引用本文： 周世广, 杨建华, 王英琨, 冯灵香. 大肠癌组织中尿激酶型纤溶酶原激活剂和糖原合成酶激酶-3β磷酸化的表达及意义. 华西医学, 2014, 29(1): 39-42. doi: 10.7507/1002-0179.20140011 复制
大肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，近年来随着国人生活水平提高和生活习惯改变，其发病率逐年增高，且有发病年轻化的趋势。恶性肿瘤的发生与侵袭、转移是一个复杂的过程，其中尿激酶型纤溶酶原激活系统在使细胞外基质降解过程以及恶性肿瘤细胞的侵袭转移中起着主要作用。本研究拟用微波EliVisionTM免疫组织化学法检测正常大肠黏膜、大肠癌和大肠腺瘤组织中尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）和糖原合成酶激酶-3β磷酸化（P-GSK3β）的表达情况，分析这两种蛋白表达与大肠癌生物学行为的关系，并探讨它们在大肠癌中发生、发展中的作用，为临床治疗提供科学依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
所有病理标本均选取2006年1月－2010年12月在河北省邯郸市中心医院行大肠癌手术标本，共计78例，所有患者术前均未行化学治疗或放射治疗等相关治疗。78例患者中，男53例，女25例；年龄39～79岁，平均59.3岁；有淋巴结转移43例，无淋巴转移35例。按WHO消化系统肿瘤分类标准（2000年）进行组织学分级：高分化24例，中分化24例，低分化30例。所有病例根据国际抗癌联盟2003年修订的TNM分期标准进行临床病理分期。同时，另取同期手术切除和结肠镜活检并经病理确诊的大肠腺瘤30例，另取距肿瘤5 cm以上正常大肠黏膜组织20例作为正常对照组。
1.2 试剂与方法
链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（SP）试剂盒、二硝基联苯胺（DAB）显色液及uPA和P-GSK3β（北京中杉金桥生物技术有限公司）。采用SP法，免疫组织化学染色按SP试剂盒说明操作，以3%过氧化氢室温孵育10 min除去内源性过氧化物酶的活性，抗原热修复，加入一抗、二抗和辣根过氧化物酶，DAB显色，苏木素衬染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。其阳性对照组选取已知uPA和P-GSK3β阳性表达的乳腺癌切片，阴性对照是以磷酸盐缓冲液缓冲液代替一抗。
1.3 结果判断
uPA和P-GSK3β的阳性表达均主要定位于细胞质，以uPA和P-GSK3β在细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性表达。定性观察按细胞有无显色及染色强度进行计分：细胞质内无显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。按显色细胞的比例记分：每200倍视野下，计数1 000个细胞，显色细胞＜10%为0分，10%～30%显色为1分，31%～60%显色为2分，≥61%以上显色为3分。以上每例两个积分相乘，积分0分为阴性，积分≥1分为阳性。为减少人为因素造成的判断误差，由2名高年资病理医师逐一观察同一切片，以两人观察结果一致作为最终的评定结果。
1.4 统计学方法
应用SPSS 16.0统计软件，组间阳性表达率的比较采用χ2检验，uPA和P-GSK3β在大肠癌组织阳性表达的相关性分析采用Spearman相关分析，P值＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 uPA、P-GSK3β在正常大肠黏膜、大肠腺瘤和大肠癌组织中的表达
uPA、P-GSK3β的染色结果以细胞质内出现棕色颗粒或染成棕黄色为阳性信号（图 1、2）。大肠癌uPA、P-GSK3β阳性表达率显著高于正常大肠黏膜、大肠腺瘤（P＜0.05），正常大肠黏膜、大肠腺瘤的uPA、P-GSK3β阳性表达率差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。
图1
光学显微镜下uPA在大肠癌组织切片中的免疫组织化学染色情况（SP×200） 图 2 光学显微镜下P-GSK 3β在大肠癌组织切片中的免疫组织化学染色情况（SP×200）
表1
正常大肠黏膜、大肠腺瘤和大肠癌组织中uPA、P-GSK3β的表达
2.2 uPA、P-GSK3β在大肠癌组织中的表达与临床病理指标的关系
在大肠癌组织中，uPA、P-GSK3β的阳性表达与患者的性别、年龄、部位和大小无明显相关性（P＞0.05），而与组织学分级、病理分期以及淋巴结转移有关（P＜0.05），见表 2。
表2
uPA和P-GSK3β蛋白在大肠癌中的表达与临床病理指标的关系
2.3 uPA、P-GSK3β在大肠癌组织中的相关性分析
大肠癌组织中uPA和P-GSK3β的阳性表达进行相关性分析发现，二者在大肠癌组织中的阳性表达呈正相关（r=0.381，P=0.001），见表 3。
表3
uPA和P-GSK3β蛋白在大肠癌组织中的相关性
3 讨论
浸润和转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征，癌基因激活、抑癌基因失活或突变以及肿瘤血管生成等因素和步骤参与了恶性肿瘤的浸润转移。其中，肿瘤细胞分泌的蛋白水解酶对细胞外基质和基底膜水解作用是肿瘤细胞浸润生长和转移的分子基础和先决条件[1]。uPA是一种丝氨酸蛋白酶，它介导的纤维蛋白溶解系统与恶性肿瘤浸润转移密切相关[2]。uPA与表面受体结合后活性增加，可使无活性的纤维蛋白酶原变成有活性的纤维蛋白酶，与纤维蛋白酶通过直接和间接作用降解细胞外基质，促进肿瘤细胞侵袭、转移[3]。研究发现，多种恶性肿瘤中如胃癌、乳腺癌、肺癌等中均有uPA的过表达[4-6]。本研究可见，从正常大肠黏膜组织到大肠腺瘤组织再到大肠癌组织，uPA从不表达到弱阳性表达直至强阳性表达，大肠癌与正常大肠黏膜和大肠腺瘤组织之间的阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05），说明uPA在大肠癌变过程中起到促进作用；此外，本研究亦发现uPA与病理分期及组织学分级有关（P＜0.05），病理分期高、组织分化程度低的组织，uPA的阳性表达越强，提示uPA表达水平促进了恶性程度高的肿瘤侵袭能力，预后较差；uPA与有无淋巴结转移有关（P＜0.05），说明在大肠癌侵袭转移中发挥了重要作用。
GSK3是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，是许多信号通路如Wnt、PI3/AKT、核因子-κB（NF-κB）等中的重要组成部分。GSK3β作为GSK3一个亚型，人体大多数器官、组织和细胞有表达，GSK3β的活性由不同位点的磷酸化状态调节，当GSK3β发生磷酸化可降低其活性。已有研究发现，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的P38MAPK可通过使GSK3β的N端丝氨酸9处或是C端磷酸化失活，使Wnt通路中的主要蛋白β-catenin的稳定性发生改变，在肿瘤细胞发生β-catenin的核异位，进而促进恶性肿瘤的发生发展和浸润转移[7, 8]。因此，由此可判定磷酸化后GSK3β（P-GSK3β）可能对肿瘤起到促进作用，使肿瘤细胞间黏附功能下降以及肿瘤细胞-基质间黏附力增强[9, 10]。我们研究发现P-GSK3β在正常大肠黏膜组织中不表达，大肠腺瘤中弱表达，而大肠癌组织中呈高表达。且P-GSK3β与大肠癌中淋巴结转移、病理分期及组织学分级有关（P＜0.05），提示P-GSK3β在大肠癌的发生发展起促进作用。
本研究发现uPA和P-GSK3β在大肠癌组织中表达呈正相关，其机制可能是：uPA基因启动子区有AP-1、SP-1、ETS 等转录因子结合位点[11, 12]，MAPK通路中的p38活化后可磷酸化增强包括ETS在内的多种转录因子的活性，引起uPA 基因转录增强，uPA 产生增多。同时，P38也可使GSK3β的N端或是C端丝氨酸磷酸化失活，进而促进β-catenin发生核异位，Wnt信号通路激活。uPA和P-GSK3β可能通过MAPK通路中的P38发生交互作用。
总之，uPA和P-GSK3β在大肠癌组织中过表达状态，与大肠癌的发生、发展和转移密切相关。本研究结果将有助于人们对大肠癌发病机制的认识，为大肠癌防治探索新思路和寻找新方法。
大肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，近年来随着国人生活水平提高和生活习惯改变，其发病率逐年增高，且有发病年轻化的趋势。恶性肿瘤的发生与侵袭、转移是一个复杂的过程，其中尿激酶型纤溶酶原激活系统在使细胞外基质降解过程以及恶性肿瘤细胞的侵袭转移中起着主要作用。本研究拟用微波EliVisionTM免疫组织化学法检测正常大肠黏膜、大肠癌和大肠腺瘤组织中尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）和糖原合成酶激酶-3β磷酸化（P-GSK3β）的表达情况，分析这两种蛋白表达与大肠癌生物学行为的关系，并探讨它们在大肠癌中发生、发展中的作用，为临床治疗提供科学依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
所有病理标本均选取2006年1月－2010年12月在河北省邯郸市中心医院行大肠癌手术标本，共计78例，所有患者术前均未行化学治疗或放射治疗等相关治疗。78例患者中，男53例，女25例；年龄39～79岁，平均59.3岁；有淋巴结转移43例，无淋巴转移35例。按WHO消化系统肿瘤分类标准（2000年）进行组织学分级：高分化24例，中分化24例，低分化30例。所有病例根据国际抗癌联盟2003年修订的TNM分期标准进行临床病理分期。同时，另取同期手术切除和结肠镜活检并经病理确诊的大肠腺瘤30例，另取距肿瘤5 cm以上正常大肠黏膜组织20例作为正常对照组。
1.2 试剂与方法
链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（SP）试剂盒、二硝基联苯胺（DAB）显色液及uPA和P-GSK3β（北京中杉金桥生物技术有限公司）。采用SP法，免疫组织化学染色按SP试剂盒说明操作，以3%过氧化氢室温孵育10 min除去内源性过氧化物酶的活性，抗原热修复，加入一抗、二抗和辣根过氧化物酶，DAB显色，苏木素衬染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。其阳性对照组选取已知uPA和P-GSK3β阳性表达的乳腺癌切片，阴性对照是以磷酸盐缓冲液缓冲液代替一抗。
1.3 结果判断
uPA和P-GSK3β的阳性表达均主要定位于细胞质，以uPA和P-GSK3β在细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性表达。定性观察按细胞有无显色及染色强度进行计分：细胞质内无显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。按显色细胞的比例记分：每200倍视野下，计数1 000个细胞，显色细胞＜10%为0分，10%～30%显色为1分，31%～60%显色为2分，≥61%以上显色为3分。以上每例两个积分相乘，积分0分为阴性，积分≥1分为阳性。为减少人为因素造成的判断误差，由2名高年资病理医师逐一观察同一切片，以两人观察结果一致作为最终的评定结果。
1.4 统计学方法
应用SPSS 16.0统计软件，组间阳性表达率的比较采用χ2检验，uPA和P-GSK3β在大肠癌组织阳性表达的相关性分析采用Spearman相关分析，P值＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 uPA、P-GSK3β在正常大肠黏膜、大肠腺瘤和大肠癌组织中的表达
uPA、P-GSK3β的染色结果以细胞质内出现棕色颗粒或染成棕黄色为阳性信号（图 1、2）。大肠癌uPA、P-GSK3β阳性表达率显著高于正常大肠黏膜、大肠腺瘤（P＜0.05），正常大肠黏膜、大肠腺瘤的uPA、P-GSK3β阳性表达率差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。
图1
光学显微镜下uPA在大肠癌组织切片中的免疫组织化学染色情况（SP×200） 图 2 光学显微镜下P-GSK 3β在大肠癌组织切片中的免疫组织化学染色情况（SP×200）
表1
正常大肠黏膜、大肠腺瘤和大肠癌组织中uPA、P-GSK3β的表达
2.2 uPA、P-GSK3β在大肠癌组织中的表达与临床病理指标的关系
在大肠癌组织中，uPA、P-GSK3β的阳性表达与患者的性别、年龄、部位和大小无明显相关性（P＞0.05），而与组织学分级、病理分期以及淋巴结转移有关（P＜0.05），见表 2。
表2
uPA和P-GSK3β蛋白在大肠癌中的表达与临床病理指标的关系
2.3 uPA、P-GSK3β在大肠癌组织中的相关性分析
大肠癌组织中uPA和P-GSK3β的阳性表达进行相关性分析发现，二者在大肠癌组织中的阳性表达呈正相关（r=0.381，P=0.001），见表 3。
表3
uPA和P-GSK3β蛋白在大肠癌组织中的相关性
3 讨论
浸润和转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征，癌基因激活、抑癌基因失活或突变以及肿瘤血管生成等因素和步骤参与了恶性肿瘤的浸润转移。其中，肿瘤细胞分泌的蛋白水解酶对细胞外基质和基底膜水解作用是肿瘤细胞浸润生长和转移的分子基础和先决条件[1]。uPA是一种丝氨酸蛋白酶，它介导的纤维蛋白溶解系统与恶性肿瘤浸润转移密切相关[2]。uPA与表面受体结合后活性增加，可使无活性的纤维蛋白酶原变成有活性的纤维蛋白酶，与纤维蛋白酶通过直接和间接作用降解细胞外基质，促进肿瘤细胞侵袭、转移[3]。研究发现，多种恶性肿瘤中如胃癌、乳腺癌、肺癌等中均有uPA的过表达[4-6]。本研究可见，从正常大肠黏膜组织到大肠腺瘤组织再到大肠癌组织，uPA从不表达到弱阳性表达直至强阳性表达，大肠癌与正常大肠黏膜和大肠腺瘤组织之间的阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05），说明uPA在大肠癌变过程中起到促进作用；此外，本研究亦发现uPA与病理分期及组织学分级有关（P＜0.05），病理分期高、组织分化程度低的组织，uPA的阳性表达越强，提示uPA表达水平促进了恶性程度高的肿瘤侵袭能力，预后较差；uPA与有无淋巴结转移有关（P＜0.05），说明在大肠癌侵袭转移中发挥了重要作用。
GSK3是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，是许多信号通路如Wnt、PI3/AKT、核因子-κB（NF-κB）等中的重要组成部分。GSK3β作为GSK3一个亚型，人体大多数器官、组织和细胞有表达，GSK3β的活性由不同位点的磷酸化状态调节，当GSK3β发生磷酸化可降低其活性。已有研究发现，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的P38MAPK可通过使GSK3β的N端丝氨酸9处或是C端磷酸化失活，使Wnt通路中的主要蛋白β-catenin的稳定性发生改变，在肿瘤细胞发生β-catenin的核异位，进而促进恶性肿瘤的发生发展和浸润转移[7, 8]。因此，由此可判定磷酸化后GSK3β（P-GSK3β）可能对肿瘤起到促进作用，使肿瘤细胞间黏附功能下降以及肿瘤细胞-基质间黏附力增强[9, 10]。我们研究发现P-GSK3β在正常大肠黏膜组织中不表达，大肠腺瘤中弱表达，而大肠癌组织中呈高表达。且P-GSK3β与大肠癌中淋巴结转移、病理分期及组织学分级有关（P＜0.05），提示P-GSK3β在大肠癌的发生发展起促进作用。
本研究发现uPA和P-GSK3β在大肠癌组织中表达呈正相关，其机制可能是：uPA基因启动子区有AP-1、SP-1、ETS 等转录因子结合位点[11, 12]，MAPK通路中的p38活化后可磷酸化增强包括ETS在内的多种转录因子的活性，引起uPA 基因转录增强，uPA 产生增多。同时，P38也可使GSK3β的N端或是C端丝氨酸磷酸化失活，进而促进β-catenin发生核异位，Wnt信号通路激活。uPA和P-GSK3β可能通过MAPK通路中的P38发生交互作用。
总之，uPA和P-GSK3β在大肠癌组织中过表达状态，与大肠癌的发生、发展和转移密切相关。本研究结果将有助于人们对大肠癌发病机制的认识，为大肠癌防治探索新思路和寻找新方法。
