引用本文： 王露, 王文志, 徐建, 夏进, 梁宗安. 淫羊藿苷对NCI-H446细胞增殖和凋亡的影响. 华西医学, 2015, 30(8): 1401-1405. doi: 10.7507/1002-0179.20150404 复制
上世纪60年代以来，化学疗法（化疗）药物治疗肺癌获得了巨大成功，推动了国内外肿瘤治疗研究的进展，但化疗药物易引起严重副作用，如急性肝、肾损伤等，若不及时诊治可危及生命[1]。因此，寻找新的高效低毒分化诱导剂与分化疗法，已成为肿瘤基础与临床研究的重点之一。淫羊藿为历代常用的补益中药，淫羊藿苷是其主要活性成分之一[2]，其具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用[3]，而肺癌的发生被认为是细胞凋亡与细胞增殖平衡失调的结果[4]。本研究以小细胞肺癌细胞株NCI-H446为靶细胞，探讨淫羊藿苷对其的作用及作用机制。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
淫羊藿苷（南京替斯艾么中药研究所，批号20121109）。Roswell Park纪念研究所（RPMI）1640培养基（美国Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；12孔培养板（美国Falcon公司）；β-actin抗体[艾比玛特生物医药（上海）有限公司]；Janus激酶2（JAK2）、信号转导子与转录激活子3（STAT3）、磷酸化JAK2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）（美国Cell Signal Technology公司）；Bcl-2、Bax（美国Abclonal公司）；TRIzol reagent（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（美国GeneCopoeia公司）；SYBRgreen（日本Takara公司）；实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）引物（北京擎科生物技术有限公司）；放射免疫沉淀实验（RIPA）蛋白裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；蛋白酶抑制剂cocktail及蛋白质印迹法凝胶制备试剂盒（武汉谷歌生物公司）。
1.2 仪器
二氧化碳细胞培养箱（美国Forma scientific公司）；倒置显微镜、激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）；RT-qPCR仪（美国拜力公司），酶标仪、紫外分光光度计测量浓度（美国Thermo Fisher公司）；硝酸纤维素膜（瑞士Roche公司），电致化学发光（ECL）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），胶片及化学发光仪（美国柯达公司）。
1.3 细胞培养
NCI-H446细胞置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，加入青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 U/mL），在37 ℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱中培养。
1.4 噻唑蓝（MTT）检测NCI-H446细胞增殖
取对数生长期NCI-H446细胞，接种于12孔板内，调整密度为2×105/mL，90 μL/孔，实验组加入淫羊藿苷（8 μmol/L），对照组细胞不加药物，另设空白组（只加培养基，不加细胞和药物），每组均设3个复孔。12孔板置于37℃、5%二氧化碳培养箱培养48 h后，加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL/孔，继续培养4 h，然后加入三联裂解液[10%十二烷基硫酸钠+5%异丁醇+1%三羟甲基氨基甲烷-盐酸（10 mol/L），100 μL/孔]，37℃放置过夜后，用酶标仪于波长570 nm处读取吸光度[A（旧称光密度（OD）]值，细胞增殖抑制率=[对照孔A值-实验孔A值]/[对照孔A值-空白孔A值]×100%。
1.5 Annexin-V双染法检测细胞凋亡
取对数生长期的NCI-H446细胞接种于6孔板中，调整密度为1×105/mL。实验分为2组：对照组细胞常规培养；淫羊藿苷组细胞培养体系中加入淫羊藿苷多糖，终质量浓度为0.4 g/L。培养48 h后，收集各组所有悬浮细胞，调整细胞密度为1×105/mL，取1 mL细胞悬液，离心力3 000×g，离心5 min，去培养基，加RNA酶，37℃水浴1 h，放入冰浴加入0.5 mg/L 碘化丙啶及Annexin-V，流式细胞仪检测。采用CELIQUEST软件分析细胞凋亡率。
1.6 蛋白质印迹法检测NCI-H446细胞JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3，BCL-2和Bax表达
将各组收集的细胞用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，按照蛋白裂解液RIPA操作说明提取蛋白，BCA法进行蛋白定量，将各组蛋白浓度调成一致，沸水煮5 min，待用。取各组细胞总蛋白样品80 μg，以样品中的β-actin为内参，经双相十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，然后用含5%脱脂奶粉的PBS封闭2 h，分别加入适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释JAK2抗体（1︰1 000）、p-JAK2（1︰500）、STAT3（1︰1 000）、p-STAT3（1︰500）、BCL-2（1︰500）、Bax（1︰500）、β-actin（1︰3 000）抗体，4 ℃孵育过夜。PBS洗膜3次，10 min/次，根据一抗的来源，再分别加入适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（1︰500）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（1︰5 000）室温下作用2 h，PBS洗膜3次，10 min/次，ECL化学发光显色、压片、显影、定影、胶片扫描保存。利用Ge-l Pro Analyzer（Ver.3.0）软件测定JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和β-actin蛋白条带灰度值，以JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白灰度值与β-actin内参条带灰度值的比值代表上述蛋白的表达量化。
1.7 RT-qPCR检测JAK2和STAT3
按照总RNA提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测量浓度，逆转录以及扩增反应按试剂盒说明书进行，RT-qPCR引物均由美国Invitrogen公司合成（表 1）。管家基因β-actin作为内参对照基因，用得到的各样本的Ct值按公式2-ΔΔCT计算相对表达量。
表1
RT-qPCR检测的引物序列
1.8 统计学方法
采用SPSS 12.0统计软件包进行资料分析。实验结果采用均数±标准差表示，淫羊藿苷组与对照组均数比较采用t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 淫羊藿苷明显抑制对NCI-H446细胞增殖
MTT检测实验结果显示，淫羊藿苷组与对照组增殖率分别为（94±5）%、（41±3）%，淫羊藿苷组与对照组相比增殖率明显降低（t=15.712，P＜0.001）。见表 2。
表2
各组NCI-H446细胞增殖的影响（n=3，2.2 淫羊藿苷促进NCI-H446细胞凋亡
流式细胞术检测实验结果显示，淫羊藿苷组与对照组细胞凋亡率分别为（8±3）%、（75±7）%，给予淫羊藿苷的实验组细胞凋亡率明显增高，差异有统计学意义（t=-15.238，P＜0.001）。见图 1。
图1
流式细胞术检测淫羊藿苷对NCI-H446 细胞凋亡的影响
a. 对照组 b. 淫羊藿苷组
2.3 淫羊藿苷对NCI-H446细胞JAK2、STAT3 mRNA表达的影响
RT-qPCR检测结果显示，对照组细胞JAK2、STAT3 mRNA的表达水平与淫羊藿苷处理组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表 3。
表3
各组NCI-H446细胞JAK2、STAT3 mRNA表达的影响（n=3，2.4 淫羊藿苷对NCI-H446细胞p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表达的影响
蛋白质印迹法检测显示，与对照组相比，经淫羊藿苷作用NCI-H446细胞48 h后，JAK2、STAT3蛋白无明显变化（P＞0.05），p-JAK2、p-STAT3明显增加（P＜0.05），见图 2、表 4。
图2
蛋白质印迹法检测对照组与淫羊藿苷组NCI-H446细胞p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表达的电泳图
表4
各组NCI-H446细胞p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表达（n=3，2.5 淫羊藿苷对NCI-H446细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响
蛋白质印迹法检测显示，与对照组相比，经淫羊藿苷作用NCI-H446细胞16 h后，Bcl-2明显减少（P＜0.05），Bax表达明显增加（P＜0.05）。见图 3、表 5。
图3
蛋白质印迹法检测对照组与淫羊藿苷组NCI-H446细胞BCL-2和Bax蛋白表达的电泳图
表5
各组NCI-H446细胞BCL-2和Bax蛋白表达的影响（n=3，3 讨论
肺癌又称支气管肺癌，发病率和死亡率均高。研究发现肺癌不仅是增殖、分化异常的疾病，同时也是凋亡受阻的疾病，细胞凋亡的减少可引起肺癌的发生，且通过逃避凋亡而促进细胞的恶性转化[4]。JAK2/STAT3是在多种细胞发挥介导作用的信号通路，信号通路涉及细胞生长、细胞凋亡（促凋亡）、细胞周期进程、分化、转录、翻译和糖代谢[5]。目前研究发现JAK2/STAT3信号通路可以调节肿瘤细胞增[6]、分化、凋亡，尤其与肺癌密切相关[6-8]。目前对肺癌治疗大多仍采用传统的大剂量联合化学疗法和手术切除，但此疗法不良反应大，尤其对肝脏和肾脏损害很大，且复发率高[1]。
从祖国医学宝库中挖掘抑制肺癌细胞恶性增殖的方法是研发高效低毒的抗肺癌药物的有效途径之一[2]。淫羊藿是一种常见中药，因其具有免疫调节、延缓衰老、减轻骨质疏松以及记忆保护作用，因而被广泛应用于临床。目前研究发现淫羊藿苷具有促进细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用[3]，在肝癌、乳腺癌、前列腺癌研究中，淫羊藿苷可抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡，以及削弱癌细胞的迁徙，因而具有明显的抗癌活性[9-15]。但淫羊藿苷对肺癌的作用及其机制尚不清楚。国外研究发现淫羊藿苷可调节JAK2/STAT3信号通路的活性[3, 16-17]，而JAK2/STAT3信号通路在肺癌的恶性增殖和凋亡受阻扮演重要角色。
本试验中我们通过MTT检测发现淫羊藿苷可以明显抑制NCI-H446细胞增殖，通过流式细胞术发现淫羊藿苷明显增加NCI-H446细胞凋亡率，蛋白质印迹法检测发现淫羊藿苷对JAK2和STAT3表达无明显改变，而促进JAK2和STAT3的磷酸化修饰增加，抗凋亡蛋白BCL-2表达明显减少，促凋亡蛋白Bax表达增加。因此我们推测淫羊藿苷可能通过结构修饰激活JAK2/STAT3信号通路，而非增加JAK2和STAT3的表达量下调NCI-H446增殖，促进NCI-H446凋亡，从而达到治疗肺癌的目的。
综上所述，淫羊藿苷可能是通过激活JAK2/STAT3信号通路来抑制NCI-H446细胞增殖和促进细胞凋亡。然而淫羊藿苷是否直接作用于JAK2信号分子还是通过调节其上游激酶和（或）信号分子而间接发挥作用仍不清楚，尚需进行更深入的研究。
上世纪60年代以来，化学疗法（化疗）药物治疗肺癌获得了巨大成功，推动了国内外肿瘤治疗研究的进展，但化疗药物易引起严重副作用，如急性肝、肾损伤等，若不及时诊治可危及生命[1]。因此，寻找新的高效低毒分化诱导剂与分化疗法，已成为肿瘤基础与临床研究的重点之一。淫羊藿为历代常用的补益中药，淫羊藿苷是其主要活性成分之一[2]，其具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用[3]，而肺癌的发生被认为是细胞凋亡与细胞增殖平衡失调的结果[4]。本研究以小细胞肺癌细胞株NCI-H446为靶细胞，探讨淫羊藿苷对其的作用及作用机制。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
淫羊藿苷（南京替斯艾么中药研究所，批号20121109）。Roswell Park纪念研究所（RPMI）1640培养基（美国Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；12孔培养板（美国Falcon公司）；β-actin抗体[艾比玛特生物医药（上海）有限公司]；Janus激酶2（JAK2）、信号转导子与转录激活子3（STAT3）、磷酸化JAK2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）（美国Cell Signal Technology公司）；Bcl-2、Bax（美国Abclonal公司）；TRIzol reagent（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（美国GeneCopoeia公司）；SYBRgreen（日本Takara公司）；实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）引物（北京擎科生物技术有限公司）；放射免疫沉淀实验（RIPA）蛋白裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；蛋白酶抑制剂cocktail及蛋白质印迹法凝胶制备试剂盒（武汉谷歌生物公司）。
1.2 仪器
二氧化碳细胞培养箱（美国Forma scientific公司）；倒置显微镜、激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）；RT-qPCR仪（美国拜力公司），酶标仪、紫外分光光度计测量浓度（美国Thermo Fisher公司）；硝酸纤维素膜（瑞士Roche公司），电致化学发光（ECL）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），胶片及化学发光仪（美国柯达公司）。
1.3 细胞培养
NCI-H446细胞置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，加入青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 U/mL），在37 ℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱中培养。
1.4 噻唑蓝（MTT）检测NCI-H446细胞增殖
取对数生长期NCI-H446细胞，接种于12孔板内，调整密度为2×105/mL，90 μL/孔，实验组加入淫羊藿苷（8 μmol/L），对照组细胞不加药物，另设空白组（只加培养基，不加细胞和药物），每组均设3个复孔。12孔板置于37℃、5%二氧化碳培养箱培养48 h后，加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL/孔，继续培养4 h，然后加入三联裂解液[10%十二烷基硫酸钠+5%异丁醇+1%三羟甲基氨基甲烷-盐酸（10 mol/L），100 μL/孔]，37℃放置过夜后，用酶标仪于波长570 nm处读取吸光度[A（旧称光密度（OD）]值，细胞增殖抑制率=[对照孔A值-实验孔A值]/[对照孔A值-空白孔A值]×100%。
1.5 Annexin-V双染法检测细胞凋亡
取对数生长期的NCI-H446细胞接种于6孔板中，调整密度为1×105/mL。实验分为2组：对照组细胞常规培养；淫羊藿苷组细胞培养体系中加入淫羊藿苷多糖，终质量浓度为0.4 g/L。培养48 h后，收集各组所有悬浮细胞，调整细胞密度为1×105/mL，取1 mL细胞悬液，离心力3 000×g，离心5 min，去培养基，加RNA酶，37℃水浴1 h，放入冰浴加入0.5 mg/L 碘化丙啶及Annexin-V，流式细胞仪检测。采用CELIQUEST软件分析细胞凋亡率。
1.6 蛋白质印迹法检测NCI-H446细胞JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3，BCL-2和Bax表达
将各组收集的细胞用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，按照蛋白裂解液RIPA操作说明提取蛋白，BCA法进行蛋白定量，将各组蛋白浓度调成一致，沸水煮5 min，待用。取各组细胞总蛋白样品80 μg，以样品中的β-actin为内参，经双相十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，然后用含5%脱脂奶粉的PBS封闭2 h，分别加入适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释JAK2抗体（1︰1 000）、p-JAK2（1︰500）、STAT3（1︰1 000）、p-STAT3（1︰500）、BCL-2（1︰500）、Bax（1︰500）、β-actin（1︰3 000）抗体，4 ℃孵育过夜。PBS洗膜3次，10 min/次，根据一抗的来源，再分别加入适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（1︰500）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（1︰5 000）室温下作用2 h，PBS洗膜3次，10 min/次，ECL化学发光显色、压片、显影、定影、胶片扫描保存。利用Ge-l Pro Analyzer（Ver.3.0）软件测定JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和β-actin蛋白条带灰度值，以JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白灰度值与β-actin内参条带灰度值的比值代表上述蛋白的表达量化。
1.7 RT-qPCR检测JAK2和STAT3
按照总RNA提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测量浓度，逆转录以及扩增反应按试剂盒说明书进行，RT-qPCR引物均由美国Invitrogen公司合成（表 1）。管家基因β-actin作为内参对照基因，用得到的各样本的Ct值按公式2-ΔΔCT计算相对表达量。
表1
RT-qPCR检测的引物序列
1.8 统计学方法
采用SPSS 12.0统计软件包进行资料分析。实验结果采用均数±标准差表示，淫羊藿苷组与对照组均数比较采用t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 淫羊藿苷明显抑制对NCI-H446细胞增殖
MTT检测实验结果显示，淫羊藿苷组与对照组增殖率分别为（94±5）%、（41±3）%，淫羊藿苷组与对照组相比增殖率明显降低（t=15.712，P＜0.001）。见表 2。
表2
各组NCI-H446细胞增殖的影响（n=3，2.2 淫羊藿苷促进NCI-H446细胞凋亡
流式细胞术检测实验结果显示，淫羊藿苷组与对照组细胞凋亡率分别为（8±3）%、（75±7）%，给予淫羊藿苷的实验组细胞凋亡率明显增高，差异有统计学意义（t=-15.238，P＜0.001）。见图 1。
图1
流式细胞术检测淫羊藿苷对NCI-H446 细胞凋亡的影响
a. 对照组 b. 淫羊藿苷组
2.3 淫羊藿苷对NCI-H446细胞JAK2、STAT3 mRNA表达的影响
RT-qPCR检测结果显示，对照组细胞JAK2、STAT3 mRNA的表达水平与淫羊藿苷处理组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表 3。
表3
各组NCI-H446细胞JAK2、STAT3 mRNA表达的影响（n=3，2.4 淫羊藿苷对NCI-H446细胞p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表达的影响
蛋白质印迹法检测显示，与对照组相比，经淫羊藿苷作用NCI-H446细胞48 h后，JAK2、STAT3蛋白无明显变化（P＞0.05），p-JAK2、p-STAT3明显增加（P＜0.05），见图 2、表 4。
图2
蛋白质印迹法检测对照组与淫羊藿苷组NCI-H446细胞p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表达的电泳图
表4
各组NCI-H446细胞p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表达（n=3，2.5 淫羊藿苷对NCI-H446细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响
蛋白质印迹法检测显示，与对照组相比，经淫羊藿苷作用NCI-H446细胞16 h后，Bcl-2明显减少（P＜0.05），Bax表达明显增加（P＜0.05）。见图 3、表 5。
图3
蛋白质印迹法检测对照组与淫羊藿苷组NCI-H446细胞BCL-2和Bax蛋白表达的电泳图
表5
各组NCI-H446细胞BCL-2和Bax蛋白表达的影响（n=3，3 讨论
肺癌又称支气管肺癌，发病率和死亡率均高。研究发现肺癌不仅是增殖、分化异常的疾病，同时也是凋亡受阻的疾病，细胞凋亡的减少可引起肺癌的发生，且通过逃避凋亡而促进细胞的恶性转化[4]。JAK2/STAT3是在多种细胞发挥介导作用的信号通路，信号通路涉及细胞生长、细胞凋亡（促凋亡）、细胞周期进程、分化、转录、翻译和糖代谢[5]。目前研究发现JAK2/STAT3信号通路可以调节肿瘤细胞增[6]、分化、凋亡，尤其与肺癌密切相关[6-8]。目前对肺癌治疗大多仍采用传统的大剂量联合化学疗法和手术切除，但此疗法不良反应大，尤其对肝脏和肾脏损害很大，且复发率高[1]。
从祖国医学宝库中挖掘抑制肺癌细胞恶性增殖的方法是研发高效低毒的抗肺癌药物的有效途径之一[2]。淫羊藿是一种常见中药，因其具有免疫调节、延缓衰老、减轻骨质疏松以及记忆保护作用，因而被广泛应用于临床。目前研究发现淫羊藿苷具有促进细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用[3]，在肝癌、乳腺癌、前列腺癌研究中，淫羊藿苷可抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡，以及削弱癌细胞的迁徙，因而具有明显的抗癌活性[9-15]。但淫羊藿苷对肺癌的作用及其机制尚不清楚。国外研究发现淫羊藿苷可调节JAK2/STAT3信号通路的活性[3, 16-17]，而JAK2/STAT3信号通路在肺癌的恶性增殖和凋亡受阻扮演重要角色。
本试验中我们通过MTT检测发现淫羊藿苷可以明显抑制NCI-H446细胞增殖，通过流式细胞术发现淫羊藿苷明显增加NCI-H446细胞凋亡率，蛋白质印迹法检测发现淫羊藿苷对JAK2和STAT3表达无明显改变，而促进JAK2和STAT3的磷酸化修饰增加，抗凋亡蛋白BCL-2表达明显减少，促凋亡蛋白Bax表达增加。因此我们推测淫羊藿苷可能通过结构修饰激活JAK2/STAT3信号通路，而非增加JAK2和STAT3的表达量下调NCI-H446增殖，促进NCI-H446凋亡，从而达到治疗肺癌的目的。
综上所述，淫羊藿苷可能是通过激活JAK2/STAT3信号通路来抑制NCI-H446细胞增殖和促进细胞凋亡。然而淫羊藿苷是否直接作用于JAK2信号分子还是通过调节其上游激酶和（或）信号分子而间接发挥作用仍不清楚，尚需进行更深入的研究。
