引用本文： 邹品娇, 吴娟, 姜云平, 金伟华, 蒋燕, 于波涛, 范开华. 结核患者胸水中异烟肼浓度的测定. 华西医学, 2014, 29(8): 1483-1486. doi: 10.7507/1002-0179.20140455 复制
结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病。当今结核病在全球及我国发生严重。据世界卫生组织报道，2005年全球近1/3的人已感染结核分枝杆菌，即20亿人口感染了结核分枝杆菌[1]。抗结核药物是结核病化学治疗的基础，是人类控制结核病的主要手段。结核病化学治疗的出现使结核病的控制有了划时代的改变，全球结核病疫情由此得以迅速下降[2]。目前在抗结核治疗中，利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇仍是一线用药，并以其联合使用为基本治疗方案。其中异烟肼是各类结核病的首选治疗药物，用量较小，疗效较好，口服吸收率为90% [3]。适用于肺、淋巴、骨等各种类型的结核病[4]。异烟肼早已成为结核病研究的焦点，其在人体内的最小抑菌浓度为0.02～0.05 μg/mL。提高胸水中的异烟肼浓度，可增强其抗结核作用[5]。由于从血液中进入胸膜腔的药物可能较少[6]，因此需要一种灵敏度高、专属性强的检测方法。2009年2月－6月我们建立了用高效液相色谱仪测定结核患者胸水中异烟肼浓度的方法，计算精密度、样品回收率、测定稳定性，观察结核患者胸水中的异烟肼浓度情况，指导临床应用药。
1 仪器与试药
1.1 仪器
采用美国安捷伦公司Agilent1200高效液相色谱仪（G1322A Degaster，G1311A Quat Pump；G1329A Als；G1316A Tcc；G1314B VWD）；YKH-Ⅱ型液体快速混合器（北京鸿泰顺达科技有限公司）；SYZ-A型石英亚沸高纯水蒸馏器（金坛市科兴仪器厂）；KDC-160HR高速冷冻离心机（郑州宏朗仪器设备有限公司）；Beckman DU-640型紫外分光光度计（美国贝克曼库尔特公司）。
1.2 试药
异烟肼注射液（2 mL：0.1 g，重庆太极集团，国药准字H50021470）；甲醇（分析纯，成都科龙化工试剂厂）；甲醇（色谱纯，郑州安赛生物科技有限公司）；高纯水（自制）；无水磷酸氢二钠（分析纯，四川什邡川鸿化工厂）。
2 试验准备
2.1 配制系列浓度的异烟肼水溶液
用微量进样针分别量取0.5、1.0、2.5、5.0、2.5、5.0 μL 浓度为50 μg/mL的异烟肼注射液，分别放入100、100、100、100、250、250 mL的容量瓶中，用高纯水加至刻度，得浓度分别为0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的异烟肼溶液。
2.2 模拟胸水样品的配制
2.2.1 配制系列浓度的异烟肼溶液
用微量取样针分别量取0.5、1.0、2.5、5.0、2.5、5.0 μL浓度为50 μg/mL 的异烟肼注射液，分别放入50、50、25、10、10、10 mL的容量瓶中，用高纯水水加至刻度，得浓度分别为10、20、50、100、200、400 μg/mL异烟肼溶液。
2.2.2 配制不同浓度异烟肼的模拟胸水样品
用微量取样针分别量取10、20、50、100、200、400 μg/mL的异烟肼溶液10 μL于离心管中，加入400 μL空白胸水，配制得到浓度分别为0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的异烟肼模拟胸水样品。
2.3 确定胸水样品的处理方法
用三氯醋酸沉淀蛋白，效果不理想。确定取400 μL 胸水中加入600 μL甲醇（分析纯）以沉淀蛋白[7]，涡旋混匀3 min后，在10 000 r/min条件下离心10 min，取上清液测定。
2.4 确定检测波长
用上述配制的浓度为5 μg/mL的异烟肼水溶液在Beckman DU-640型紫外分光光度计下进行扫描，找出其具有紫外吸收的波长范围。再根据所查阅的文献确定其检测波长为254 nm [8]。
2.5 确定流动相
配制pH=6的磷酸缓冲液：称取0.7 g无水磷酸氢二钠，加入250 mL蒸馏水，溶解，得浓度为0.02 mol/L 的磷酸氢二钠溶液，加入磷酸，得pH=6的磷酸缓冲液。把此缓冲液过滤，得流动相所用的磷酸缓冲液。
用水︰甲醇（色谱纯）︰磷酸缓冲液（pH=6）=85︰5︰10作为流动相[8]，此条件下异烟肼的保留时间为10.5 min，保留时间过长。
增加甲醇和磷酸缓冲液的比例，使水︰甲醇︰磷酸缓冲液（pH=6）=65︰15︰20，此条件下异烟肼的保留时间为4.7 min。在此条件下测定测定空白胸水的色谱图，空白胸水在4.7 min左右有峰出现，不能与异烟肼分离。适当增加和减少甲醇的比例，都不能使空白胸水中的物质与异烟肼完全分离。所以此流动相不能用于测定胸水中异烟肼的浓度。
用甲醇︰水=20︰80作为流动相[9]，此条件下异烟肼的保留时间为3.7 min，在此条件下测定空白胸水的色谱图，空白胸水中的物质与异烟肼可以基本分离。所以用此流动相作为本试验的流动相。
3 测定方法与结果
3.1 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm× 2.5 mm）；柱温：室温；柱压：200×105 Pa；流动相︰甲醇（色谱纯）︰高纯水=20︰80；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm。在此色谱条件下，异烟肼的保留时间约为3.7 min。
3.2 胸水样品的处理
精密量取胸水样品400 μL，加入600 μL甲醇（分析纯）沉淀蛋白，涡旋混匀3 min后，在10 000 r/min 条件下离心10 min。分取上清液于装样瓶中，在上述色谱条件下进样20 μL分离测定。测得空白胸水、异烟肼溶液和模拟胸水样品的色谱图见图 1～3，在此色谱条件下胸水中的物质基本不影响异烟肼的分离测定。
图1
空白胸水色谱图 图 2异烟肼溶液色谱图 图 3模拟胸水样品色谱图
3.3 标准曲线的制备
3.3.1 异烟肼水溶液的标准曲线
按上述不同浓度异烟肼水溶液的配置方法配制浓度分别为0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的异烟肼水溶液[10]。在上述色谱条件下进样20 μL测定。以异烟肼浓度与峰面积进行线性回归，得异烟肼的水溶液的回归方程为：Y=33.38X−0.812 5，相关系数r=0.999 9。
3.3.2 不同浓度的异烟肼的模拟胸水样品的标准曲线
按上述胸水样品的配制方法配制浓度分别为0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的异烟肼溶液的模拟胸水样品，按上述胸水样品处理方法处理后，在上述色谱条件下进样20 μL测定。以异烟肼浓度与峰面积进行线性回归，得异烟肼的模拟胸水样品的回归方程为：Y=12.758X+7.501 6，相关系数r=0.998 9。
3.4 精密度试验
3.4.1 日内精密度
按上述模拟胸水样品的配制方法配制浓度分别为0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水样品，每个浓度做5份。用上述胸水样品处理方法处理，在上述色谱条件下进样20 μL进行测定。测得5个数据计算日内相对标准偏差（RSD）。结果得异烟肼低、中、高3种不同浓度样品的日内RSD分别为3.49%、1.45%、2.03%。见表 1。
表1
日内精密度试验结果
3.4.2 日间精密度
按上述模拟胸水样品的配制方法配制浓度分别为0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水样品。用上述胸水样品处理方法处理后进样20 μL，在上述色谱条件下连续进样5 d，计算日间RSD。结果得异烟肼低、中、高3种不同浓度样品的日间RSD分别为3.85%、5.68%、4.15%。见表 2。
表2
日间精密度试验结果
3.5 回收率试验
3.5.1 随性标准曲线的制备
按上述胸水样品的配制方法配制浓度分别为0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的异烟肼溶液模拟胸水样品，按上述胸水样品处理方法处理后，在上述色谱条件下进样20 μL测定。以药物浓度与峰面积进行线性回归，结果得异烟肼的回归方程为Y=13.004X+10.6，相关系数r=0.999 2。
3.5.2 方法回收率
按上述模拟胸水样品的配制方法配制浓度分别为0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水样品3份。用上述胸水样品处理方法处理后进样20 μL，在上述色谱条件下测定，将所得峰面积代入上述线性方程，计算药物浓度。将计算所得出的浓度比上样品的实际浓度，计算方法回收率。结果得低、中、高3种浓度的异烟肼模拟胸水样品的回收率结果。见表 3。
表3
方法回收率
3.6 稳定性试验
按上述模拟胸水样品的配制方法配制浓度分别为0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水样品2份。其中1份按上述胸水样品处理方法处理后，在上述色谱条件下进样20 μL 测定峰面积。另外1份在−40℃条件下冷冻，15 d后取出解冻，解冻后按上述胸水样品处理方法处理，在上述色谱条件下进样20 μL测定。测得峰面积比第一份所测得的峰面积有较少的减小。所以异烟肼较稳定。
3.7 样品的测定
取患者用药后的胸水400 μL，加入600 μL甲醇以沉淀蛋白。涡旋混匀3 min后，在10 000 r/min条件下离心10 min。分取上清液于装样瓶中，在上述色谱条件下进样20 μL以分离测定。测得患者胸水中的异烟肼浓度为4.03、7.17 μg/mL。
4 讨论
结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染病，是我国重点控制的疾病之一[11]。结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，结核分枝杆菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏[12]。异烟肼作为一线抗结核药物，应用非常广泛，但异烟肼的肝毒性较大，并有外周神经炎的不良反应，在抗结核治疗过程中，其浓度与抗结核治疗效果及药物不良反应密切相关[13]。异烟肼是一种具有杀菌作用的合成抗菌药，主要停留在椎骨，不广泛渗透到血液及其他器官，除了肾脏[14]。在病理情况下，异烟肼在体内存在较明显的组织分布差异[15]。异烟肼主要对生长繁殖期的分枝杆菌有效，是全效杀菌药。其最低抑菌浓度为0.02～0.05 μg/mL。本药可分布于全身组织和体液中，包括胸、腹水、皮肤、肌肉和乳汁中。本药的蛋白结合率＜10%，分布容积为0.6～0.75 L/kg ，主要在肝脏通过乙酰化代谢。此法测得患者胸水中的异烟肼浓度为4.03、7.17 μg/mL。
目前，测定异烟肼体液浓度有许多方法[16, 17]，但大都存在提取率低，操作繁琐的问题[18]，而本法建立的对结核患者胸水中异烟肼浓度的测定准确、灵敏、重现性好；流动相为甲醇（色谱纯）、高纯水，此流动相简单、易得，对色谱柱的损伤较小。本法用甲醇沉淀蛋白，涡旋混匀，离心后取上清液处理胸水样品，方法简便、有效。异烟肼在此色谱条件下的保留时间为3.7 min。而空白胸水在此时间内无峰出现，虽然在异烟肼出峰后，空白胸水仍有峰出现，与异烟肼的峰有很少一部分重合，但不影响积分，不影响异烟肼的分离测定。
结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病。当今结核病在全球及我国发生严重。据世界卫生组织报道，2005年全球近1/3的人已感染结核分枝杆菌，即20亿人口感染了结核分枝杆菌[1]。抗结核药物是结核病化学治疗的基础，是人类控制结核病的主要手段。结核病化学治疗的出现使结核病的控制有了划时代的改变，全球结核病疫情由此得以迅速下降[2]。目前在抗结核治疗中，利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇仍是一线用药，并以其联合使用为基本治疗方案。其中异烟肼是各类结核病的首选治疗药物，用量较小，疗效较好，口服吸收率为90% [3]。适用于肺、淋巴、骨等各种类型的结核病[4]。异烟肼早已成为结核病研究的焦点，其在人体内的最小抑菌浓度为0.02～0.05 μg/mL。提高胸水中的异烟肼浓度，可增强其抗结核作用[5]。由于从血液中进入胸膜腔的药物可能较少[6]，因此需要一种灵敏度高、专属性强的检测方法。2009年2月－6月我们建立了用高效液相色谱仪测定结核患者胸水中异烟肼浓度的方法，计算精密度、样品回收率、测定稳定性，观察结核患者胸水中的异烟肼浓度情况，指导临床应用药。
1 仪器与试药
1.1 仪器
采用美国安捷伦公司Agilent1200高效液相色谱仪（G1322A Degaster，G1311A Quat Pump；G1329A Als；G1316A Tcc；G1314B VWD）；YKH-Ⅱ型液体快速混合器（北京鸿泰顺达科技有限公司）；SYZ-A型石英亚沸高纯水蒸馏器（金坛市科兴仪器厂）；KDC-160HR高速冷冻离心机（郑州宏朗仪器设备有限公司）；Beckman DU-640型紫外分光光度计（美国贝克曼库尔特公司）。
1.2 试药
异烟肼注射液（2 mL：0.1 g，重庆太极集团，国药准字H50021470）；甲醇（分析纯，成都科龙化工试剂厂）；甲醇（色谱纯，郑州安赛生物科技有限公司）；高纯水（自制）；无水磷酸氢二钠（分析纯，四川什邡川鸿化工厂）。
2 试验准备
2.1 配制系列浓度的异烟肼水溶液
用微量进样针分别量取0.5、1.0、2.5、5.0、2.5、5.0 μL 浓度为50 μg/mL的异烟肼注射液，分别放入100、100、100、100、250、250 mL的容量瓶中，用高纯水加至刻度，得浓度分别为0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的异烟肼溶液。
2.2 模拟胸水样品的配制
2.2.1 配制系列浓度的异烟肼溶液
用微量取样针分别量取0.5、1.0、2.5、5.0、2.5、5.0 μL浓度为50 μg/mL 的异烟肼注射液，分别放入50、50、25、10、10、10 mL的容量瓶中，用高纯水水加至刻度，得浓度分别为10、20、50、100、200、400 μg/mL异烟肼溶液。
2.2.2 配制不同浓度异烟肼的模拟胸水样品
用微量取样针分别量取10、20、50、100、200、400 μg/mL的异烟肼溶液10 μL于离心管中，加入400 μL空白胸水，配制得到浓度分别为0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的异烟肼模拟胸水样品。
2.3 确定胸水样品的处理方法
用三氯醋酸沉淀蛋白，效果不理想。确定取400 μL 胸水中加入600 μL甲醇（分析纯）以沉淀蛋白[7]，涡旋混匀3 min后，在10 000 r/min条件下离心10 min，取上清液测定。
2.4 确定检测波长
用上述配制的浓度为5 μg/mL的异烟肼水溶液在Beckman DU-640型紫外分光光度计下进行扫描，找出其具有紫外吸收的波长范围。再根据所查阅的文献确定其检测波长为254 nm [8]。
2.5 确定流动相
配制pH=6的磷酸缓冲液：称取0.7 g无水磷酸氢二钠，加入250 mL蒸馏水，溶解，得浓度为0.02 mol/L 的磷酸氢二钠溶液，加入磷酸，得pH=6的磷酸缓冲液。把此缓冲液过滤，得流动相所用的磷酸缓冲液。
用水︰甲醇（色谱纯）︰磷酸缓冲液（pH=6）=85︰5︰10作为流动相[8]，此条件下异烟肼的保留时间为10.5 min，保留时间过长。
增加甲醇和磷酸缓冲液的比例，使水︰甲醇︰磷酸缓冲液（pH=6）=65︰15︰20，此条件下异烟肼的保留时间为4.7 min。在此条件下测定测定空白胸水的色谱图，空白胸水在4.7 min左右有峰出现，不能与异烟肼分离。适当增加和减少甲醇的比例，都不能使空白胸水中的物质与异烟肼完全分离。所以此流动相不能用于测定胸水中异烟肼的浓度。
用甲醇︰水=20︰80作为流动相[9]，此条件下异烟肼的保留时间为3.7 min，在此条件下测定空白胸水的色谱图，空白胸水中的物质与异烟肼可以基本分离。所以用此流动相作为本试验的流动相。
3 测定方法与结果
3.1 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm× 2.5 mm）；柱温：室温；柱压：200×105 Pa；流动相︰甲醇（色谱纯）︰高纯水=20︰80；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm。在此色谱条件下，异烟肼的保留时间约为3.7 min。
3.2 胸水样品的处理
精密量取胸水样品400 μL，加入600 μL甲醇（分析纯）沉淀蛋白，涡旋混匀3 min后，在10 000 r/min 条件下离心10 min。分取上清液于装样瓶中，在上述色谱条件下进样20 μL分离测定。测得空白胸水、异烟肼溶液和模拟胸水样品的色谱图见图 1～3，在此色谱条件下胸水中的物质基本不影响异烟肼的分离测定。
图1
空白胸水色谱图 图 2异烟肼溶液色谱图 图 3模拟胸水样品色谱图
3.3 标准曲线的制备
3.3.1 异烟肼水溶液的标准曲线
按上述不同浓度异烟肼水溶液的配置方法配制浓度分别为0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的异烟肼水溶液[10]。在上述色谱条件下进样20 μL测定。以异烟肼浓度与峰面积进行线性回归，得异烟肼的水溶液的回归方程为：Y=33.38X−0.812 5，相关系数r=0.999 9。
3.3.2 不同浓度的异烟肼的模拟胸水样品的标准曲线
按上述胸水样品的配制方法配制浓度分别为0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的异烟肼溶液的模拟胸水样品，按上述胸水样品处理方法处理后，在上述色谱条件下进样20 μL测定。以异烟肼浓度与峰面积进行线性回归，得异烟肼的模拟胸水样品的回归方程为：Y=12.758X+7.501 6，相关系数r=0.998 9。
3.4 精密度试验
3.4.1 日内精密度
按上述模拟胸水样品的配制方法配制浓度分别为0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水样品，每个浓度做5份。用上述胸水样品处理方法处理，在上述色谱条件下进样20 μL进行测定。测得5个数据计算日内相对标准偏差（RSD）。结果得异烟肼低、中、高3种不同浓度样品的日内RSD分别为3.49%、1.45%、2.03%。见表 1。
表1
日内精密度试验结果
3.4.2 日间精密度
按上述模拟胸水样品的配制方法配制浓度分别为0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水样品。用上述胸水样品处理方法处理后进样20 μL，在上述色谱条件下连续进样5 d，计算日间RSD。结果得异烟肼低、中、高3种不同浓度样品的日间RSD分别为3.85%、5.68%、4.15%。见表 2。
表2
日间精密度试验结果
3.5 回收率试验
3.5.1 随性标准曲线的制备
按上述胸水样品的配制方法配制浓度分别为0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的异烟肼溶液模拟胸水样品，按上述胸水样品处理方法处理后，在上述色谱条件下进样20 μL测定。以药物浓度与峰面积进行线性回归，结果得异烟肼的回归方程为Y=13.004X+10.6，相关系数r=0.999 2。
3.5.2 方法回收率
按上述模拟胸水样品的配制方法配制浓度分别为0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水样品3份。用上述胸水样品处理方法处理后进样20 μL，在上述色谱条件下测定，将所得峰面积代入上述线性方程，计算药物浓度。将计算所得出的浓度比上样品的实际浓度，计算方法回收率。结果得低、中、高3种浓度的异烟肼模拟胸水样品的回收率结果。见表 3。
表3
方法回收率
3.6 稳定性试验
按上述模拟胸水样品的配制方法配制浓度分别为0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水样品2份。其中1份按上述胸水样品处理方法处理后，在上述色谱条件下进样20 μL 测定峰面积。另外1份在−40℃条件下冷冻，15 d后取出解冻，解冻后按上述胸水样品处理方法处理，在上述色谱条件下进样20 μL测定。测得峰面积比第一份所测得的峰面积有较少的减小。所以异烟肼较稳定。
3.7 样品的测定
取患者用药后的胸水400 μL，加入600 μL甲醇以沉淀蛋白。涡旋混匀3 min后，在10 000 r/min条件下离心10 min。分取上清液于装样瓶中，在上述色谱条件下进样20 μL以分离测定。测得患者胸水中的异烟肼浓度为4.03、7.17 μg/mL。
4 讨论
结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染病，是我国重点控制的疾病之一[11]。结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，结核分枝杆菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏[12]。异烟肼作为一线抗结核药物，应用非常广泛，但异烟肼的肝毒性较大，并有外周神经炎的不良反应，在抗结核治疗过程中，其浓度与抗结核治疗效果及药物不良反应密切相关[13]。异烟肼是一种具有杀菌作用的合成抗菌药，主要停留在椎骨，不广泛渗透到血液及其他器官，除了肾脏[14]。在病理情况下，异烟肼在体内存在较明显的组织分布差异[15]。异烟肼主要对生长繁殖期的分枝杆菌有效，是全效杀菌药。其最低抑菌浓度为0.02～0.05 μg/mL。本药可分布于全身组织和体液中，包括胸、腹水、皮肤、肌肉和乳汁中。本药的蛋白结合率＜10%，分布容积为0.6～0.75 L/kg ，主要在肝脏通过乙酰化代谢。此法测得患者胸水中的异烟肼浓度为4.03、7.17 μg/mL。
目前，测定异烟肼体液浓度有许多方法[16, 17]，但大都存在提取率低，操作繁琐的问题[18]，而本法建立的对结核患者胸水中异烟肼浓度的测定准确、灵敏、重现性好；流动相为甲醇（色谱纯）、高纯水，此流动相简单、易得，对色谱柱的损伤较小。本法用甲醇沉淀蛋白，涡旋混匀，离心后取上清液处理胸水样品，方法简便、有效。异烟肼在此色谱条件下的保留时间为3.7 min。而空白胸水在此时间内无峰出现，虽然在异烟肼出峰后，空白胸水仍有峰出现，与异烟肼的峰有很少一部分重合，但不影响积分，不影响异烟肼的分离测定。
