引用本文： 姬巧云, 张会东, 罗珊, 毛萌. 不同营养模式对宫内发育迟缓幼鼠胰岛素样生长因子及受体表达的影响. 华西医学, 2014, 29(2): 277-281. doi: 10.7507/1002-0179.20140085 复制
胰岛素样生长因子（IGF）在胎儿早期生长发育过程中可能起着重要的作用。1957年Salmon等[1]发现生长激素（GH）是通过IGF介导而发挥其硫酸盐活性。IGF包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ分别由70个氨基酸和167个氨基酸组成，相对分子质量7 647×103。宫内发育迟缓（IUGR）的病因多而复杂，有研究表明IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ系统在其发病中有重要作用[2, 3]。多肽糖蛋白金属蛋白酶12（ADAM-12）和孕期相关血浆蛋白酶A（PAPP-A）是属于IGF系统中的两个因子[4, 5]，在生长发育过程当中非常重要，而且ADAM12和PAPP-A的量与染色体的异常性相关，特别是与糖尿病中胰岛素的分泌量具有相关性，因此通过检测ADAM12和PAPP-A可以了解IUGR发生后追赶生长过程中IUGR与继发性糖尿病之间的关联性。IGF主要通过与Toll样受体（TLR-4）相互作用而在机体发挥作用，但是TLR-4可以通过信号传导途径引起炎症因子的分泌增加，引起脂肪炎症和胰岛素抵抗[6, 7]。因此，有必要考察和研究IGF及其受体在IUGR及其继发性糖尿病发生发展过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
无交配史SD健康大鼠30只，雌雄2︰1分笼饲养，日龄70～80 d，体质量220～250 g，由成都血液病研究所动物中心提供。大鼠饲养在安静、通风、清洁的环境中，保持室温23～25℃，湿度60%，给予相应的饲料和充足的饮水。雌鼠与雄鼠交配受孕后，母鼠采用全程饥饿法建立IUGR动物模型[8]，母鼠分为未怀孕对照组、怀孕对照组和怀孕实验组；未怀孕对照组和怀孕对照组给予充足的标准饲料；怀孕实验组给予标准饲料，为怀孕对照组的一半。怀孕对照组大鼠生下幼鼠后给予充足的正常标准饲料。实验组母鼠受孕后第1天起给予对照组50%的进食量，直至自然分娩。所生新生仔鼠出生体质量在正常新生仔鼠平均体质量减去2倍标准差以下者为IUGR新生鼠，鼠仔每窝超过10只以上者随机舍弃部分鼠仔，使每窝鼠仔控制在8～10只。IUGR新生幼鼠随机分为4组，新生幼鼠母乳喂养，各组分别给予母鼠上述相应饮食饲料喂养3周至断乳：① IUGR对照组给予常规饮食；② IUGR高糖饮食组（A组）；③ IUGR高蛋白饮食组（B组）；④ IUGR高脂饮食组（C组）。各组幼鼠在3周哺乳期间母鼠分别摄取上述饲料。各组幼鼠断乳后分别摄取上述饲料至满月。另以正常母鼠所生正常新生雌鼠为正常对照组（C/N组）。生后母乳喂养至3周断乳，母鼠及断乳后幼鼠均给予常规饮食喂养。
1.2 饲料构成
本实验所需饲料由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。其配方如下：① 标准饲料配方：豆粉10%、大麦粉20%、鱼粉10%、玉米粉16%、骨粉5%、酵母1%、脱水菜20%、食盐2%；② 高蛋白饲料配方：在标准饲料蛋白含量的基础上增加20%的蛋白，即25.2 kg的标准饲料加入1.65 kg鸡蛋；③ 高糖饲料配方：在标准饲料糖含量的基础上增加20%的糖，即25.2 kg的标准饲料加入6.95 kg白糖；④ 高脂肪饲料配方：在标准饲料脂肪含量的基础上增加20%的脂肪，即25.2 kg的标准饲料加入0.277 kg的猪油。
1.3 肝组织和肺组织的免疫组织化学染色
各组新生幼鼠满1、2、3、4月龄时分别随机处死6只，处死后立即取组织进行染色。载玻片采用Poly-L-Lysine法进行处理。幼鼠的肝、肺采用4%的中性多聚甲醛固定液4℃固定，用石蜡包埋切片，每个石蜡标本连续4 μm厚连续切片3张备用。免疫组织化学采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）法进行染色，一抗采用购自美国Invitrogen公司的兔抗鼠的多克隆抗体，稀释度为1︰200，二抗采用购自美国Invitrogen公司的羊抗兔的多克隆抗体，稀释度为1︰50。石蜡切片二甲苯脱蜡，枸橼酸盐修复抗原，加入一抗后4℃过夜，磷酸盐缓冲液（PBS） 洗3次，加入二抗，30 min后PBS洗3次，加入辣根过氧化物酶（HRP），30 min后PBS洗4次，二氨基联苯胺（DAB）显色，冷水终止，苏木精衬染，脱水后封固处理 。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知的阳性对照片作为阳性对照。
结果判定和分析：① 染色结果的观察：阳性结果表现为相应部位出现黄色-棕褐色颗粒物质；② 显微图像采集系统内观察组织抗原的表达情况，每张切片随机选取6个不同视野进行观察，采用Image-pro plus 5.0软件进行图像分析。
1.4 胰腺组织的染色
组织切片后采用苏木精-伊红（HE）染色。幼鼠的肝、肺采用4%的中性多聚甲醛固定液4℃固定，用石蜡包埋切片，每个石蜡标本连续4 μm厚连续切片3 张备用。石蜡切片二甲苯脱蜡，苏木精染色2 min，盐酸乙醇分化20 s，自来水洗终止，伊红染色30 s，自来水洗，乙醇脱水，用盖玻片封好后显微镜观察幼鼠胰腺组织的细胞形态。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件包对数据进行处理和统计学分析，资料采用秩和检验，以P值＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 ADAM12的检测结果
幼鼠ADAM12的测定结果各个月之间均无统计学意义（P＞0.05）。见表 1、图 1。
图1
肝ADAM12的免疫组织化学染色像（SP×400） 1a.阴性结果 1b.阳性结果（+） 1c.阳性结果（++） 1d.阳性结果（+++） 图 2 肝PAPP-A的免疫组织化学染色像（SP×400） 2a.阴性结果 2b.阳性结果（+） 2c. 阳性结果（++） 2d.阳性结果（+++） 图 3肺TLR-4的免疫组织化学染色像（SP×400） 3a.阴性结果 3b.阳性结果（+） 3c. 阳性结果（++） 3d.阳性结果（+++） 图 4胰腺组织的HE染色像（HE×400） 阴阳性的结果判定是出血和炎性细胞的浸润 4a. 胰腺组织阴性对照 4b.胰腺组织阳性结果
表1
各组幼鼠不同时间的ADAM12阳性结果（n=6，例）
2.2 PAPP-A的测定结果
幼鼠PAPP-A的测定结果在各组幼鼠的第1个月有统计学意义（P＜0.05），但是在第2、3、4个月无统计学意义（P＞0.05）。见表 2、图 2。
表2
各组幼鼠不同时间的PAPP-A阳性结果（n=6，例）
2.3 TLR-4的测定结果
幼鼠TIR-4的测定结果各个月之间无统计学意义（P＞0.05）。见表 3、图 3。
表3
各组幼鼠不同时间的TLR-4阳性结果（n=6，例）
2.4 胰腺组织染色的结果
幼鼠胰腺组织结果在幼鼠的第1个月有统计学意义（P＜0.05），但是在第2、3、4个月无统计学意义（P＞0.05）。见表 4、图 4。
表4
各组幼鼠不同时间的胰腺组织染色阳性结果（n=6，例）
3 讨论
IUGR是妊娠的重要结局，也是造成围产儿死亡的重要原因之一，其死亡率为正常新生儿的4～6 倍[9]，同时IUGR约有10%～20%生后未能追赶生长，成年期后仍持续保持小个体矮身材。1998年Lucas[10]基于早期营养对生长的重要作用，提出了“营养程序化”的概念，即在发育的关键或敏感时期的营养状况，将对机体或功能产生长期或终生的影响。目前研究表明生后早期的生长主要受“营养物质-胰岛素-胰岛素样生长因子”代谢轴的调控[11-13]，该时期IGF的启动因素是营养物质，而且经由胰岛素而非生长激素介导分泌的。IGF是体内一种既有胰岛素样合成代谢作用又有促生长作用的多肽，包括IGFⅠ和IGFⅡ，可由多种组织产生和分泌，肝脏是主要的合成场所，它们主要通过与IGF 受体相互作用而发挥其促生长和胰岛素样代谢效应[11]，其中IGFⅠ在早期生长中起主要作用。IGFⅠ可以通过刺激细胞分化增殖，抑制蛋白质分解，增强机体对葡萄糖、氨基酸摄取，从而促进生长。生后早期营养是IGFⅠ的重要调节因子，血清中IGFⅠ水平可反映当时的营养状态和营养不良的程度。Ozkan等[14]报道呈现生长追赶的IUGR患儿IGFⅠ水平显著高于不出现生长追赶的IUGR患儿，提示IGFⅠ与IUGR患儿的早期生长追赶关系密切。
ADAM12和PAPP-A是属于IGF系统中的两个因子[2, 3]，在生长发育过程中非常重要，而且ADAM12和PAPP-A的量与染色体的异常性相关，特别是与糖尿病中胰岛素的分泌量具有相关性。本研究发现ADAM12在实验组和对照组之间没有明显的统计学意义，但是在第1个月和第4个月这两个时间点P值很接近0.05，可能是样本量偏少的缘故，值得进一步扩大样本进行研究。同时本研究也发现PAPP-A在第1个月的时间点有统计学意义，其他时间点没有统计学意义；在第1个月的时间点的结果，高脂饮食组的数据要比其他组的高。ADAM12和PAPP-A的结果提示ADAM12和PAPP-A的表达量或许与幼鼠的追赶生长密切相关，这时由于受到动物脂质代谢的影响，高脂饮食组的PAPP-A还偏高；同时表明“营养物质-胰岛素-胰岛素样生长因子”代谢轴在动物的追赶生长过程中确实起着重要作用。
IGF在体内的受体为TLR-4，该受体与炎症因子的产生密切相关[15, 16]，也可能与急性坏死性胰腺炎相关[6]。有研究表明TLR-4与脂肪炎症和胰岛素抵抗有密切关系[4, 17, 18]，同时TLR-4也与糖尿病及其并发症的发生、发展有密切关系[19, 20]，因此可通过对该受体的检测了解IUGR与发生继发糖尿病之间有无一定的关联。本研究中TLR-4的检测结果在统计学上无明显的意义，但是我们可以看到对照组中TLR-4的阳性程度基本上处于稳定状态，高蛋白饮食组的阳性程度在逐步降低，而高糖饮食组和高脂饮食组的阳性程度在逐步增加，而且高糖组增加的幅度在增大。胰腺组织在糖尿病发生过程中有细胞变性或者功能下降的表现，本研究结果显示胰腺组织的结果在第1个月时间点具有统计学意义，其他3个时间点无统计学意义；但是对照组基本上都处于阴性，高蛋白饮食组先有阳性，但最后消失，而高糖饮食组和高脂饮食组早期呈阴性结果，但随着时间的推移，阳性结果在增加，说明胰腺发生炎症的可能性比较大。但是由于样本量、观察时间的关系，实验结果并不太明显，这需要进一步的实验加以验证。
综上所述，不同的营养模式对IUGR幼鼠IGF的表达在追赶生长过程中具有一定的影响，但是在追赶生长结束后基本上无影响；但是不同的营养模式对IUGR幼鼠IGF受体表达的影响在追赶生长结束后可能更大一些。
胰岛素样生长因子（IGF）在胎儿早期生长发育过程中可能起着重要的作用。1957年Salmon等[1]发现生长激素（GH）是通过IGF介导而发挥其硫酸盐活性。IGF包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ分别由70个氨基酸和167个氨基酸组成，相对分子质量7 647×103。宫内发育迟缓（IUGR）的病因多而复杂，有研究表明IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ系统在其发病中有重要作用[2, 3]。多肽糖蛋白金属蛋白酶12（ADAM-12）和孕期相关血浆蛋白酶A（PAPP-A）是属于IGF系统中的两个因子[4, 5]，在生长发育过程当中非常重要，而且ADAM12和PAPP-A的量与染色体的异常性相关，特别是与糖尿病中胰岛素的分泌量具有相关性，因此通过检测ADAM12和PAPP-A可以了解IUGR发生后追赶生长过程中IUGR与继发性糖尿病之间的关联性。IGF主要通过与Toll样受体（TLR-4）相互作用而在机体发挥作用，但是TLR-4可以通过信号传导途径引起炎症因子的分泌增加，引起脂肪炎症和胰岛素抵抗[6, 7]。因此，有必要考察和研究IGF及其受体在IUGR及其继发性糖尿病发生发展过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
无交配史SD健康大鼠30只，雌雄2︰1分笼饲养，日龄70～80 d，体质量220～250 g，由成都血液病研究所动物中心提供。大鼠饲养在安静、通风、清洁的环境中，保持室温23～25℃，湿度60%，给予相应的饲料和充足的饮水。雌鼠与雄鼠交配受孕后，母鼠采用全程饥饿法建立IUGR动物模型[8]，母鼠分为未怀孕对照组、怀孕对照组和怀孕实验组；未怀孕对照组和怀孕对照组给予充足的标准饲料；怀孕实验组给予标准饲料，为怀孕对照组的一半。怀孕对照组大鼠生下幼鼠后给予充足的正常标准饲料。实验组母鼠受孕后第1天起给予对照组50%的进食量，直至自然分娩。所生新生仔鼠出生体质量在正常新生仔鼠平均体质量减去2倍标准差以下者为IUGR新生鼠，鼠仔每窝超过10只以上者随机舍弃部分鼠仔，使每窝鼠仔控制在8～10只。IUGR新生幼鼠随机分为4组，新生幼鼠母乳喂养，各组分别给予母鼠上述相应饮食饲料喂养3周至断乳：① IUGR对照组给予常规饮食；② IUGR高糖饮食组（A组）；③ IUGR高蛋白饮食组（B组）；④ IUGR高脂饮食组（C组）。各组幼鼠在3周哺乳期间母鼠分别摄取上述饲料。各组幼鼠断乳后分别摄取上述饲料至满月。另以正常母鼠所生正常新生雌鼠为正常对照组（C/N组）。生后母乳喂养至3周断乳，母鼠及断乳后幼鼠均给予常规饮食喂养。
1.2 饲料构成
本实验所需饲料由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。其配方如下：① 标准饲料配方：豆粉10%、大麦粉20%、鱼粉10%、玉米粉16%、骨粉5%、酵母1%、脱水菜20%、食盐2%；② 高蛋白饲料配方：在标准饲料蛋白含量的基础上增加20%的蛋白，即25.2 kg的标准饲料加入1.65 kg鸡蛋；③ 高糖饲料配方：在标准饲料糖含量的基础上增加20%的糖，即25.2 kg的标准饲料加入6.95 kg白糖；④ 高脂肪饲料配方：在标准饲料脂肪含量的基础上增加20%的脂肪，即25.2 kg的标准饲料加入0.277 kg的猪油。
1.3 肝组织和肺组织的免疫组织化学染色
各组新生幼鼠满1、2、3、4月龄时分别随机处死6只，处死后立即取组织进行染色。载玻片采用Poly-L-Lysine法进行处理。幼鼠的肝、肺采用4%的中性多聚甲醛固定液4℃固定，用石蜡包埋切片，每个石蜡标本连续4 μm厚连续切片3张备用。免疫组织化学采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）法进行染色，一抗采用购自美国Invitrogen公司的兔抗鼠的多克隆抗体，稀释度为1︰200，二抗采用购自美国Invitrogen公司的羊抗兔的多克隆抗体，稀释度为1︰50。石蜡切片二甲苯脱蜡，枸橼酸盐修复抗原，加入一抗后4℃过夜，磷酸盐缓冲液（PBS） 洗3次，加入二抗，30 min后PBS洗3次，加入辣根过氧化物酶（HRP），30 min后PBS洗4次，二氨基联苯胺（DAB）显色，冷水终止，苏木精衬染，脱水后封固处理 。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知的阳性对照片作为阳性对照。
结果判定和分析：① 染色结果的观察：阳性结果表现为相应部位出现黄色-棕褐色颗粒物质；② 显微图像采集系统内观察组织抗原的表达情况，每张切片随机选取6个不同视野进行观察，采用Image-pro plus 5.0软件进行图像分析。
1.4 胰腺组织的染色
组织切片后采用苏木精-伊红（HE）染色。幼鼠的肝、肺采用4%的中性多聚甲醛固定液4℃固定，用石蜡包埋切片，每个石蜡标本连续4 μm厚连续切片3 张备用。石蜡切片二甲苯脱蜡，苏木精染色2 min，盐酸乙醇分化20 s，自来水洗终止，伊红染色30 s，自来水洗，乙醇脱水，用盖玻片封好后显微镜观察幼鼠胰腺组织的细胞形态。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件包对数据进行处理和统计学分析，资料采用秩和检验，以P值＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 ADAM12的检测结果
幼鼠ADAM12的测定结果各个月之间均无统计学意义（P＞0.05）。见表 1、图 1。
图1
肝ADAM12的免疫组织化学染色像（SP×400） 1a.阴性结果 1b.阳性结果（+） 1c.阳性结果（++） 1d.阳性结果（+++） 图 2 肝PAPP-A的免疫组织化学染色像（SP×400） 2a.阴性结果 2b.阳性结果（+） 2c. 阳性结果（++） 2d.阳性结果（+++） 图 3肺TLR-4的免疫组织化学染色像（SP×400） 3a.阴性结果 3b.阳性结果（+） 3c. 阳性结果（++） 3d.阳性结果（+++） 图 4胰腺组织的HE染色像（HE×400） 阴阳性的结果判定是出血和炎性细胞的浸润 4a. 胰腺组织阴性对照 4b.胰腺组织阳性结果
表1
各组幼鼠不同时间的ADAM12阳性结果（n=6，例）
2.2 PAPP-A的测定结果
幼鼠PAPP-A的测定结果在各组幼鼠的第1个月有统计学意义（P＜0.05），但是在第2、3、4个月无统计学意义（P＞0.05）。见表 2、图 2。
表2
各组幼鼠不同时间的PAPP-A阳性结果（n=6，例）
2.3 TLR-4的测定结果
幼鼠TIR-4的测定结果各个月之间无统计学意义（P＞0.05）。见表 3、图 3。
表3
各组幼鼠不同时间的TLR-4阳性结果（n=6，例）
2.4 胰腺组织染色的结果
幼鼠胰腺组织结果在幼鼠的第1个月有统计学意义（P＜0.05），但是在第2、3、4个月无统计学意义（P＞0.05）。见表 4、图 4。
表4
各组幼鼠不同时间的胰腺组织染色阳性结果（n=6，例）
3 讨论
IUGR是妊娠的重要结局，也是造成围产儿死亡的重要原因之一，其死亡率为正常新生儿的4～6 倍[9]，同时IUGR约有10%～20%生后未能追赶生长，成年期后仍持续保持小个体矮身材。1998年Lucas[10]基于早期营养对生长的重要作用，提出了“营养程序化”的概念，即在发育的关键或敏感时期的营养状况，将对机体或功能产生长期或终生的影响。目前研究表明生后早期的生长主要受“营养物质-胰岛素-胰岛素样生长因子”代谢轴的调控[11-13]，该时期IGF的启动因素是营养物质，而且经由胰岛素而非生长激素介导分泌的。IGF是体内一种既有胰岛素样合成代谢作用又有促生长作用的多肽，包括IGFⅠ和IGFⅡ，可由多种组织产生和分泌，肝脏是主要的合成场所，它们主要通过与IGF 受体相互作用而发挥其促生长和胰岛素样代谢效应[11]，其中IGFⅠ在早期生长中起主要作用。IGFⅠ可以通过刺激细胞分化增殖，抑制蛋白质分解，增强机体对葡萄糖、氨基酸摄取，从而促进生长。生后早期营养是IGFⅠ的重要调节因子，血清中IGFⅠ水平可反映当时的营养状态和营养不良的程度。Ozkan等[14]报道呈现生长追赶的IUGR患儿IGFⅠ水平显著高于不出现生长追赶的IUGR患儿，提示IGFⅠ与IUGR患儿的早期生长追赶关系密切。
ADAM12和PAPP-A是属于IGF系统中的两个因子[2, 3]，在生长发育过程中非常重要，而且ADAM12和PAPP-A的量与染色体的异常性相关，特别是与糖尿病中胰岛素的分泌量具有相关性。本研究发现ADAM12在实验组和对照组之间没有明显的统计学意义，但是在第1个月和第4个月这两个时间点P值很接近0.05，可能是样本量偏少的缘故，值得进一步扩大样本进行研究。同时本研究也发现PAPP-A在第1个月的时间点有统计学意义，其他时间点没有统计学意义；在第1个月的时间点的结果，高脂饮食组的数据要比其他组的高。ADAM12和PAPP-A的结果提示ADAM12和PAPP-A的表达量或许与幼鼠的追赶生长密切相关，这时由于受到动物脂质代谢的影响，高脂饮食组的PAPP-A还偏高；同时表明“营养物质-胰岛素-胰岛素样生长因子”代谢轴在动物的追赶生长过程中确实起着重要作用。
IGF在体内的受体为TLR-4，该受体与炎症因子的产生密切相关[15, 16]，也可能与急性坏死性胰腺炎相关[6]。有研究表明TLR-4与脂肪炎症和胰岛素抵抗有密切关系[4, 17, 18]，同时TLR-4也与糖尿病及其并发症的发生、发展有密切关系[19, 20]，因此可通过对该受体的检测了解IUGR与发生继发糖尿病之间有无一定的关联。本研究中TLR-4的检测结果在统计学上无明显的意义，但是我们可以看到对照组中TLR-4的阳性程度基本上处于稳定状态，高蛋白饮食组的阳性程度在逐步降低，而高糖饮食组和高脂饮食组的阳性程度在逐步增加，而且高糖组增加的幅度在增大。胰腺组织在糖尿病发生过程中有细胞变性或者功能下降的表现，本研究结果显示胰腺组织的结果在第1个月时间点具有统计学意义，其他3个时间点无统计学意义；但是对照组基本上都处于阴性，高蛋白饮食组先有阳性，但最后消失，而高糖饮食组和高脂饮食组早期呈阴性结果，但随着时间的推移，阳性结果在增加，说明胰腺发生炎症的可能性比较大。但是由于样本量、观察时间的关系，实验结果并不太明显，这需要进一步的实验加以验证。
综上所述，不同的营养模式对IUGR幼鼠IGF的表达在追赶生长过程中具有一定的影响，但是在追赶生长结束后基本上无影响；但是不同的营养模式对IUGR幼鼠IGF受体表达的影响在追赶生长结束后可能更大一些。
