引用本文： 杨昆, 闫静, 黄晓丽. p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎大鼠结肠传输功能的影响. 华西医学, 2015, 30(8): 1505-1507. doi: 10.7507/1002-0179.20150431 复制
溃疡性结肠炎（UC）是一种肠道慢性非特异性炎症性疾病，病变主要累及结肠的黏膜层及黏膜下层，属于炎症性肠病的一种类型[1]。结肠动力障碍是UC的常见并发症之一[2]，但其具体发病机制尚不十分清楚，也缺乏明确有效的治疗方法。因此，对于UC所致肠道动力障碍发病机制的进一步研究并开发新的治疗方法在临床上具有重要意义。
近年来大量研究证实，肠道动力障碍与肠道炎症之间存在密切联系[3-6]。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶大家族的成员之一，在调节炎症反应中起着重要作用[7-8]。活化的p38MAPK通过调节基因表达产生大量的炎性介质，因此阻断p38MAPK信号通路可能有助于治疗肠道炎症，从而改善肠道动力障碍。本研究通过观察p38MAPK抑制剂SB203580对大鼠结肠炎模型的影响，探讨肠道炎症在肠道动力障碍中的作用以及SB203580是否能改善肠道炎症及其所导致的肠道动力障碍，并为SB203580作为UC及肠道动力障碍的治疗药物提供实验依据。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
雄性成年Sprague-Dawley（SD）大鼠34只（购于四川大学实验动物中心），大鼠体质量为200～250 g。
1.1.2 主要试剂及仪器
SB203580（美国Sigma公司），葡聚糖硫酸钠（DSS，德国MP Biomedicals公司），分光光度计（CA）。
1.2 方法
1.2.1 分组及给药
用标准的实验动物大鼠饲料（由四川大学实验动物中心生产）喂养大鼠，让其自由进食。饲养室内的温度为25℃，湿度为30%～60%，每天光照周期为12 h。用随机数字表将34只大鼠分为4个组：正常对照组（正常组，n=8），DSS模型组（DSS组，n=8），DSS+生理盐水组（DSS+NS组，n=9），DSS+SB203580干预组（SB203580组，n=9）。正常组大鼠每日用大鼠饲料和蒸馏水喂养，其余3组的大鼠参照Cooper等[9]的方法构建DSS结肠炎模型：将DSS溶于蒸馏水中配置成5%DSS溶液，让SD大鼠自由饮用7 d。参照Hollenbach等[10]的方法，SB203580组大鼠在饮用5%DSS溶液72 h以后，每天予以SB203580 （1 mg/kg体质量）进行腹腔注射。DSS+NS组大鼠在饮用5%DSS溶液72 h以后，每天予以相同体积的生理盐水进行腹腔注射。7 d后麻醉下处死大鼠。该实验得到四川大学华西医院医学伦理委员会批准。
1.2.2 观察指标
根据Murthy等[11]的方法，通过观察大鼠的体质量、活动情况、大便性状及便血情况，对大鼠进行疾病活动指数（DAI）评分，以评估大鼠结肠炎的疾病活动情况，见表 1。大便形状标准：正常大便：成形大便；松散大便：不黏附于肛门的糊状、半成形便；稀便：可附于肛门的稀水样便。DAI=（体质量下降分数+大便性状分数+便血分数）/3。
表1
DAI评分标准
1.2.3 结肠传输功能的测定
根据Izbeki等[12]的方法，用酚红法测定SD大鼠的结肠传输功能：通过插入大鼠结肠内的导管，将1.5 mL酚红溶液（含不可吸收的酚红0.75 mg）注入大鼠结肠内，再用0.5 mL生理盐水冲洗导管。90 min后，在麻醉下处死大鼠，并将大鼠结肠从肛门到盲肠端剪下，均分成6段并编号。同时将每只大鼠肛门排出的内容物编号为第7段以检测其中可能存在的酚红。将每个肠段（包括肛门排出物）分别加入100 mL 0.1N 氢氧化钠（NaOH），匀浆，在室温下放置1 h后，取混悬液5 mL，加入三氯乙酸（20%W/V）以去蛋白；以3 000 r/min 的速度低温离心20 min；取上清液2 mL，加入2 mL 0.5N NaOH；用分光光度计在560 nm处比色，检测吸光率，计算肠道组织中酚红的含量。SD大鼠的结肠传输功能以酚红分布的几何中心（Geometric center）来表示，其计算公式为：Geometric center=Σ（counts of phenol red per segment × A segment number） [13]。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，本实验所有数据均为计量资料，采用均数±标准差表示，采用单因素方差分析及两两比较（SNK-q或Dunnett-t检验）。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 实验动物的观察和DAI评分
正常组大鼠在精神、饮食、活动及大便性状方面均正常，体质量有不同程度增加。而饮用5%DSS溶液的各组大鼠在第3天就开始出现精神萎靡，活动量减少、厌食，同时大便松散、隐血阳性，体质量也开始下降；第4天开始出现大便性状的进一步改变，主要表现为开始出现腹泻，隐血强阳性，体质量进一步下降；第5天时则出现了水样便及肉眼血便。随着时间延长，结肠炎小鼠的症状逐渐加重。而在SB203580干预组，小鼠的症状明显减轻。各组大鼠的DAI评分发现：DSS组和DSS+NS组的DAI评分分别为（4.54±0.58）和（4.28±0.53）分，比正常组明显升高，SB203580组DAI评分为（1.21±0.42）分，较DSS组和DSS+NS组明显下降（P＜0.05），而DSS组和DSS+NS组之间的DAI评分差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.2 结肠传输功能的测定
用酚红法测定SD大鼠的结肠传输功能，在给予5%DSS溶液喂养后，SD大鼠的结肠传输功能明显延迟（P＜0.05），经SB203580干预后，大鼠结肠传输功能明显改善（P＜0.05），DSS组和DSS+NS组之间大鼠结肠传输功能差异无统计学意义（P＞0.05），见图 1。
图1
各组大鼠结肠传输功能
*与对照组比较，
3 讨论
UC患者常常出现肠道动力障碍，包括平滑肌收缩能力降低、低频振幅收缩增加、传输功能障碍等，其中肠道传输功能障碍研究最多[14-15]。肠道动力障碍的病因复杂，其发病机制尚未阐述清楚。大量研究显示肠道炎症与肠道动力障碍的发生密切相关。有研究发现，在狗的回肠炎模型中，肠道的移行复合运动频率减弱[16]。另一项研究也显示，肠腔内白细胞的募集导致肠道平滑肌功能的抑制，而随着白细胞募集的衰减，肠道的平滑肌功能可以恢复[17]。这些研究都表明，肠道炎症参与了肠道传输功能障碍的发病过程。因此我们推测，有效控制肠道的炎症将能显著改善肠道的传输功能障碍。事实上，我们的研究也发现，当用SB203580阻断p38MAPK信号通路后，DSS诱导的结肠炎大鼠肠道炎症得到改善，其延缓的结肠传输功能得到了显著改善。
MAPK是细胞外信号引起细胞反应的一个共同通路，参与了细胞生长、发育、分裂、死亡等多种生理过程。p38MAPK作为MAPK家族的重要成员之一，几乎参与了机体内所有的生理及病理过程，而它在介导炎症、应激等细胞反应中的作用尤其引人关注。生理情况下，p38MAPK活性很低，主要位于细胞质内。而活化的p38MAPK可进入细胞核，通过磷酸化激活多种转录因子，诱导基因转录，产生大量的促炎因子，如诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β等[18-19]。有研究发现，p38MPAK的活性在UC患者中较正常人明显升高，且与炎症的程度呈正相关[20]。p38MAPK在调控促炎因子产生的机制中起着重要作用，因此如果抑制该信号通路，可能就会抑制促炎性细胞因子的产生，从而缓解炎症所致的肠道动力障碍。用SB203580与炎症性肠病患者的肠黏膜活体检查组织共同孵育后，其TNF-α的含量明显下降，且这种下降与SB203580的浓度呈现出剂量正相关关系[20]。我们的研究也发现，SB203580能降低DSS诱导的结肠炎大鼠的DAI评分，抑制肠道炎症反应，从而改善结肠炎大鼠的肠道动力障碍。众所周知，SB203580是p38MAPK的特异性抑制剂，是一种人工合成的吡啶咪唑类复合物，对于肠道动力并无直接的药理学作用。本研究发现SB203580确实能改善DSS诱导的结肠炎大鼠的肠道动力障碍，这可能与SB203580抑制p38MAPK信号通路，减轻肠道炎症反应有关。SB203580改善肠道传输功能的具体的作用机制需要进行进一步研究。
总之，DSS诱导的结肠炎大鼠的DAI评分明显升高且结肠传输功能明显下降，经SB203580处理后，大鼠的DAI评分下降，结肠传输功能也得到改善。说明p38MAPK信号通路可能参与了UC炎症及肠道动力障碍的发病过程，p38MAPK可能成为治疗UC及其肠道动力障碍的新靶点。
溃疡性结肠炎（UC）是一种肠道慢性非特异性炎症性疾病，病变主要累及结肠的黏膜层及黏膜下层，属于炎症性肠病的一种类型[1]。结肠动力障碍是UC的常见并发症之一[2]，但其具体发病机制尚不十分清楚，也缺乏明确有效的治疗方法。因此，对于UC所致肠道动力障碍发病机制的进一步研究并开发新的治疗方法在临床上具有重要意义。
近年来大量研究证实，肠道动力障碍与肠道炎症之间存在密切联系[3-6]。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶大家族的成员之一，在调节炎症反应中起着重要作用[7-8]。活化的p38MAPK通过调节基因表达产生大量的炎性介质，因此阻断p38MAPK信号通路可能有助于治疗肠道炎症，从而改善肠道动力障碍。本研究通过观察p38MAPK抑制剂SB203580对大鼠结肠炎模型的影响，探讨肠道炎症在肠道动力障碍中的作用以及SB203580是否能改善肠道炎症及其所导致的肠道动力障碍，并为SB203580作为UC及肠道动力障碍的治疗药物提供实验依据。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
雄性成年Sprague-Dawley（SD）大鼠34只（购于四川大学实验动物中心），大鼠体质量为200～250 g。
1.1.2 主要试剂及仪器
SB203580（美国Sigma公司），葡聚糖硫酸钠（DSS，德国MP Biomedicals公司），分光光度计（CA）。
1.2 方法
1.2.1 分组及给药
用标准的实验动物大鼠饲料（由四川大学实验动物中心生产）喂养大鼠，让其自由进食。饲养室内的温度为25℃，湿度为30%～60%，每天光照周期为12 h。用随机数字表将34只大鼠分为4个组：正常对照组（正常组，n=8），DSS模型组（DSS组，n=8），DSS+生理盐水组（DSS+NS组，n=9），DSS+SB203580干预组（SB203580组，n=9）。正常组大鼠每日用大鼠饲料和蒸馏水喂养，其余3组的大鼠参照Cooper等[9]的方法构建DSS结肠炎模型：将DSS溶于蒸馏水中配置成5%DSS溶液，让SD大鼠自由饮用7 d。参照Hollenbach等[10]的方法，SB203580组大鼠在饮用5%DSS溶液72 h以后，每天予以SB203580 （1 mg/kg体质量）进行腹腔注射。DSS+NS组大鼠在饮用5%DSS溶液72 h以后，每天予以相同体积的生理盐水进行腹腔注射。7 d后麻醉下处死大鼠。该实验得到四川大学华西医院医学伦理委员会批准。
1.2.2 观察指标
根据Murthy等[11]的方法，通过观察大鼠的体质量、活动情况、大便性状及便血情况，对大鼠进行疾病活动指数（DAI）评分，以评估大鼠结肠炎的疾病活动情况，见表 1。大便形状标准：正常大便：成形大便；松散大便：不黏附于肛门的糊状、半成形便；稀便：可附于肛门的稀水样便。DAI=（体质量下降分数+大便性状分数+便血分数）/3。
表1
DAI评分标准
1.2.3 结肠传输功能的测定
根据Izbeki等[12]的方法，用酚红法测定SD大鼠的结肠传输功能：通过插入大鼠结肠内的导管，将1.5 mL酚红溶液（含不可吸收的酚红0.75 mg）注入大鼠结肠内，再用0.5 mL生理盐水冲洗导管。90 min后，在麻醉下处死大鼠，并将大鼠结肠从肛门到盲肠端剪下，均分成6段并编号。同时将每只大鼠肛门排出的内容物编号为第7段以检测其中可能存在的酚红。将每个肠段（包括肛门排出物）分别加入100 mL 0.1N 氢氧化钠（NaOH），匀浆，在室温下放置1 h后，取混悬液5 mL，加入三氯乙酸（20%W/V）以去蛋白；以3 000 r/min 的速度低温离心20 min；取上清液2 mL，加入2 mL 0.5N NaOH；用分光光度计在560 nm处比色，检测吸光率，计算肠道组织中酚红的含量。SD大鼠的结肠传输功能以酚红分布的几何中心（Geometric center）来表示，其计算公式为：Geometric center=Σ（counts of phenol red per segment × A segment number） [13]。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，本实验所有数据均为计量资料，采用均数±标准差表示，采用单因素方差分析及两两比较（SNK-q或Dunnett-t检验）。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 实验动物的观察和DAI评分
正常组大鼠在精神、饮食、活动及大便性状方面均正常，体质量有不同程度增加。而饮用5%DSS溶液的各组大鼠在第3天就开始出现精神萎靡，活动量减少、厌食，同时大便松散、隐血阳性，体质量也开始下降；第4天开始出现大便性状的进一步改变，主要表现为开始出现腹泻，隐血强阳性，体质量进一步下降；第5天时则出现了水样便及肉眼血便。随着时间延长，结肠炎小鼠的症状逐渐加重。而在SB203580干预组，小鼠的症状明显减轻。各组大鼠的DAI评分发现：DSS组和DSS+NS组的DAI评分分别为（4.54±0.58）和（4.28±0.53）分，比正常组明显升高，SB203580组DAI评分为（1.21±0.42）分，较DSS组和DSS+NS组明显下降（P＜0.05），而DSS组和DSS+NS组之间的DAI评分差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.2 结肠传输功能的测定
用酚红法测定SD大鼠的结肠传输功能，在给予5%DSS溶液喂养后，SD大鼠的结肠传输功能明显延迟（P＜0.05），经SB203580干预后，大鼠结肠传输功能明显改善（P＜0.05），DSS组和DSS+NS组之间大鼠结肠传输功能差异无统计学意义（P＞0.05），见图 1。
图1
各组大鼠结肠传输功能
*与对照组比较，
3 讨论
UC患者常常出现肠道动力障碍，包括平滑肌收缩能力降低、低频振幅收缩增加、传输功能障碍等，其中肠道传输功能障碍研究最多[14-15]。肠道动力障碍的病因复杂，其发病机制尚未阐述清楚。大量研究显示肠道炎症与肠道动力障碍的发生密切相关。有研究发现，在狗的回肠炎模型中，肠道的移行复合运动频率减弱[16]。另一项研究也显示，肠腔内白细胞的募集导致肠道平滑肌功能的抑制，而随着白细胞募集的衰减，肠道的平滑肌功能可以恢复[17]。这些研究都表明，肠道炎症参与了肠道传输功能障碍的发病过程。因此我们推测，有效控制肠道的炎症将能显著改善肠道的传输功能障碍。事实上，我们的研究也发现，当用SB203580阻断p38MAPK信号通路后，DSS诱导的结肠炎大鼠肠道炎症得到改善，其延缓的结肠传输功能得到了显著改善。
MAPK是细胞外信号引起细胞反应的一个共同通路，参与了细胞生长、发育、分裂、死亡等多种生理过程。p38MAPK作为MAPK家族的重要成员之一，几乎参与了机体内所有的生理及病理过程，而它在介导炎症、应激等细胞反应中的作用尤其引人关注。生理情况下，p38MAPK活性很低，主要位于细胞质内。而活化的p38MAPK可进入细胞核，通过磷酸化激活多种转录因子，诱导基因转录，产生大量的促炎因子，如诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β等[18-19]。有研究发现，p38MPAK的活性在UC患者中较正常人明显升高，且与炎症的程度呈正相关[20]。p38MAPK在调控促炎因子产生的机制中起着重要作用，因此如果抑制该信号通路，可能就会抑制促炎性细胞因子的产生，从而缓解炎症所致的肠道动力障碍。用SB203580与炎症性肠病患者的肠黏膜活体检查组织共同孵育后，其TNF-α的含量明显下降，且这种下降与SB203580的浓度呈现出剂量正相关关系[20]。我们的研究也发现，SB203580能降低DSS诱导的结肠炎大鼠的DAI评分，抑制肠道炎症反应，从而改善结肠炎大鼠的肠道动力障碍。众所周知，SB203580是p38MAPK的特异性抑制剂，是一种人工合成的吡啶咪唑类复合物，对于肠道动力并无直接的药理学作用。本研究发现SB203580确实能改善DSS诱导的结肠炎大鼠的肠道动力障碍，这可能与SB203580抑制p38MAPK信号通路，减轻肠道炎症反应有关。SB203580改善肠道传输功能的具体的作用机制需要进行进一步研究。
总之，DSS诱导的结肠炎大鼠的DAI评分明显升高且结肠传输功能明显下降，经SB203580处理后，大鼠的DAI评分下降，结肠传输功能也得到改善。说明p38MAPK信号通路可能参与了UC炎症及肠道动力障碍的发病过程，p38MAPK可能成为治疗UC及其肠道动力障碍的新靶点。
