引用本文： 魏鑫, 周亮, 王坤杰, 李虹. 压力对膀胱平滑肌细胞损伤的研究. 华西医学, 2015, 30(6): 1079-1082. doi: 10.7507/1002-0179.20150310 复制
膀胱平滑肌细胞是组织工程构建膀胱研究中重要的种子细胞。大量研究指出，适宜范围的压力加载能够促进体外培养的膀胱平滑肌细胞增殖[1-4]。但同时，压力导致的细胞损伤也被广泛报道[5-8]。本研究比较了体外压力加载培养与无压力培养细胞的α-actin表达量与细胞碘化丙啶（PI）染色阳性比例，旨在探讨在可促进增殖范围内的压力加载与膀胱平滑肌细胞损伤的关系。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
细胞机械力加载系统[3][可提供固定或变化的机械压力及37 ℃、5%二氧化碳（CO2）及饱和湿度培养条件]；人类膀胱平滑肌细胞（美国标准生物品收藏中心）；胎牛血清（美国GIBCO公司），Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）和胰蛋白酶，兔抗人α-actin单抗购自英国ABCAM公司，免疫荧光染色试剂盒抗人异硫氰酸荧光素（FITC）、4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）购自上海碧云天生物技术公司；碘化丙啶（PI）购自美国Sigma公司，配成1 mg/mL，4℃保存；4%多聚甲醛。倒置免疫荧光显微镜型号为Olympus 1X71（日本奥林巴斯公司）。
1.2 实验分组及处理
原代人膀胱平滑肌细胞生长至汇合状态时，到80%～90%融合时就可以传代。传代时，吸引管吸去原有的培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2遍，吸尽。用0.25%胰蛋白酶浸润细胞（约1 mL）30 s，把培养瓶放置在相差显微镜下进行观察，当细胞开始回缩、稍变圆、间隙增大时，迅速加入3～5 mL的DMEM培养液（含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL）终止消化，用吸管吹打制成细胞悬液，将细胞悬液装于离心管，以1 200 r/min的转速离心5 min，洗涤去除胰蛋白酶消化液，用培养基重新悬浮细胞。用计数板测细胞数量，以5×106/mL的细胞浓度接种，大约每5天左右传代1次，然后把第3～7代细胞做实验检测。
实验组：膀胱平滑肌细胞按每片接种1×105个细胞，制备18个细胞爬片，置于6孔板内，于37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养培养24 h，然后进入机械压力加载系统，于37℃、5% CO2、饱和湿度以及40 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）压力下培养24 h后检测。
对照组：膀胱平滑肌细胞按每片接种1×105个细胞制备细胞爬片，制备18个细胞爬片，全程置于6孔板内，于37℃、5% CO2及饱和湿度的无压力培养箱中培养24 h。
两组均有8个样本既有PI染色又有α-actin染色，10个样本单独α-actin染色用于观察形态和收缩蛋白表达。
1.3 细胞损伤指标检测
1.3.1 PI染色
PI染色剂不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色，因此常用于细胞凋亡检测。两组各8个样本，将实验组与对照组细胞用PBS清洗2遍，分别加入PI染色剂，避光条件下温水浴10 min，加用4%多聚甲醛固定10 min。PBS清洗多聚甲醛，然后夹取盖玻片放在载玻片上，荧光显微镜观察摄像。PI荧光为红色（620 nm）。Image J软件计数PI染色阳性细胞数，用于量化对照组与实验组细胞的凋亡细胞的比例。
1.3.2 α-actin染色
该指标用于量化机械力对细胞收缩蛋白及骨架的影响。两组各10个样本，甲醛固定膀胱平滑肌细胞20 min，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚作用5 min，PBS清洗3次，羊血清室温封闭后加兔抗人α-actin单抗（1︰100）37℃，1 h，PBS清洗3次后加FITC标记的二抗（1︰150）37℃作用1 h，用Image J软件对细胞荧光面积作定量分析，测量荧光面积所占百分比。
1.3.3 DAPI染色
DAPI染色剂可以透过完整的细胞膜，因此常用于鉴定活细胞。用PBS漂洗对照组与实验组经上述染色操作后的细胞，每个爬片分别滴加适量DAPI工作液，室温下染色5 min后用PBS漂洗。水溶性封片剂封片后置于荧光显微镜观察。DAPI荧光为蓝色（340 nm）。
1.4 统计学方法
用SPSS 17.0软件对各组资料进行分析。细胞实验检测数据均以均数±标准差表示，组间比较行 t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 α-actin的表达
实验组与对照组比较，α-actin荧光检测均呈阳性反应，细胞质内α-actin呈梭形排列，细胞核染色呈阳性反应（图 1），Image J检测结果显示α-actin免疫荧光面积测量实验组为（50.93±1.99）%，对照组为（24.70±1.61）%，实验组明显高于对照组，差异有统计学意义（t=32.404，P＜0.001）。
图1
两组细胞免疫荧光图片（PI×100）
绿色荧光示膀胱平滑肌细胞α-actin，红色荧光示被损伤细胞（PI阳性），蓝色荧光示细胞核（DAPI阳性） a. 实验组 b. 对照组
2.2 细胞损伤指标检测
PI染色阳性细胞数量实验组为（9.00±1.41）%，对照组为（3.50±2.12）%，实验组明显高于对照组，差异有统计学意义（t=6.110，P＜0.001）。
3 讨论
在生理状态下，膀胱处于复杂的动态机械力环境中[9]。在膀胱储尿和排尿时，膀胱平滑肌细胞受到周期性机械力刺激，其中包括静水压力、牵张力和流体剪切力等多种机械力。研究表明，体外培养环境越接近体内，获得的组织或器官的结构和功能越接近原有的组织或器官[10]。体外培养环境包括温度、酸碱度、生物化学信号、电生理以及生物力学、机械力学性能等方面，然而力学刺激是最基本和重要的方面之一[11-12]。力学环境对细胞的形态功能、基因表达、信号传递、生长、增殖、凋亡等至关重要[13]。力学刺激对于人体组织器官在正常发育不可或缺，否则会直接影响细胞之间的信号传递，细胞生长缓慢，增殖活力下降，细胞的形态功能逐渐退化，致使组织器官慢慢萎缩，功能减退。种子细胞作为组织工程中重要部分，其生理活性与所构建的组织器官的形态及功能关系密切。因此，体外培养的种子细胞应尽可能满足体内的力学培养环境需要，特别是骨科的肌腱和心血管的管壁研究较多[14-16]。而膀胱种子细胞的体外压力加载培养研究较少。
有研究发现，合适的机械力环境能够促进膀胱发育和生长[1]；另一方面，大量的病理生理学证据显示异常的机械力是损害膀胱的重要因素，例如，脊髓损伤或膀胱出口梗阻时膀胱压力改变，导致疾病恶化，膀胱从细胞水平进而到大体水平都发生改变，最终出现低顺应性膀胱[5, 17]。细胞水平的变化包括细胞增殖旺盛、细胞外基质分泌增加等，这些变化都涉及到细胞表型的改变[18]。机械力对膀胱平滑肌细胞的促进与损伤作用间是否同时存在于机械力加载早期尚无研究报道。
本研究选取了大多数研究认可的可促进膀胱平滑肌细胞增殖的压力加载范围进行研究[19]，探讨在这一体外培养条件下，可促进细胞增殖的压力范围是否同时存在着损伤细胞的情况，结果初步揭示了机械力对细胞同时存在着促进和损伤的作用。
α-actin染色可显示膀胱平滑肌细胞形态，目前认为平滑肌α-actin是“收缩型”平滑肌细胞表型的主要标志，其表达显著下调表明平滑肌细胞发生表型转化[20-21]。actin在平滑肌细胞中是其细胞收缩的主要成分，含量在所有收缩相关蛋白中居于首位，其稳定的表达量和在细胞质内规则而有序的排列是平滑肌细胞行使收缩功能的必要条件。α-actin作为细胞骨架的成分，还与其他骨架蛋白共同参与细胞在外界张力刺激下的被动形变过程，即与微丝协同产生抗拉作用，这种力学特性对维持细胞外形稳定具有重要的生物学意义[22-23]。在本研究选定的压力条件下，实验组与对照组细胞的α-actin表达差异有统计学意义（P＜0.001），表明生理状态下的压力刺激对膀胱平滑肌细胞的收缩能力确实具有促进作用。
荧光染料PI是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂。PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色，试验可借此发现被损伤的平滑肌细胞。本研究经PI染色后，实验组阳性细胞数量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001），表明了在实验设定的压力培养条件下膀胱平滑肌细胞损伤的存在。
综上所述，对膀胱平滑肌细胞而言，压力同时具有促进作用和细胞损伤作用，在压力加载培养体系中，即使是经过大量研究并被一致认为是相对安全的、可促进细胞增殖的压力加载条件，其在促进细胞收缩蛋白表达的同时也会对膀胱平滑肌细胞造成损伤。
膀胱平滑肌细胞是组织工程构建膀胱研究中重要的种子细胞。大量研究指出，适宜范围的压力加载能够促进体外培养的膀胱平滑肌细胞增殖[1-4]。但同时，压力导致的细胞损伤也被广泛报道[5-8]。本研究比较了体外压力加载培养与无压力培养细胞的α-actin表达量与细胞碘化丙啶（PI）染色阳性比例，旨在探讨在可促进增殖范围内的压力加载与膀胱平滑肌细胞损伤的关系。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
细胞机械力加载系统[3][可提供固定或变化的机械压力及37 ℃、5%二氧化碳（CO2）及饱和湿度培养条件]；人类膀胱平滑肌细胞（美国标准生物品收藏中心）；胎牛血清（美国GIBCO公司），Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）和胰蛋白酶，兔抗人α-actin单抗购自英国ABCAM公司，免疫荧光染色试剂盒抗人异硫氰酸荧光素（FITC）、4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）购自上海碧云天生物技术公司；碘化丙啶（PI）购自美国Sigma公司，配成1 mg/mL，4℃保存；4%多聚甲醛。倒置免疫荧光显微镜型号为Olympus 1X71（日本奥林巴斯公司）。
1.2 实验分组及处理
原代人膀胱平滑肌细胞生长至汇合状态时，到80%～90%融合时就可以传代。传代时，吸引管吸去原有的培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2遍，吸尽。用0.25%胰蛋白酶浸润细胞（约1 mL）30 s，把培养瓶放置在相差显微镜下进行观察，当细胞开始回缩、稍变圆、间隙增大时，迅速加入3～5 mL的DMEM培养液（含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL）终止消化，用吸管吹打制成细胞悬液，将细胞悬液装于离心管，以1 200 r/min的转速离心5 min，洗涤去除胰蛋白酶消化液，用培养基重新悬浮细胞。用计数板测细胞数量，以5×106/mL的细胞浓度接种，大约每5天左右传代1次，然后把第3～7代细胞做实验检测。
实验组：膀胱平滑肌细胞按每片接种1×105个细胞，制备18个细胞爬片，置于6孔板内，于37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养培养24 h，然后进入机械压力加载系统，于37℃、5% CO2、饱和湿度以及40 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）压力下培养24 h后检测。
对照组：膀胱平滑肌细胞按每片接种1×105个细胞制备细胞爬片，制备18个细胞爬片，全程置于6孔板内，于37℃、5% CO2及饱和湿度的无压力培养箱中培养24 h。
两组均有8个样本既有PI染色又有α-actin染色，10个样本单独α-actin染色用于观察形态和收缩蛋白表达。
1.3 细胞损伤指标检测
1.3.1 PI染色
PI染色剂不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色，因此常用于细胞凋亡检测。两组各8个样本，将实验组与对照组细胞用PBS清洗2遍，分别加入PI染色剂，避光条件下温水浴10 min，加用4%多聚甲醛固定10 min。PBS清洗多聚甲醛，然后夹取盖玻片放在载玻片上，荧光显微镜观察摄像。PI荧光为红色（620 nm）。Image J软件计数PI染色阳性细胞数，用于量化对照组与实验组细胞的凋亡细胞的比例。
1.3.2 α-actin染色
该指标用于量化机械力对细胞收缩蛋白及骨架的影响。两组各10个样本，甲醛固定膀胱平滑肌细胞20 min，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚作用5 min，PBS清洗3次，羊血清室温封闭后加兔抗人α-actin单抗（1︰100）37℃，1 h，PBS清洗3次后加FITC标记的二抗（1︰150）37℃作用1 h，用Image J软件对细胞荧光面积作定量分析，测量荧光面积所占百分比。
1.3.3 DAPI染色
DAPI染色剂可以透过完整的细胞膜，因此常用于鉴定活细胞。用PBS漂洗对照组与实验组经上述染色操作后的细胞，每个爬片分别滴加适量DAPI工作液，室温下染色5 min后用PBS漂洗。水溶性封片剂封片后置于荧光显微镜观察。DAPI荧光为蓝色（340 nm）。
1.4 统计学方法
用SPSS 17.0软件对各组资料进行分析。细胞实验检测数据均以均数±标准差表示，组间比较行 t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 α-actin的表达
实验组与对照组比较，α-actin荧光检测均呈阳性反应，细胞质内α-actin呈梭形排列，细胞核染色呈阳性反应（图 1），Image J检测结果显示α-actin免疫荧光面积测量实验组为（50.93±1.99）%，对照组为（24.70±1.61）%，实验组明显高于对照组，差异有统计学意义（t=32.404，P＜0.001）。
图1
两组细胞免疫荧光图片（PI×100）
绿色荧光示膀胱平滑肌细胞α-actin，红色荧光示被损伤细胞（PI阳性），蓝色荧光示细胞核（DAPI阳性） a. 实验组 b. 对照组
2.2 细胞损伤指标检测
PI染色阳性细胞数量实验组为（9.00±1.41）%，对照组为（3.50±2.12）%，实验组明显高于对照组，差异有统计学意义（t=6.110，P＜0.001）。
3 讨论
在生理状态下，膀胱处于复杂的动态机械力环境中[9]。在膀胱储尿和排尿时，膀胱平滑肌细胞受到周期性机械力刺激，其中包括静水压力、牵张力和流体剪切力等多种机械力。研究表明，体外培养环境越接近体内，获得的组织或器官的结构和功能越接近原有的组织或器官[10]。体外培养环境包括温度、酸碱度、生物化学信号、电生理以及生物力学、机械力学性能等方面，然而力学刺激是最基本和重要的方面之一[11-12]。力学环境对细胞的形态功能、基因表达、信号传递、生长、增殖、凋亡等至关重要[13]。力学刺激对于人体组织器官在正常发育不可或缺，否则会直接影响细胞之间的信号传递，细胞生长缓慢，增殖活力下降，细胞的形态功能逐渐退化，致使组织器官慢慢萎缩，功能减退。种子细胞作为组织工程中重要部分，其生理活性与所构建的组织器官的形态及功能关系密切。因此，体外培养的种子细胞应尽可能满足体内的力学培养环境需要，特别是骨科的肌腱和心血管的管壁研究较多[14-16]。而膀胱种子细胞的体外压力加载培养研究较少。
有研究发现，合适的机械力环境能够促进膀胱发育和生长[1]；另一方面，大量的病理生理学证据显示异常的机械力是损害膀胱的重要因素，例如，脊髓损伤或膀胱出口梗阻时膀胱压力改变，导致疾病恶化，膀胱从细胞水平进而到大体水平都发生改变，最终出现低顺应性膀胱[5, 17]。细胞水平的变化包括细胞增殖旺盛、细胞外基质分泌增加等，这些变化都涉及到细胞表型的改变[18]。机械力对膀胱平滑肌细胞的促进与损伤作用间是否同时存在于机械力加载早期尚无研究报道。
本研究选取了大多数研究认可的可促进膀胱平滑肌细胞增殖的压力加载范围进行研究[19]，探讨在这一体外培养条件下，可促进细胞增殖的压力范围是否同时存在着损伤细胞的情况，结果初步揭示了机械力对细胞同时存在着促进和损伤的作用。
α-actin染色可显示膀胱平滑肌细胞形态，目前认为平滑肌α-actin是“收缩型”平滑肌细胞表型的主要标志，其表达显著下调表明平滑肌细胞发生表型转化[20-21]。actin在平滑肌细胞中是其细胞收缩的主要成分，含量在所有收缩相关蛋白中居于首位，其稳定的表达量和在细胞质内规则而有序的排列是平滑肌细胞行使收缩功能的必要条件。α-actin作为细胞骨架的成分，还与其他骨架蛋白共同参与细胞在外界张力刺激下的被动形变过程，即与微丝协同产生抗拉作用，这种力学特性对维持细胞外形稳定具有重要的生物学意义[22-23]。在本研究选定的压力条件下，实验组与对照组细胞的α-actin表达差异有统计学意义（P＜0.001），表明生理状态下的压力刺激对膀胱平滑肌细胞的收缩能力确实具有促进作用。
荧光染料PI是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂。PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色，试验可借此发现被损伤的平滑肌细胞。本研究经PI染色后，实验组阳性细胞数量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001），表明了在实验设定的压力培养条件下膀胱平滑肌细胞损伤的存在。
综上所述，对膀胱平滑肌细胞而言，压力同时具有促进作用和细胞损伤作用，在压力加载培养体系中，即使是经过大量研究并被一致认为是相对安全的、可促进细胞增殖的压力加载条件，其在促进细胞收缩蛋白表达的同时也会对膀胱平滑肌细胞造成损伤。
