏小，不适用于本研究。由于需同时考虑到换能器装配、防水等问题，故选用中心无开孔、凹面电极引至凸面的换能器。综合以上因素，本文采用谐振频率为500 kHz的换能器，其聚焦半径为67 mm，外半径为30 mm。
1.2 HIFU装置
本研究设计的HIFU装置的结构和实物如图2所示，主要包括顶盖、水槽、换能器和底盖，长、宽、高分别为75、87、120 mm。水槽通过三维打印技术加工，顶盖作为试管的夹具，容器为2.0 mL离心管，内部装有待处理的生物样本；水槽内部装有去离子水，作为超声波传输的媒介；侧边有矩形窗口，粘贴透明亚克力板，便于观察实验现象；下方接口处安装卡扣配合型连接器（bayonet nut connector，BNC）母座；用防水密封胶将换能器固定于水槽底部，正负电极与BNC母座连接，最后经射频传输线连接到电路板。
图2
HIFU装置的示意图
Figure2.
The diagram of HIFU device
对上述装置进行物理场仿真，定性分析结构的可行性。首先建立二维仿真模型，如图3所示，底部的曲线为换能器，向内法向位移为100 nm；聚焦区域放置2.0 mL离心管，材质为聚丙烯；其余部分均为水；模型边界添加完美匹配层；环境的初始温度设为20 ℃。
图3
HIFU装置的物理场仿真
Figure3.
The physics field simulation of HIFU device
通过声学频域仿真，计算绝对压强，结果如图3所示，试管中间区域的绝对压强较大，最大约9.6 MPa，然而试管底部同样具有较高的压强。然后，进行固体和流体传热的时域仿真，热源Q的计算，如式(1)所示：
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其中，I为声学仿真计算的声强，α为材料的吸声系数[11]。热源持续5 min，得到如图3所示的温度分布图。试管底部温度最高，升高约10 ℃，试管内部温度上升3～9 ℃。
通过仿真实验可知，超声波主要聚集在试管内部，能够用于样本处理。试管内部温升较小，有利于生物实验，如保持酶的活性、核酸完整性等。但是2.0 mL离心管底部吸收声能发热，因此会对仪器的性能有所限制。
1.3 驱动电路
1.3.1 电路设计
HIFU换能器为容性器件，在谐振频率点处的阻抗幅值最小[12]。换能器的驱动电路可分为线性型和开关型，由于线性型放大电路工作效率低[13]，故大功率应用中基本采用开关型电路，主要有以下几种：双极性半桥型D类功放[14-17]、多极性阶梯型D类功放[18-22]、变压器耦合型D类功放[23]和E类功率放大电路[24-25]。本文基于变压器耦合型D类功率放大电路进行设计，开发的驱动电路如图4所示。
图4
驱动电路与相关波形
Figure4.
Driving circuit and related waveforms
功率放大部分采用推挽式结构，其中数字可调电源供电电压（volt current condenser，VCC）为电路提供能量，型号为DKP6012（深圳寰球信瑞电子科技有限公司，中国）；Q1和Q2（IRF610, Infineon Technologies Inc., 德国）为具有低导通电阻、低输入电容和高耐压值的N型金属氧化物半导体场效应晶体管（metal oxide semiconductor field effect transistor，MOSFET）；栅极驱动器1和2用于驱动MOSFET，可提高开关速率，降低功率损耗；瞬态抑制二极管D1和D2用于吸收因变压器漏感引起的电压尖峰，保护Q1和Q2；T1为高频环形变压器，磁环材质为镍锌铁氧体，两初级线圈和次级线圈的匝数比为5:5:10。
电路的基本工作原理为：Q2导通，Q1关闭时，电流从VCC经变压器流向Q2，负载两端产生正感应电压；Q1导通，Q2关闭时，负载两端产生负感应电压；以500 kHz频率交替导通Q1和Q2，即可在负载两端产生500 kHz的方波。
1.3.2 谐波抑制
直接用方波驱动HIFU换能器会产生较大的奇数次谐波，Tang等[23]提出了一种抑制三次谐波的方法，并指出更高阶次的谐波会因换能器的带通特性被滤除，然而Tang等[23]设计的电路需两套推挽电路配合工作，结构复杂、成本高。本文基于STM32单片机（STM32F103C8T6，意法半导体，意大利），以低成本方案实现谐波抑制功能。
本文设计的信号源如图4所示，单片机的高级定时器1产生互补输出的一对脉冲宽度调制（pulse width modulation，PWM）波形，记作SigA和SigB，其中定时器1的配置参数如表1所示。普通定时器产生的PWM信号分别与SigA和SigB进行与运算，得到的Sig1和Sig2作为栅极驱动器的输入信号。当PWM信号为高电平时，Sig1、Sig2信号如图4所示，理论上输出波形的三次谐波分量为0；当PWM为低电平时，Sig1和Sig2为低电平，电路无输出。因此可通过修改PWM信号的占空比，调节电路输出的有效功率。
表1
单片机高级定时器1的配置参数
Table1.
Configuration parameters for advanced timer 1 of microcontroller
2 结果
2.1 电路测试
2.1.1 谐波抑制功能
对有无谐波抑制功能的实际电路分别进行测试，并固定电源VCC为8 V。无谐波抑制的电路中，为防止Q1和Q2同时导通，添加了约40 ns的死区保护时间。通过示波器（PicoScope 6404D，Pico Technology Inc.，英国）测量输出波形，同时记录相应的频谱分布情况。结果如图5所示，无谐波抑制时，输出波形具有较大的谐波分量，从频谱图可知主要为三次谐波；经过谐波抑制的输出波形接近三角波，其中三次谐波分量降低9.59 dB。因此，经过谐波抑制方法改进后的电路，能够更稳定地驱动HIFU换能器。
图5
有无谐波抑制功能时电路的输出波形及其频谱分布
Figure5.
Output waveforms and spectrum distribution of the circuit with or without harmonic suppression
2.1.2 输出功率
用HIFU技术处理各类生物样品时，需要使用不同的声功率进行实验，以得到最优的结果。通过调节本文电路的峰值电功率和有效电功率，可使HIFU换能器输出不同的声功率。为研究电功率与声功率之间的关系，本文采用辐射力天平（RFB-LF，Precision Acoustics Ltd，英国）测量不同电功率下的声功率。测量过程中，每种条件均测三组数据，取均值作为结果。受限于辐射力天平的测量功率范围，实验中仅测量低于10 W的声功率。
峰值电功率调节：单片机通过串口与数字可调电源建立通信，调节功放的输入电源VCC，从而改变输出波形的峰峰值，实现峰值电功率调节。结果如表2所示，以二次多项式进行拟合，如式(2)所示：
表2
峰值电功率调节的结果
Table2.
The result of peak electrical power regulation
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式中，P声代表测量的声功率，u为电源VCC的电压值，拟合结果的决定系数R2=0.999 45，拟合效果较好。而实际电路中电源VCC的最大输出电压为24 V，计算可知最大声功率约为22.4 W。
有效电功率调节：设置电源VCC为10 V，调节PWM信号的占空比，测量相应的声功率，结果如表3所示。以一次函数进行拟合，如式(3)所示：
表3
有效电功率调节的结果
Table3.
The result of effective electrical power regulation
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其中， 为PWM信号的占空比，拟合结果的决定系数R2 = 0.998 28，表明声功率与占空比 具有较好的线性相关性。
综上所述，输出声功率P声与VCC电压u和PWM信号占空比λ的关系如式(4)所示：
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计算声功率与电功率的比值，可知系统的总电声转换效率约19%，影响因素主要有换能器的机电耦合系数、功率放大电路的工作效率等。
2.1.3 工作频率
通过STM32的高级定时器1产生不同频率的信号源，并用示波器获取负载两端的波形，根据波形的振铃、失真等情况，判断电路是否正常工作，从而确定电路的工作频率。由于超声换能器的阻抗随频率在变化，因此以50 Ω金属膜电阻作为负载。测试结果如下：
无谐波抑制功能时，电路的工作频率为20 kHz～2 MHz。低于20 kHz时，输出波形出现较大振铃，原因是变压器无法在此频率内工作，需更换磁环材料，且增加绕线匝数；而高于2 MHz时，电路受限于MOSFET的开关速率。
添加谐波抑制功能后，工作频率为100 kHz～1 MHz。低于100 kHz时，单片机的定时器无法产生足够长的死区时间，需采取其他方案制作信号源；而谐波抑制功能要求电路具有更快的开关频率，因此上限频率下降至1 MHz。
2.2 石蜡包埋样品脱蜡实验
2.2.1 FFPE样本脱蜡
为验证本文HIFU装置的有效性，本研究进行了FFPE脱蜡实验，并与传统的二甲苯脱蜡法和商用仪器M220进行对比。FFPE技术是一种常用的组织样品保存方法，在医学研究、临床诊断等领域具有重要意义[26-27]。然而，从FFPE样本中提取高质量的核酸分子具有较高难度，因为石蜡对组织的保护作用，阻碍了试剂的渗透[28-29]。传统的脱蜡方法采用二甲苯溶剂，然而二甲苯具有毒性，威胁实验人员的健康和自然环境，且脱蜡时间较长[30]。
本研究进行了以下对比实验：分别采用本文HIFU装置、二甲苯和商用仪器M220，对多份厚度为10 μm的小鼠肺部FFPE切片进行脱蜡处理，然后进行核酸提取与纯化，以及扩增实验，比较各方法的优劣。每种方法进行三组独立实验。
本文HIFU装置的脱蜡过程如下：将2块FFPE切片放置于含有组织裂解缓冲液和蛋白酶K的2.0 mL离心管中，在本文HIFU装置上超声6 min。其中，电源VCC设为15 V，PWM信号的周期为100 ms，占空比为20%，输出电功率约8.9 W，输出声功率约1.7 W。
二甲苯脱蜡步骤如下：将2块FFPE切片浸泡在二甲苯溶液中，剧烈涡旋10 s；离心弃上清，保留组织沉淀；加入无水乙醇，剧烈涡旋10 s；离心弃上清，保留组织沉淀；全过程约15 min。
商用仪器M220的脱蜡过程如下：将2块FFPE切片装入含有组织裂解缓冲液和蛋白酶K的试管microTUBE-500（Covaris Inc.，美国）中，在M220仪器上超声6 min。其中，仪器的峰值电功率为75 W，占空比为20%，平均电功率约15 W，声功率未知。
脱蜡后采用FFPE核酸提取纯化试剂盒（truXTRAC FFPE NA，Covaris Inc.，美国），按照说明书分别提取DNA和RNA。
2.2.2 核酸浓度与纯度分析
核酸的浓度和纯度分别用荧光仪（Qubit 4，Thermo Fisher Scientific Inc.，美国）和分光光度计（NanoDrop 2000，Thermo Fisher Scientific Inc.，美国）测得，结果如表4所示。对于DNA，三种方法得到的A260/280比值和A260/230比值均在1.8～2.2之间，说明DNA纯度较高，几乎没有蛋白和化学试剂残留。对比RNA的浓度，本文HIFU装置的脱蜡效果优于另外两种方法。对比RNA的纯度，本文HIFU装置和商用仪器M220对应的A260/280比值都在1.8～2.2之间，而二甲苯脱蜡法对应的A260/280比值低于1.8，虽然三种提取方法对应的A260/230比值都低于1.8，但二甲苯脱蜡法的A260/230比值最低，说明本文HIFU装置和商用仪器M220有助于去除后续核酸纯化过程中的残留蛋白和化学试剂。
表4
DNA和RNA的浓度和纯度
Table4.
Concentration and purity of DNA and RNA
2.2.3 核酸扩增
对小鼠管家基因β-actin进行聚合酶链式反应，设计引物扩增207 bp长度的DNA片段，扩增后进行凝胶电泳实验，结果如图6所示。DNA扩增产物电泳图中的标号1、2、3分别对应三种脱蜡方式：本文HIFU装置、二甲苯脱蜡法和商用仪器M220；“—”表示阴性对照组；“M”为标记（marker）。使用科学图像分析软件ImageJ 1.53（National Institutes of Health，美国）对条带积分灰度值进行归一化，可以看出，采用三种脱蜡方式所提取出的DNA均具备良好的可扩增性，且电泳条带积分灰度值之间无肉眼可见差异。
图6
DNA扩增产物的电泳结果
Figure6.
Electrophoresis results of DNA amplification products
3 讨论
超声技术可应用于生物样本处理，相对于传统的水浴式和探头式超声，HIFU将超声波聚焦在试管内部，能够无接触地处理样本，具有功耗低、重复性好等优势。目前商用的聚焦超声仪器较少，且体积大、价格昂贵，不利于集成到自动化设备中。本研究设计的HIFU装置体积小、成本低，可以实现样品快速破碎，易于集成到便携式设备、自动化平台。
本文通过物理场仿真，对HIFU换能器的声场进行了定性分析。换能器的工作频率越高，聚焦范围越小，能量越集中。针对不同的使用场景，应根据换能器的频率、聚焦半径、外直径等参数进行选型。本文HIFU装置适配实验室常用的2.0 mL离心管，能够完成FFPE脱蜡实验。然而，仿真发现其锥形底部会吸收声能而发热，对超声的功率会有一定限制。为规避该影响，应根据换能器尺寸设计合适的容器，使得容器底部的切平面与声波的入射方向保持垂直，从而降低声能损耗。
为高效、稳定地驱动HIFU换能器，本研究采用变压器耦合的D类功率放大电路，并通过谐波抑制方法对电路进行改进，有效降低了输出的三次谐波分量。本文通过调节电路输出的峰值电功率和有效电功率，使超声换能器输出0～22.4 W的声功率，满足不同参数的超声处理需求。
通过本文HIFU装置、二甲苯和商用仪器M220对小鼠肺部FFPE样品进行脱蜡实验，结果如下：对比脱蜡效果，三种方式均能成功脱蜡，且提取的核酸具有可扩增性，能够用于分子生物学检测；对比DNA的浓度和纯度，三种方法未见明显差异；对比RNA的纯度和浓度，本文HIFU装置明显优于二甲苯脱蜡法，与商用仪器M220的结果接近。对比扩增产物的电泳条带，三种脱蜡方式无肉眼可见差异；对比脱蜡效率，二甲苯脱蜡过程中需要离心、涡旋等操作，而本文HIFU装置和商用仪器M220操作流程简单，减小了因操作人员所导致的实验误差，同时缩短了脱蜡时间；对比安全性，二甲苯具有毒性，不利于实验人员的健康和环境保护。对比装置体积：本文HIFU装置体积较小，既可以作为独立设备使用，也可以作为样品前处理模块，集成到核酸一体检测设备中。
4 结论
为解决传统超声仪器存在交叉污染、样本破碎不均匀等问题，本研究设计了一种小型化、低成本的HIFU装置。首先通过物理仿真证明装置的可行性，然后制作功率可调的HIFU换能器驱动电路，最后通过FFPE样本脱蜡实验测试装置的有效性。实验结果表明：相比于二甲苯脱蜡法，本文HIFU装置具有更好的脱蜡效果、效率和安全性；而与商用仪器M220相比，本文HIFU装置体积小、成本低。综上所述，本文设计的小型化HIFU装置有望应用于自动化核酸提取和纯化设备中，在样本前处理领域具有广阔的应用前景。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：雷祝兵主要负责声场仿真、机械、电路、编程和论文撰写；庞欣佩负责生物实验和论文修改；李力主要负责生物实验设计与指导；梅茜指导工程设计和论文审阅修订；董文飞主要负责项目整体指导和论文修订。
