引用本文： 李浩, 徐敏. 地塞米松治疗坐骨神经非冻结性冷损伤的实验研究. 华西医学, 2014, 29(2): 219-222. doi: 10.7507/1002-0179.20140068 复制
自希波克拉底时代起，非冻结性冷损伤影响周围神经的报道就多见于历次战争中，例如两次世界大战及朝鲜战争中的“战壕足”现象。即使在当今的和平年代，非冻结性冷损伤在我国某些人群的发病率也可高达8.7%[1]。2008年雪灾时，非冻结性冷损伤在宁波地区发生率为12.78%，占伤害类型的67.28%，给人民健康带来了不利影响[2]。目前非冻结性冷损伤的发生机制仍未明确，治疗方法也存在误区。治疗方法不当可导致冷损伤的伤残率高达92.8%[3]。本实验在前期研究的基础上[4-6]，探讨地塞米松治疗神经非冻结性冷损伤时的疗效，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
无特定病原体级健康雄性Wistar大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），体质量350～400 g。制冷装置选择德国优莱博公司生产的制冷和加热循环器（F12-ED），测温装置选择优利德专业型数字测温表（UT325A）。
1.2 方法
1.2.1 坐骨神经冷损伤模型
实验模型的制作（图 1）参考Jia等[4]的方法：用2%戊巴比妥钠以0.25 mL/100 g 体质量的剂量腹腔麻醉大鼠。麻醉后大鼠俯卧位固定，在其大腿根部常规备皮、消毒，于菱形窝处皮肤上作一个3 cm长切口，充分暴露坐骨神经后，将其置于已预冷的铜槽中，神经表面滴石蜡油，使神经温度维持在3～5℃。根据实验需要选择受冷时间，受冷结束后直接将神经从铜槽中移出。同样暴露对侧坐骨神经，不给予低温处理，作为对照。术中大鼠身下用电热毯维持肛门温度在35℃以上。术中每20分钟记录1次循环水及神经的温度。
图1
实验装置的设计[4] 铜质中空管道与制冷装置连接，形成相对的入水和出水端，其转折处形成与坐骨神经直径相当的袖管外型。将神经置于其上，使之不受任何压力。在袖管底部和神经之上可放置测温装置，用于测定制冷温度和神经实际温度，两点间温差不超过0.2℃
1.2.2 动物分组
将12只大鼠随机分组：① 低温组6只，实验侧坐骨神经予以3～5℃持续低温2 h；② 干预组6只，实验侧坐骨神经予以3～5℃持续低温2 h，完毕后立即腹腔注射地塞米松（0.5 mg/kg）。每组于冷损伤后24 h采集坐骨神经标本。同时每只大鼠暴露对侧坐骨神经，不给予低温处理，作为对照。
1.2.3 标本取材、处理
到达取材时间后，麻醉大鼠迅速取下双侧坐骨神经，按以下步骤操作：① 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛中4℃固定2 h；② 0.1 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH值7.4）浸泡3次，10 min/次；③ 四氧化锇固定，乙醇脱水，环氧树脂Epon812包埋；④ 制备1 µm半薄切片，用甲苯胺蓝染色后光学显微镜下观察；⑤ 制备5 nm超薄切片，醋酸铀-枸椽酸铅染色后用荷兰Philips EM208s型透射电子显微镜观察。
2 结果
2.1 大鼠坐骨神经光学显微镜下的形态比较
对照侧坐骨神经仅少量有髓纤维出现空或暗轴索，伴随正常的神经内膜毛细血管（图 2a）。低温组冷损伤后24 h，许多有髓纤维出现以巨大、空或萎缩、暗为形式的轴索退变。由于内皮细胞肿胀，神经内膜毛细血管管腔狭窄（图 2b）。干预组经过地塞米松治疗后，有髓纤维仍可见以巨大、空或萎缩、暗为形式的轴索退变，但神经内膜毛细血管管腔未见狭窄，血管内皮细胞无明显肿胀（图 2c）。
图2
坐骨神经非冻结性冷损伤光学显微镜像（甲苯胺蓝染色×400） 2a. 对照侧坐骨神经 2b. 低温组冷损伤后1 d，神经轴索出现以“暗、空”为主要表现的退变，并出现血管管腔狭窄和内皮细胞肿胀（黑箭） 2c. 干预组地塞米松干预后1 d，可见退变的轴索，但神经内膜血管内皮细胞未见明显肿胀，管腔未见狭窄（黑箭） 图 3 坐骨神经非冻结性冷损伤电子显微镜像 3a. 对照侧神经内膜血管内皮细胞大致正常（醋酸铀-枸椽酸铅染色× 13 000） 3b. 对照侧有髓纤维与无髓纤维基本正常（醋酸铀-枸椽酸铅染色×8 000） 3c. 低温后1 d时低温组神经内膜血管管腔狭窄（黑箭），内皮细胞增生（醋酸铀-枸椽酸铅染色×1 000） 3d. 低温处理后1 d时低温组神经轴膜下水肿、轴索受压（黑箭），其中线粒体固缩（醋酸铀-枸椽酸铅染色×8 000） 3e. 地塞米松干预后，干预组神经内膜血管管腔正常，内皮细胞未见增生，正常红细胞通过管腔（醋酸铀-枸椽酸铅染色×25 000） 3f. 地塞米松干预后，干预组神经有髓纤维髓鞘板层松散，轴索退变、受压无髓纤维大致正常（醋酸铀-枸椽酸铅染色×6 300）
2.2 大鼠坐骨神经电子显微镜下的形态比较
对照侧24 h时仅少量有髓纤维轻微板层松散，无髓纤维与神经内膜血管基本正常（图 3a、3b）。低温组24 h时，坐骨神经的有髓纤维已经出现严重病变（图 3c、3d），表现为：髓鞘板层结构松散，乃至于结构完全消失；轴索轻则微丝溶解，重则结构消失，表现为“空轴索”；无髓纤维基本正常；神经内膜血管管腔狭窄，血管内皮细胞增生，但紧密连接未见破坏，血管内未见血小板激活与红细胞淤滞。经过地塞米松干预后，干预组坐骨神经的有髓纤维病变未见缓解；无髓纤维正常；神经内膜血管管腔正常；血管内皮细胞未见增生，紧密连接未见破坏（图 3e、3f）。
3 讨论
在中枢神经系统内，血脑屏障使脑组织和血液隔绝，并对血液和脑组织之间的多种物质交换进行调控。当机体受到寒冷损伤时，由于氧化损伤导致的血脑屏障渗透性增加，血管内液渗出，引起继发性脑水肿[7]。
在周围神经系统内，神经组织的内环境也由相似的屏障进行维持，该屏障即称为血-神经屏障。它由神经内膜微血管内皮细胞和神经束膜所组成。在大部分常见的周围神经疾病中，如糖尿病周围神经病、周围神经压榨伤，人们都发现了血-神经屏障的破坏[8, 9]。
Jia等[4]发现在非冻结性冷损伤时，坐骨神经微循环变化具有以下特点：① 低温时坐骨神经内的小动脉、毛细血管前动脉、毛细血管和小静脉血流逐渐减慢、中断；低温3 h微循环血流仅为正常值的25%；③ 复温后，坐骨神经内大部分小动脉、小静脉管径轻微增加，出现微小的灌流；复温5 d后微循环血流恢复到正常值的50%。提示坐骨神经非冻结性冷损伤中存在缺血-再灌注现象，必然会导致氧化损伤。而耿志伟等[10, 11]的研究也显示在复温阶段，坐骨神经内氧自由基含量会显著增多。氧自由基对周围神经的损伤主要是破坏微血管内皮细胞，从而破坏血-神经屏障，导致神经内膜水肿[12]。神经内膜存在过多液体将会造成其内部压力的迅速上升[13]，从而降低神经内膜血管直径，引起血流阻力升高，加重神经内膜低氧。Olsson[14]曾指出这种类型的血-神经屏障损害也可能与神经内膜中的肥大细胞脱颗粒释放的血管活性胺有关。血管活性胺可以破坏毛细血管的屏障作用，使其通透性增加。
糖皮质激素具有强大的抗炎和免疫抑制作用，常用来减轻水肿和损伤后的炎症反应。它在治疗神经损伤方面的主要机制是通过与磷脂的牢固结合，防止膜磷脂遭受自由基的攻击和抑制损伤部位的脂质过氧化反应[15]。地塞米松属于糖皮质激素类，具有抗炎、抗休克作用，能够解除小动脉痉挛，改善微循环[16]。本研究发现给予地塞米松治疗坐骨神经非冻结性冷损伤后，神经内膜毛细血管病变得到明显改善，表明地塞米松具有保护血-神经屏障功能的作用。这种保护作用可能既与其抑制氧自由基的损伤作用有关，也与其能够抑制肥大细胞脱颗粒存在一定关系。但值得关注的是，神经内膜的有髓纤维病变并未缓解，提示地塞米松对坐骨神经非冻结性冷损伤的治疗作用可能仅限于血管系统。
目前周围神经非冻结性冷损伤被看作一种“缺血叠加综合征”，其损伤机制除缺血-再灌注损伤以外，还涉及了许多方面[6, 17]：如钠离子通道的异常、主动转运中温度敏感性酶的失活、巨噬细胞对神经纤维的吞噬等，但具体途径仍不清楚。地塞米松仅能够对缺血-再灌注损伤途径产生治疗作用，而不能干预其他损伤途径，因此尚不能完全缓解神经纤维的病变。因此，还应继续开展对其损伤机制的深入研究。在临床上对多个损伤途径同时进行干预可能会取得更好的治疗效果。
自希波克拉底时代起，非冻结性冷损伤影响周围神经的报道就多见于历次战争中，例如两次世界大战及朝鲜战争中的“战壕足”现象。即使在当今的和平年代，非冻结性冷损伤在我国某些人群的发病率也可高达8.7%[1]。2008年雪灾时，非冻结性冷损伤在宁波地区发生率为12.78%，占伤害类型的67.28%，给人民健康带来了不利影响[2]。目前非冻结性冷损伤的发生机制仍未明确，治疗方法也存在误区。治疗方法不当可导致冷损伤的伤残率高达92.8%[3]。本实验在前期研究的基础上[4-6]，探讨地塞米松治疗神经非冻结性冷损伤时的疗效，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
无特定病原体级健康雄性Wistar大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），体质量350～400 g。制冷装置选择德国优莱博公司生产的制冷和加热循环器（F12-ED），测温装置选择优利德专业型数字测温表（UT325A）。
1.2 方法
1.2.1 坐骨神经冷损伤模型
实验模型的制作（图 1）参考Jia等[4]的方法：用2%戊巴比妥钠以0.25 mL/100 g 体质量的剂量腹腔麻醉大鼠。麻醉后大鼠俯卧位固定，在其大腿根部常规备皮、消毒，于菱形窝处皮肤上作一个3 cm长切口，充分暴露坐骨神经后，将其置于已预冷的铜槽中，神经表面滴石蜡油，使神经温度维持在3～5℃。根据实验需要选择受冷时间，受冷结束后直接将神经从铜槽中移出。同样暴露对侧坐骨神经，不给予低温处理，作为对照。术中大鼠身下用电热毯维持肛门温度在35℃以上。术中每20分钟记录1次循环水及神经的温度。
图1
实验装置的设计[4] 铜质中空管道与制冷装置连接，形成相对的入水和出水端，其转折处形成与坐骨神经直径相当的袖管外型。将神经置于其上，使之不受任何压力。在袖管底部和神经之上可放置测温装置，用于测定制冷温度和神经实际温度，两点间温差不超过0.2℃
1.2.2 动物分组
将12只大鼠随机分组：① 低温组6只，实验侧坐骨神经予以3～5℃持续低温2 h；② 干预组6只，实验侧坐骨神经予以3～5℃持续低温2 h，完毕后立即腹腔注射地塞米松（0.5 mg/kg）。每组于冷损伤后24 h采集坐骨神经标本。同时每只大鼠暴露对侧坐骨神经，不给予低温处理，作为对照。
1.2.3 标本取材、处理
到达取材时间后，麻醉大鼠迅速取下双侧坐骨神经，按以下步骤操作：① 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛中4℃固定2 h；② 0.1 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH值7.4）浸泡3次，10 min/次；③ 四氧化锇固定，乙醇脱水，环氧树脂Epon812包埋；④ 制备1 µm半薄切片，用甲苯胺蓝染色后光学显微镜下观察；⑤ 制备5 nm超薄切片，醋酸铀-枸椽酸铅染色后用荷兰Philips EM208s型透射电子显微镜观察。
2 结果
2.1 大鼠坐骨神经光学显微镜下的形态比较
对照侧坐骨神经仅少量有髓纤维出现空或暗轴索，伴随正常的神经内膜毛细血管（图 2a）。低温组冷损伤后24 h，许多有髓纤维出现以巨大、空或萎缩、暗为形式的轴索退变。由于内皮细胞肿胀，神经内膜毛细血管管腔狭窄（图 2b）。干预组经过地塞米松治疗后，有髓纤维仍可见以巨大、空或萎缩、暗为形式的轴索退变，但神经内膜毛细血管管腔未见狭窄，血管内皮细胞无明显肿胀（图 2c）。
图2
坐骨神经非冻结性冷损伤光学显微镜像（甲苯胺蓝染色×400） 2a. 对照侧坐骨神经 2b. 低温组冷损伤后1 d，神经轴索出现以“暗、空”为主要表现的退变，并出现血管管腔狭窄和内皮细胞肿胀（黑箭） 2c. 干预组地塞米松干预后1 d，可见退变的轴索，但神经内膜血管内皮细胞未见明显肿胀，管腔未见狭窄（黑箭） 图 3 坐骨神经非冻结性冷损伤电子显微镜像 3a. 对照侧神经内膜血管内皮细胞大致正常（醋酸铀-枸椽酸铅染色× 13 000） 3b. 对照侧有髓纤维与无髓纤维基本正常（醋酸铀-枸椽酸铅染色×8 000） 3c. 低温后1 d时低温组神经内膜血管管腔狭窄（黑箭），内皮细胞增生（醋酸铀-枸椽酸铅染色×1 000） 3d. 低温处理后1 d时低温组神经轴膜下水肿、轴索受压（黑箭），其中线粒体固缩（醋酸铀-枸椽酸铅染色×8 000） 3e. 地塞米松干预后，干预组神经内膜血管管腔正常，内皮细胞未见增生，正常红细胞通过管腔（醋酸铀-枸椽酸铅染色×25 000） 3f. 地塞米松干预后，干预组神经有髓纤维髓鞘板层松散，轴索退变、受压无髓纤维大致正常（醋酸铀-枸椽酸铅染色×6 300）
2.2 大鼠坐骨神经电子显微镜下的形态比较
对照侧24 h时仅少量有髓纤维轻微板层松散，无髓纤维与神经内膜血管基本正常（图 3a、3b）。低温组24 h时，坐骨神经的有髓纤维已经出现严重病变（图 3c、3d），表现为：髓鞘板层结构松散，乃至于结构完全消失；轴索轻则微丝溶解，重则结构消失，表现为“空轴索”；无髓纤维基本正常；神经内膜血管管腔狭窄，血管内皮细胞增生，但紧密连接未见破坏，血管内未见血小板激活与红细胞淤滞。经过地塞米松干预后，干预组坐骨神经的有髓纤维病变未见缓解；无髓纤维正常；神经内膜血管管腔正常；血管内皮细胞未见增生，紧密连接未见破坏（图 3e、3f）。
3 讨论
在中枢神经系统内，血脑屏障使脑组织和血液隔绝，并对血液和脑组织之间的多种物质交换进行调控。当机体受到寒冷损伤时，由于氧化损伤导致的血脑屏障渗透性增加，血管内液渗出，引起继发性脑水肿[7]。
在周围神经系统内，神经组织的内环境也由相似的屏障进行维持，该屏障即称为血-神经屏障。它由神经内膜微血管内皮细胞和神经束膜所组成。在大部分常见的周围神经疾病中，如糖尿病周围神经病、周围神经压榨伤，人们都发现了血-神经屏障的破坏[8, 9]。
Jia等[4]发现在非冻结性冷损伤时，坐骨神经微循环变化具有以下特点：① 低温时坐骨神经内的小动脉、毛细血管前动脉、毛细血管和小静脉血流逐渐减慢、中断；低温3 h微循环血流仅为正常值的25%；③ 复温后，坐骨神经内大部分小动脉、小静脉管径轻微增加，出现微小的灌流；复温5 d后微循环血流恢复到正常值的50%。提示坐骨神经非冻结性冷损伤中存在缺血-再灌注现象，必然会导致氧化损伤。而耿志伟等[10, 11]的研究也显示在复温阶段，坐骨神经内氧自由基含量会显著增多。氧自由基对周围神经的损伤主要是破坏微血管内皮细胞，从而破坏血-神经屏障，导致神经内膜水肿[12]。神经内膜存在过多液体将会造成其内部压力的迅速上升[13]，从而降低神经内膜血管直径，引起血流阻力升高，加重神经内膜低氧。Olsson[14]曾指出这种类型的血-神经屏障损害也可能与神经内膜中的肥大细胞脱颗粒释放的血管活性胺有关。血管活性胺可以破坏毛细血管的屏障作用，使其通透性增加。
糖皮质激素具有强大的抗炎和免疫抑制作用，常用来减轻水肿和损伤后的炎症反应。它在治疗神经损伤方面的主要机制是通过与磷脂的牢固结合，防止膜磷脂遭受自由基的攻击和抑制损伤部位的脂质过氧化反应[15]。地塞米松属于糖皮质激素类，具有抗炎、抗休克作用，能够解除小动脉痉挛，改善微循环[16]。本研究发现给予地塞米松治疗坐骨神经非冻结性冷损伤后，神经内膜毛细血管病变得到明显改善，表明地塞米松具有保护血-神经屏障功能的作用。这种保护作用可能既与其抑制氧自由基的损伤作用有关，也与其能够抑制肥大细胞脱颗粒存在一定关系。但值得关注的是，神经内膜的有髓纤维病变并未缓解，提示地塞米松对坐骨神经非冻结性冷损伤的治疗作用可能仅限于血管系统。
目前周围神经非冻结性冷损伤被看作一种“缺血叠加综合征”，其损伤机制除缺血-再灌注损伤以外，还涉及了许多方面[6, 17]：如钠离子通道的异常、主动转运中温度敏感性酶的失活、巨噬细胞对神经纤维的吞噬等，但具体途径仍不清楚。地塞米松仅能够对缺血-再灌注损伤途径产生治疗作用，而不能干预其他损伤途径，因此尚不能完全缓解神经纤维的病变。因此，还应继续开展对其损伤机制的深入研究。在临床上对多个损伤途径同时进行干预可能会取得更好的治疗效果。
