引用本文： 廖娟, 曾素根, 江虹, 贾劲, 左成华, 王霞, 周静. 应用Spife Combo电泳仪进行血红蛋白电泳的质量保证及特殊故障分析. 华西医学, 2014, 29(5): 999-1000. doi: 10.7507/1002-0179.20140305 复制
血红蛋白电泳分析是诊断和分离异常血红蛋白的有效方法，是用于地中海贫血筛查的常规实验手段[1]。美国Helena公司生产的Combo电泳仪是集电泳、染色、脱色、烘干于一体，通过扫描系统扫描，得出血红蛋白各组分的百分比进行地中海贫血筛查。但使用该仪器进行血红蛋白电泳操作较繁琐，包括标本前处理、电泳仪操作、染色、扫描等步骤，且手工操作多质量控制较难，对操作者的技术要求较高：配制血红蛋白液，点样时间的掌握，每次电泳均应有标准质控品，另外仪器的好坏也对结果的准确性影响较大。现就我们使用Spife Combo全自动电泳仪进行血红蛋白电泳时的质量控制及特殊故障分析处理总结如下。
1 血红蛋白电泳的质量控制
1.1 制备血红蛋白液的质量控制
由于血红蛋白液浓度与电泳效果密切相关，所以，血红蛋白液的制备是血红蛋白电泳中质量控制最重要的环节。用生理盐水对红细胞进行充分洗涤后，再用Hemolysata溶血剂制备血红蛋白液时，红细胞与溶血剂比例为1︰7至1︰8时其电泳的效果最好；如果红细胞与溶血剂比例高于1︰5，使血红蛋白液浓度过高，影响各区带的分离及发生拖尾现象；反之，如果红细胞与溶血剂比例低于1︰11，使血红蛋白浓度过低，将导致某些微量的异常血红蛋白区带消失而漏检。同一样本，制备成不同浓度的血红蛋白液，红细胞与溶血剂比例分别为1︰5、1︰8、1︰11和1︰15，其电泳效果不同，见图 1。
图1
同一样本红细胞与溶血剂不同比例碱性血红蛋白电泳效果图
1.2 电泳仪操作的质量控制
平铺凝胶膜在电泳板上时，避免产生气泡，用滤纸吸去凝胶膜上多余的缓冲液，不能吸得过干，否则电泳距离会缩短即从点样点到血红蛋白A之间的距离变短。点样时间一般控制在30 s和60 s；如果点样时间过长，可使区带颜色过深，以及脱色时区带出现驳脱等而影响电泳效果。电泳时运用575 V的高压可能造成碳棒被损坏，导致电极未联。每次电泳时要检查碳棒和电泳槽盖，电泳时需成一封闭体系。使用美国Helena公司提供的AFSA2定值质控品（血红蛋白A、血红蛋白F、血红蛋白S、血红蛋白A2），血红蛋白F、血红蛋白S是最常见的病理性血红蛋白。质控品应贮存在2～8℃，不能稀释使用。
1.3 染色的质量控制
在使用酸兰染色时，按照试剂说明书，每6个月新配制1次。但我们在工作中发现，每月配制1次，其染色效果更好且背景更清晰。值得一提的是，当染色效果较差，如染色结束时凝胶片可见明显划痕，出现部份凝胶脱落。应检测染色液的pH值，清洗染色槽或更换新的染液。
1.4 扫描的质量控制
当染色结束后，立即对血红蛋白区带进行扫描。AFSA2质控品包含已知浓度血红蛋白A和血红蛋白A2、血红蛋白S、血红蛋白F，扫描得到的血红蛋白AFSA2质控品的曲线作为该次电泳图谱的标准曲线，进行其他曲线切割点的增减，便于异常结果的判断和各成分含量的划分。当质控结果超出给定的范围时首先检查质控品是否在有效期内的同时检查仪器，最后再次电泳。
2 仪器特殊故障分析处理
2.1 电泳区带出现空斑现象
区带出现空斑现象，见图 2。由于仪器无报警提示，仪器工程师也未遇见该现象。我们通过对血红蛋白浓度、点样时间、电泳仪电压等不同方面进行调整，最终发现该现象是由于电泳仪的程序出现故障所致。电泳仪处于正常状态时，在电泳结束时会自动烘干凝胶膜，再进行染色；烘干的血红蛋白与染液结合不能很好固定，洗脱时，未固定的血红蛋白易被洗液洗脱而形成空斑。因此电泳后不必烘干，而染色后必须烘干。
图2
出现空斑现象的碱性血红蛋白电泳图
2.2 电泳结束凝胶片脱色不完全，凝胶膜背景呈蓝色
由于电泳仪在进行染色过程中，烘干出现异常，使凝胶膜烘干不彻底，导致脱色不完全，凝胶膜背景呈蓝色（图 3），影响血红蛋白区带扫描的效果。电泳仪面板显示温度正常，检查电泳仪实际烘干温度发现比面板显示温度低，经工程师调整仪器恢复正常。Spife Combo电泳仪有专用温度校准仪，定时对电泳仪的温度进行校准是必要的。
图3
脱色不全的碱性血红蛋白电泳图
3 讨论
血红蛋白电泳分析是地中海贫血和其他异常血红蛋白病诊断的常用方法，临床常用醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、毛细血管电泳、柱层析等方法。琼脂糖凝胶电泳血红蛋白A2区带清晰，血红蛋白F区带分辨力高[2]，是目前推荐的电泳方法。由于血红蛋白的分子生物学检测方法条件要求高，方法繁琐，尚不能广泛应用于各级医院特别是基层医院[1]。因此，快速、实用的血红蛋白电泳在地中海贫血的早期筛查中起到非常重要的作用，血红蛋白电泳时的质量控制显得尤其重要。
我室从2007年开始使用美国Helena公司的Spife Combo全自动电泳仪发现该仪器检测结果稳定、容易维护保养。但仪器良好的性能需要正确的使用和开展质量控制。我们对血红蛋白电泳的质量控制积累了一定的经验，除平时严格按照仪器说明书的要求，对仪器做好每日、每周、每月维护保养，以减少仪器的故障率外，还强调对操作中的各个环节进行质量控制。建立完整的标准操作程序，对人员进行培训；建立对仪器的定期校准、室内质量控制、室间质量评价制度，使用原装配套试剂，对仪器的电泳系统、染色系统、图像扫描系统等进行严格的性能监控。通过对血红蛋白液的制备、点样的时间等进行标准化操作，能使血红蛋白电泳的结果准确可靠，为临床提供有价值的数据。
血红蛋白电泳分析是诊断和分离异常血红蛋白的有效方法，是用于地中海贫血筛查的常规实验手段[1]。美国Helena公司生产的Combo电泳仪是集电泳、染色、脱色、烘干于一体，通过扫描系统扫描，得出血红蛋白各组分的百分比进行地中海贫血筛查。但使用该仪器进行血红蛋白电泳操作较繁琐，包括标本前处理、电泳仪操作、染色、扫描等步骤，且手工操作多质量控制较难，对操作者的技术要求较高：配制血红蛋白液，点样时间的掌握，每次电泳均应有标准质控品，另外仪器的好坏也对结果的准确性影响较大。现就我们使用Spife Combo全自动电泳仪进行血红蛋白电泳时的质量控制及特殊故障分析处理总结如下。
1 血红蛋白电泳的质量控制
1.1 制备血红蛋白液的质量控制
由于血红蛋白液浓度与电泳效果密切相关，所以，血红蛋白液的制备是血红蛋白电泳中质量控制最重要的环节。用生理盐水对红细胞进行充分洗涤后，再用Hemolysata溶血剂制备血红蛋白液时，红细胞与溶血剂比例为1︰7至1︰8时其电泳的效果最好；如果红细胞与溶血剂比例高于1︰5，使血红蛋白液浓度过高，影响各区带的分离及发生拖尾现象；反之，如果红细胞与溶血剂比例低于1︰11，使血红蛋白浓度过低，将导致某些微量的异常血红蛋白区带消失而漏检。同一样本，制备成不同浓度的血红蛋白液，红细胞与溶血剂比例分别为1︰5、1︰8、1︰11和1︰15，其电泳效果不同，见图 1。
图1
同一样本红细胞与溶血剂不同比例碱性血红蛋白电泳效果图
1.2 电泳仪操作的质量控制
平铺凝胶膜在电泳板上时，避免产生气泡，用滤纸吸去凝胶膜上多余的缓冲液，不能吸得过干，否则电泳距离会缩短即从点样点到血红蛋白A之间的距离变短。点样时间一般控制在30 s和60 s；如果点样时间过长，可使区带颜色过深，以及脱色时区带出现驳脱等而影响电泳效果。电泳时运用575 V的高压可能造成碳棒被损坏，导致电极未联。每次电泳时要检查碳棒和电泳槽盖，电泳时需成一封闭体系。使用美国Helena公司提供的AFSA2定值质控品（血红蛋白A、血红蛋白F、血红蛋白S、血红蛋白A2），血红蛋白F、血红蛋白S是最常见的病理性血红蛋白。质控品应贮存在2～8℃，不能稀释使用。
1.3 染色的质量控制
在使用酸兰染色时，按照试剂说明书，每6个月新配制1次。但我们在工作中发现，每月配制1次，其染色效果更好且背景更清晰。值得一提的是，当染色效果较差，如染色结束时凝胶片可见明显划痕，出现部份凝胶脱落。应检测染色液的pH值，清洗染色槽或更换新的染液。
1.4 扫描的质量控制
当染色结束后，立即对血红蛋白区带进行扫描。AFSA2质控品包含已知浓度血红蛋白A和血红蛋白A2、血红蛋白S、血红蛋白F，扫描得到的血红蛋白AFSA2质控品的曲线作为该次电泳图谱的标准曲线，进行其他曲线切割点的增减，便于异常结果的判断和各成分含量的划分。当质控结果超出给定的范围时首先检查质控品是否在有效期内的同时检查仪器，最后再次电泳。
2 仪器特殊故障分析处理
2.1 电泳区带出现空斑现象
区带出现空斑现象，见图 2。由于仪器无报警提示，仪器工程师也未遇见该现象。我们通过对血红蛋白浓度、点样时间、电泳仪电压等不同方面进行调整，最终发现该现象是由于电泳仪的程序出现故障所致。电泳仪处于正常状态时，在电泳结束时会自动烘干凝胶膜，再进行染色；烘干的血红蛋白与染液结合不能很好固定，洗脱时，未固定的血红蛋白易被洗液洗脱而形成空斑。因此电泳后不必烘干，而染色后必须烘干。
图2
出现空斑现象的碱性血红蛋白电泳图
2.2 电泳结束凝胶片脱色不完全，凝胶膜背景呈蓝色
由于电泳仪在进行染色过程中，烘干出现异常，使凝胶膜烘干不彻底，导致脱色不完全，凝胶膜背景呈蓝色（图 3），影响血红蛋白区带扫描的效果。电泳仪面板显示温度正常，检查电泳仪实际烘干温度发现比面板显示温度低，经工程师调整仪器恢复正常。Spife Combo电泳仪有专用温度校准仪，定时对电泳仪的温度进行校准是必要的。
图3
脱色不全的碱性血红蛋白电泳图
3 讨论
血红蛋白电泳分析是地中海贫血和其他异常血红蛋白病诊断的常用方法，临床常用醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、毛细血管电泳、柱层析等方法。琼脂糖凝胶电泳血红蛋白A2区带清晰，血红蛋白F区带分辨力高[2]，是目前推荐的电泳方法。由于血红蛋白的分子生物学检测方法条件要求高，方法繁琐，尚不能广泛应用于各级医院特别是基层医院[1]。因此，快速、实用的血红蛋白电泳在地中海贫血的早期筛查中起到非常重要的作用，血红蛋白电泳时的质量控制显得尤其重要。
我室从2007年开始使用美国Helena公司的Spife Combo全自动电泳仪发现该仪器检测结果稳定、容易维护保养。但仪器良好的性能需要正确的使用和开展质量控制。我们对血红蛋白电泳的质量控制积累了一定的经验，除平时严格按照仪器说明书的要求，对仪器做好每日、每周、每月维护保养，以减少仪器的故障率外，还强调对操作中的各个环节进行质量控制。建立完整的标准操作程序，对人员进行培训；建立对仪器的定期校准、室内质量控制、室间质量评价制度，使用原装配套试剂，对仪器的电泳系统、染色系统、图像扫描系统等进行严格的性能监控。通过对血红蛋白液的制备、点样的时间等进行标准化操作，能使血红蛋白电泳的结果准确可靠，为临床提供有价值的数据。
