引用本文： 涂禾, 梁栗, 侯世祥, 冯光富. 高效液相色谱法测定疲王按摩乳中阿魏酸的含量. 华西医学, 2014, 29(9): 1697-1700. doi: 10.7507/1002-0179.20140517 复制
疲王按摩乳具有舒筋活络、行气活血、散寒止痛的功效，主要由伸筋草、舒筋草、川芎、红花、大血藤、花椒、羌活、独活等12味中药组成，用于国家优秀运动员连续大运动量训练后引起的运动性肌肉疲劳症。症见受累的肌肉、筋腱酸痛发困、发紧、发硬，压痛之泛，多在肌腹肌腱、腱腹交接处以及肌间隔区，活动时筋肉酸痛乏力，或肌肉收缩紊乱症[1]。查阅相关文献资料后，伸筋草、舒筋草、川芎、羌活4味药材均含阿魏酸，且用量较大，其功效可部分反映整个成方制剂的功效，因此对该制剂中总阿魏酸进行含量测定具有现实意义。实验研究证实，高效液相色谱法可用于测定疲王按摩乳中的阿魏酸含量。
1 材料与方法
1.1 仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国惠普公司生产，包括G1311A四元梯度泵，VWD检测器，G1316A柱温箱，Agilent 1100化学色谱工作站）；AL204电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SB3200超声清洗机（上海必能信超声有限公司）。
1.2 试药
阿魏酸对照品（批号110737-201012）、川芎对照品（批号120918-200809）、羌活对照品（批号120935-200506）、伸筋草对照品（批号1109-200001）均由中国药品生物制品检定所提供，舒筋草经鉴定药材均符合《四川省中药材标准》2010年版的有关规定[2]。冰醋酸和甲醇均为色谱纯[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]、水为超纯水（自制），其他试剂均为分析纯。
疲王按摩乳样品批号为：110821、110911、110912、110913。均由四川省骨科医院制剂室提供。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，北京迪马科技有限公司）；流动相：甲醇-2%冰醋酸（32︰68）；体积流量：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：320 nm。
1.3.2 溶液制备
阿魏酸对照品溶液：取阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含10 μg阿魏酸对照品的溶液，即得。
供试品溶液：精密称取供试品5 g，加入70%甲醇30 mL，加热回流30 min，冰水浴20 min，使其基质析出，滤过，用70%甲醇6 mL洗涤滤器及圆底烧瓶等，洗涤2次，合并滤液，用70%甲醇稀释并定容于50 mL棕色容量瓶中，取少量供试品溶液于离心管中，离心（离心半径3 cm，转速10 000 r/min，离心时间10 min）后，取上清液用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得。
川芎对照品溶液：将药材粉碎，过60目筛，取本品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，称定质量，超声处理20 min （功率160 W，频率50 kHz），精密称定，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，再用微孔滤膜（0.45 μm） 滤过，即得。
羌活对照品溶液、伸筋草对照品溶液及舒筋草对照品溶液制备方法同“川芎对照品溶液”。
阴性对照品溶液：除川芎、羌活、伸筋草和舒筋草外，其他中药饮片按供试品处方量投料，按疲王按摩乳工艺制成阴性对照品，然后再按“供试品溶液”项下方法，制成阴性对照品溶液。
1.3.3 专属性试验
分别取阿魏酸对照品溶液、阴性对照品溶液、4种药材对照品溶液（川芎、羌活、伸筋草和舒筋草）及供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照1.3.1项“色谱条件”，在同一条件下测定。
1.3.4 线性关系考查
分别精密吸取阿魏酸对照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL于10 mL棕色容量瓶中，用5%甲酸稀释并定容，摇匀，即得4.55、9.10、27.30、45.50、72.80、91.00 μg/mL的标准供试液。精密取各供试液10 μL，进样，按上述色谱条件测定，重复操作2次，以峰面积（A）对浓度（C）进行线性回归。
1.3.5 精密度试验
精密吸取阿魏酸对照品溶液（45.5 μg/mL）10 μL，按上述色谱条件测得阿魏酸峰面积，连续进样6次，测定阿魏酸的峰面积值。
精密吸取供试品溶液（批号110911）10 µL，按上述色谱条件测得阿魏酸峰面积，连续重复进样6次，测定阿魏酸的峰面积。
1.3.6 供试品溶液的稳定性考察
取同一供试品溶液（批号：110911），分别在在1、4、12、24、48、72 h，取10 μL供试品溶液进样，按上述色谱条件测得阿魏酸峰面积，考察供试品溶液的稳定性。
1.3.7 重复性考察
取同一批号供试品（批号：110911） 6份，分别按1.3.2项中“供试品溶液制备方法”项下平行制备6个供试品溶液，在上述色谱条件下分别按上述含量测定方法进样测定，并计算含量。
1.3.8 加样回收试验
精密称取一定量的已测知含量（88.49 μg/g）的样品（批号：1100821）9份，分别精密加入阿魏酸对照品适量（3种不同梯度，各3份），分别按1.3.2项中“供试品溶液制备方法”项下平行制备9个供试品的溶液，按上述色谱条件下分别进样含量测定，计算回收率。
1.3.9 样品的含量测定
取3批中试样品（110911、110912、110913）按上述含量测定方法，每一个批号取样品3个，分别按1.3.2项中“供试品溶液制备方法”项下制备供试品的溶液。按上述色谱条件下分别分别精密吸取供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定阿魏酸的含量，计算出阿魏酸含量的平均值。
2 结果
2.1 专属性试验
阴性对照品在阿魏酸岀峰区间未出现相应色谱峰，表明该测定方法具有较好的专属性，测定无干扰。见图 1。
图1
高效液相色谱图 1a. 阿魏酸对照品 1b. 阴性对照品 1c. 川芎药材对照 1d. 羌活药材对照 1e. 伸筋草药材对照 1f. 舒筋草药材对照 1g. 供试品溶液 图 2 阿魏酸对照品标准曲线
2.2 线性关系考察
经过线性回归计算得阿魏酸标准曲线方程为：y=44.431x-2.158 7，R2=0.999 8，结果表明，在上述色谱条件下，阿魏酸在4.55～91.00 μg/mL范围内呈良好的线性关系。见图 2。
2.3 精密度试验
阿魏酸对照品溶液（n=6）和供试品溶液（n=6）阿魏酸的峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.566%和1.732%。
2.4 供试品溶液的稳定性考察
阿魏酸峰面积的RSD值（n=6）为1.419%。表明供试品溶液含量在72 h内稳定。
2.5 重复性考察
供试品阿魏酸含量平均值（n=6）为85.37 μg/g，RSD值为2.21%，上述结果表明测定方法有较好的重复性。
2.6 回收率试验
阿魏酸加样回收率试验结果见表 1，其平均回收率为98.78%，RSD值为2.668%。该含量测定法加样回收良好，可用于该制剂阿魏酸含量的测定。
表1
阿魏酸加样回收率试验结果
2.7 样品的含量测定
3批中试样品（110911、110912、110913）阿魏酸含量的平均值分别为85.97、86.23、87.20 μg/g。
3 讨论
阿魏酸具有抗氧化、抗血栓、抗血糖、抗血脂的作用，可预防动脉粥样硬化，还具有抗菌消炎的功效，能够在一定程度上抑制癌细胞的发生，对预防肿瘤等疾病有很好的疗效。关于阿魏酸的含量测定，有薄层扫描法、薄层分光光度法、高效液相色谱法等多种方法，其中高效液相色谱法因方法简便、快速、准确，灵敏度高，重现性好，文献报道大多数是采用该法对阿魏酸进行含量测定[3-16]。我们参考大量的文献资料在进行高效液相色谱法测定阿魏酸的含量时，流动性的选择是重要参数，绝大多数采用酸系统进行[3-16]。在对流动相的条件选择方面，我们分别比较了甲醇-醋酸、甲醇-磷酸、乙腈-醋酸、乙腈-磷酸、甲醇-乙腈-醋酸等系统，阿魏酸在甲醇-磷酸、乙腈-醋酸系统中分离效果均不理想，从实验发现在甲醇-醋酸系统中分离效果较佳，参照中国药典2010版川芎项下含量测定的有关内容[17]，以甲醇-1%冰醋酸（30︰70）作为流动相，结果在此条件下，阿魏酸色谱峰峰形还不理想，与其他组分不能达到基线分离；于是又分别考察了甲醇-0.1%冰醋酸、甲醇-0.5%冰醋酸、甲醇-1%冰醋酸、甲醇-2%冰醋酸系统，最终根据阿魏酸的保留时间、峰形、分离度等色谱条件的综合分析，找到了缺川芎、羌活、伸筋草和舒筋草的阴性对照溶液在阿魏酸的位置上无干扰的流动相条件，最终确定甲醇-2%冰醋酸系统为本研究的流动相系统。
取阿魏酸对照品的甲醇溶液，在190～400 nm波长范围内进行扫描，结果其在320 nm处有最大吸收，故选320 nm为测定波长[18]。
由于组方的复杂性和剂型的特点，我们对影响样品提取的条件进行了考察。根据阿魏酸的理化性质，提取方法着重考察超声处理与加热回流两法，研究表明加热回流法优于超声处理；在溶剂的考察上，分别精密加入70%甲醇加入不同体积稀乙醇（25、30、35 mL），回流提取30 min，用30、35 mL稀乙醇提取的阿魏酸含量基本相同，与25 mL稀乙醇提取有区别，故确定溶剂用量为30 mL；考察了不同浓度的稀乙醇（50%、60%、70%）对本实验回收率、杂质量等因素的影响进行筛选，以70%的乙醇好，故用70%乙醇作为提取溶剂。研究结果表明，将溶解阿魏酸的溶剂进行适当的调整，能够有效的改善阿魏酸的降解情况，使得测定条件稳定，数据可靠。
由于阿魏酸对光、热的稳定性较差，在实验时尽量做到避光且温度适当，因此在样品的存放中采取了避光、冷藏措施[19]。
综上所述，本实验建立的高效液相色谱法，疲王按摩乳中阿魏酸与其他峰达到基线分离，方法简便快速，准确度高，重复性好，可以作为疲王按摩乳的质量控制方法。
疲王按摩乳具有舒筋活络、行气活血、散寒止痛的功效，主要由伸筋草、舒筋草、川芎、红花、大血藤、花椒、羌活、独活等12味中药组成，用于国家优秀运动员连续大运动量训练后引起的运动性肌肉疲劳症。症见受累的肌肉、筋腱酸痛发困、发紧、发硬，压痛之泛，多在肌腹肌腱、腱腹交接处以及肌间隔区，活动时筋肉酸痛乏力，或肌肉收缩紊乱症[1]。查阅相关文献资料后，伸筋草、舒筋草、川芎、羌活4味药材均含阿魏酸，且用量较大，其功效可部分反映整个成方制剂的功效，因此对该制剂中总阿魏酸进行含量测定具有现实意义。实验研究证实，高效液相色谱法可用于测定疲王按摩乳中的阿魏酸含量。
1 材料与方法
1.1 仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国惠普公司生产，包括G1311A四元梯度泵，VWD检测器，G1316A柱温箱，Agilent 1100化学色谱工作站）；AL204电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SB3200超声清洗机（上海必能信超声有限公司）。
1.2 试药
阿魏酸对照品（批号110737-201012）、川芎对照品（批号120918-200809）、羌活对照品（批号120935-200506）、伸筋草对照品（批号1109-200001）均由中国药品生物制品检定所提供，舒筋草经鉴定药材均符合《四川省中药材标准》2010年版的有关规定[2]。冰醋酸和甲醇均为色谱纯[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]、水为超纯水（自制），其他试剂均为分析纯。
疲王按摩乳样品批号为：110821、110911、110912、110913。均由四川省骨科医院制剂室提供。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，北京迪马科技有限公司）；流动相：甲醇-2%冰醋酸（32︰68）；体积流量：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：320 nm。
1.3.2 溶液制备
阿魏酸对照品溶液：取阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含10 μg阿魏酸对照品的溶液，即得。
供试品溶液：精密称取供试品5 g，加入70%甲醇30 mL，加热回流30 min，冰水浴20 min，使其基质析出，滤过，用70%甲醇6 mL洗涤滤器及圆底烧瓶等，洗涤2次，合并滤液，用70%甲醇稀释并定容于50 mL棕色容量瓶中，取少量供试品溶液于离心管中，离心（离心半径3 cm，转速10 000 r/min，离心时间10 min）后，取上清液用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得。
川芎对照品溶液：将药材粉碎，过60目筛，取本品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，称定质量，超声处理20 min （功率160 W，频率50 kHz），精密称定，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，再用微孔滤膜（0.45 μm） 滤过，即得。
羌活对照品溶液、伸筋草对照品溶液及舒筋草对照品溶液制备方法同“川芎对照品溶液”。
阴性对照品溶液：除川芎、羌活、伸筋草和舒筋草外，其他中药饮片按供试品处方量投料，按疲王按摩乳工艺制成阴性对照品，然后再按“供试品溶液”项下方法，制成阴性对照品溶液。
1.3.3 专属性试验
分别取阿魏酸对照品溶液、阴性对照品溶液、4种药材对照品溶液（川芎、羌活、伸筋草和舒筋草）及供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照1.3.1项“色谱条件”，在同一条件下测定。
1.3.4 线性关系考查
分别精密吸取阿魏酸对照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL于10 mL棕色容量瓶中，用5%甲酸稀释并定容，摇匀，即得4.55、9.10、27.30、45.50、72.80、91.00 μg/mL的标准供试液。精密取各供试液10 μL，进样，按上述色谱条件测定，重复操作2次，以峰面积（A）对浓度（C）进行线性回归。
1.3.5 精密度试验
精密吸取阿魏酸对照品溶液（45.5 μg/mL）10 μL，按上述色谱条件测得阿魏酸峰面积，连续进样6次，测定阿魏酸的峰面积值。
精密吸取供试品溶液（批号110911）10 µL，按上述色谱条件测得阿魏酸峰面积，连续重复进样6次，测定阿魏酸的峰面积。
1.3.6 供试品溶液的稳定性考察
取同一供试品溶液（批号：110911），分别在在1、4、12、24、48、72 h，取10 μL供试品溶液进样，按上述色谱条件测得阿魏酸峰面积，考察供试品溶液的稳定性。
1.3.7 重复性考察
取同一批号供试品（批号：110911） 6份，分别按1.3.2项中“供试品溶液制备方法”项下平行制备6个供试品溶液，在上述色谱条件下分别按上述含量测定方法进样测定，并计算含量。
1.3.8 加样回收试验
精密称取一定量的已测知含量（88.49 μg/g）的样品（批号：1100821）9份，分别精密加入阿魏酸对照品适量（3种不同梯度，各3份），分别按1.3.2项中“供试品溶液制备方法”项下平行制备9个供试品的溶液，按上述色谱条件下分别进样含量测定，计算回收率。
1.3.9 样品的含量测定
取3批中试样品（110911、110912、110913）按上述含量测定方法，每一个批号取样品3个，分别按1.3.2项中“供试品溶液制备方法”项下制备供试品的溶液。按上述色谱条件下分别分别精密吸取供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定阿魏酸的含量，计算出阿魏酸含量的平均值。
2 结果
2.1 专属性试验
阴性对照品在阿魏酸岀峰区间未出现相应色谱峰，表明该测定方法具有较好的专属性，测定无干扰。见图 1。
图1
高效液相色谱图 1a. 阿魏酸对照品 1b. 阴性对照品 1c. 川芎药材对照 1d. 羌活药材对照 1e. 伸筋草药材对照 1f. 舒筋草药材对照 1g. 供试品溶液 图 2 阿魏酸对照品标准曲线
2.2 线性关系考察
经过线性回归计算得阿魏酸标准曲线方程为：y=44.431x-2.158 7，R2=0.999 8，结果表明，在上述色谱条件下，阿魏酸在4.55～91.00 μg/mL范围内呈良好的线性关系。见图 2。
2.3 精密度试验
阿魏酸对照品溶液（n=6）和供试品溶液（n=6）阿魏酸的峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.566%和1.732%。
2.4 供试品溶液的稳定性考察
阿魏酸峰面积的RSD值（n=6）为1.419%。表明供试品溶液含量在72 h内稳定。
2.5 重复性考察
供试品阿魏酸含量平均值（n=6）为85.37 μg/g，RSD值为2.21%，上述结果表明测定方法有较好的重复性。
2.6 回收率试验
阿魏酸加样回收率试验结果见表 1，其平均回收率为98.78%，RSD值为2.668%。该含量测定法加样回收良好，可用于该制剂阿魏酸含量的测定。
表1
阿魏酸加样回收率试验结果
2.7 样品的含量测定
3批中试样品（110911、110912、110913）阿魏酸含量的平均值分别为85.97、86.23、87.20 μg/g。
3 讨论
阿魏酸具有抗氧化、抗血栓、抗血糖、抗血脂的作用，可预防动脉粥样硬化，还具有抗菌消炎的功效，能够在一定程度上抑制癌细胞的发生，对预防肿瘤等疾病有很好的疗效。关于阿魏酸的含量测定，有薄层扫描法、薄层分光光度法、高效液相色谱法等多种方法，其中高效液相色谱法因方法简便、快速、准确，灵敏度高，重现性好，文献报道大多数是采用该法对阿魏酸进行含量测定[3-16]。我们参考大量的文献资料在进行高效液相色谱法测定阿魏酸的含量时，流动性的选择是重要参数，绝大多数采用酸系统进行[3-16]。在对流动相的条件选择方面，我们分别比较了甲醇-醋酸、甲醇-磷酸、乙腈-醋酸、乙腈-磷酸、甲醇-乙腈-醋酸等系统，阿魏酸在甲醇-磷酸、乙腈-醋酸系统中分离效果均不理想，从实验发现在甲醇-醋酸系统中分离效果较佳，参照中国药典2010版川芎项下含量测定的有关内容[17]，以甲醇-1%冰醋酸（30︰70）作为流动相，结果在此条件下，阿魏酸色谱峰峰形还不理想，与其他组分不能达到基线分离；于是又分别考察了甲醇-0.1%冰醋酸、甲醇-0.5%冰醋酸、甲醇-1%冰醋酸、甲醇-2%冰醋酸系统，最终根据阿魏酸的保留时间、峰形、分离度等色谱条件的综合分析，找到了缺川芎、羌活、伸筋草和舒筋草的阴性对照溶液在阿魏酸的位置上无干扰的流动相条件，最终确定甲醇-2%冰醋酸系统为本研究的流动相系统。
取阿魏酸对照品的甲醇溶液，在190～400 nm波长范围内进行扫描，结果其在320 nm处有最大吸收，故选320 nm为测定波长[18]。
由于组方的复杂性和剂型的特点，我们对影响样品提取的条件进行了考察。根据阿魏酸的理化性质，提取方法着重考察超声处理与加热回流两法，研究表明加热回流法优于超声处理；在溶剂的考察上，分别精密加入70%甲醇加入不同体积稀乙醇（25、30、35 mL），回流提取30 min，用30、35 mL稀乙醇提取的阿魏酸含量基本相同，与25 mL稀乙醇提取有区别，故确定溶剂用量为30 mL；考察了不同浓度的稀乙醇（50%、60%、70%）对本实验回收率、杂质量等因素的影响进行筛选，以70%的乙醇好，故用70%乙醇作为提取溶剂。研究结果表明，将溶解阿魏酸的溶剂进行适当的调整，能够有效的改善阿魏酸的降解情况，使得测定条件稳定，数据可靠。
由于阿魏酸对光、热的稳定性较差，在实验时尽量做到避光且温度适当，因此在样品的存放中采取了避光、冷藏措施[19]。
综上所述，本实验建立的高效液相色谱法，疲王按摩乳中阿魏酸与其他峰达到基线分离，方法简便快速，准确度高，重复性好，可以作为疲王按摩乳的质量控制方法。
