细菌生物膜对慢性伤口的影响和其治疗近年来成为伤口护理领域的一大研究热点，伤口生物膜的存在可能是造成慢性伤口难以愈合的重要原因，其具有复杂的内部结构和多种沟通交流机制，对理化刺激、免疫反应和抗菌药物都具有很强的抗性，难以被彻底清除；伤口生物膜的治疗应该是一整套管理方案，包括基本的伤口管理措施、定期清创和抗菌药物的使用，以清除生物膜和防止其再生。慢性伤口细菌生物膜的存在值得重视，而现有文献证据尚不能充分说明其作用机制以及何种治疗方案有效，值得进一步进行研究。
引用本文： 邓欣, 何凌霄, 陈佳丽, 宁宁. 伤口细菌生物膜研究进展. 华西医学, 2015, 30(10): 1838-1841. doi: 10.7507/1002-0179.20150529 复制
随着人口老龄化和疾病谱的变化，慢性伤口日渐成为一个严重的医疗负担。在发达国家，1%～2%的人口在一生中将会发生伤口迁延不愈[1]；仅在英国，每年因慢性伤口而产生的治疗花费就高达10亿英镑[2]。慢性伤口的病因复杂，其临床表现和病程也因患者个体特点的不同而呈现较大的差异，其发病机制和治疗方式至今仍未完全阐明。近年来，细菌生物膜在伤口慢性化中起到的作用逐渐受到重视[3]，Mustoe等[4]认为伤口的细菌负荷是导致慢性伤口不愈合的机制之一。急性伤口中的细菌一般以游离形式存在并进行繁殖[5]，但对慢性伤口而言，伤口上的细菌常常聚集形成生物膜，附着于伤口床但未深入伤口组织内增殖，既缺少明显的临床感染征象[6]，也难以使用局部灭菌剂对其进行杀灭，可能是伤口难以愈合的重要原因。本文从细菌生物膜的定义、特点和处理方式等方面作一简要介绍，以期为临床伤口管理提供参考。
1 生物膜概述
1.1 生物膜定义
在自然环境中，细菌倾向于以生物膜的形式存在[7]。所谓生物膜，是指一种或多种微生物的聚合体，它们被包埋在主要由多糖构成的基质内，不可逆（难以用温和的冲洗去除）地附着于活体组织、医疗器械或者工业管道等的表面[8]。在生物膜中的微生物与游离状态的微生物的基因表达情况有很大区别，这使得它们具有更强的对于物理因素、化学因素、免疫机制、抗生素等有害因素的耐受性，难以清除或杀灭[3]，是细菌为了促进群体生存而形成的复杂的微生态群落。
1.2 生物膜的形成和结构
生物膜在伤口表面的形成大致可分为5个步骤[9]：① 细菌初步附着于表面，这一过程中的附着主要由黏附因子如鞭毛、菌毛、黏附素等介导，并不牢固，通常可逆[10]；② 细菌在增殖过程中分泌主要由多糖、脂类、蛋白、核酸和酶类构成的细胞外多聚物（EPS），使得菌体之间、菌体与伤口表面的黏附变得更加牢固，形成微菌落；③ 微菌落达到一定大小后群体感应（QS）系统激活，释放信号分子，启动特定基因的表达，使得细菌的毒性、运动性、生物膜形成能力等方面发生改变，开始大量分泌EPS，促进生物膜的形成；④ 多个微菌落通过EPS聚集为一个整体，生物膜的结构和功能趋于成熟；⑤ 生物膜的表层释放出浮游细菌、微生物群落和生物膜碎片，迁移到其他部位并黏附，形成新的生物膜。
成熟的生物膜并非单纯的扁平膜样结构，而是一个三维空间的立体结构[8]。对生物膜的直接观测表明，生物膜由多个柱状或蕈状的微菌落连接构成，微菌落中的菌体被EPS包裹[11]，之间形成充满液体的通道以输送氧气、营养、代谢产物、酶等[8, 12]，此外，生物膜中尚存在大量水分、蛋白、死亡和裂解菌体，乃至宿主的一些成分碎片等。
2 慢性伤口中的生物膜
2.1 普遍存在和难以监测
有学者发现开放伤口在48 h内，周围皮肤中存在的微生物即会污染伤口[13]。慢性伤口存在微生物是无法避免的，但伤口组织中的细菌以生物膜的形式存在，主要位于生物膜的多糖基质内，而非均匀分布在伤口表面或在伤口组织中大量繁殖，这使得常规采集伤口组织渗液进行培养和活体组织检查（活检）的方法难以检出生物膜中的细菌，尤其是厌氧菌。有研究发现，比起分子生物学技术，传统的伤口培养结果严重低估了伤口中绿脓杆菌数量的存在[14]。菌拭子如果不在2 h内被处理，则往往得不到需要的结果[15]。因为临床检查阳性结果的缺乏，对于伤口中生物膜的关注起步较晚，直到2007年才有研究对慢性伤口中的生物膜进行了直接的检测，研究者对50例慢性伤口和16例急性伤口活检取样并使用扫描电子显微镜进行观察，发现慢性伤口中有60%存在细菌生物膜，而急性伤口检出细菌生物膜的比例仅有6%[16]。同年，Ngo等[17]对8例患者的12处伤口进行检测，发现其中有7处伤口存在细菌生物膜，且大多存在于伤口表面的坏死组织中。
2.2 对伤口愈合的影响
当细菌在伤口存在并增殖后，会激发伤口的炎症反应以清除细菌，宿主产生大量的中性粒细胞和巨噬细胞围绕生物膜，这些炎症细胞分泌大量的活性氧簇（ROS）和蛋白酶（金属蛋白酶和弹性蛋白酶）[6]。蛋白酶能够破坏生物膜和组织间的黏着，使生物膜脱离伤口。但同时ROS和蛋白酶也会损害正常的组织、蛋白和免疫细胞，反过来抑制伤口修复。由于生物膜自身的特殊结构，其难以被机体的免疫反应清除，导致炎症反应持续，机体的愈合过程停滞，甚至发展为反复发作的慢性感染。
并非所有生物膜的存在都会影响伤口愈合，大多数慢性伤口都无法避免生物膜的存在，但经过规范的病因治疗和局部伤口管理，多数慢性伤口能够顺利愈合，只有一部分伤口会因为种种未知原因（其中包括生物膜的存在）而表现为所谓的难愈性伤口[18]，对于这一类伤口，对生物膜的去除可能促进伤口愈合。
2.3 临床诊断依据
生物膜是一种保护性的生长方式[19]，细菌主要存在于生物膜内部，而感染则是细菌在伤口组织中的大量繁殖和进一步播散，因而二者的临床表现不尽相同；如果细菌在伤口局部繁殖并阻碍伤口的愈合，但不伴随明显的感染征象和阳性的检查结果，这种状态被称为严重定植，有观点认为其实质是伤口床中生物膜的存在[20]。
至今尚无用于诊断生物膜的特异性临床表现，许多文献报道的怀疑有细菌生物膜的伤口的症状与慢性伤口感染症状是重合的，如伤口床苍白，黄色分泌物，坏死组织，表面黏液和腐败的气味等；一些研究把培养出的细菌是否具有形成生物膜的能力作为诊断的标准之一[21]；此外尚有研究把肉芽组织脆弱和伤口颜色鲜红也作为判断标准[3]。Percival等[3]在回顾伤口生物膜的相关证据时总结出可能的症状主要有：伤口不愈合并伴有腐肉或有光泽的表层；特殊气味；坏死组织的存在；对抗菌药物耐药；伤口分离出的细菌具有形成生物膜的能力；活检后观察到微菌落形成、EPS或炎性反应的存在等。但临床观察往往是主观和不确切的，目前认为确认生物膜存在的最可靠方法是某些特殊检查方法，如激光共聚焦显微镜、扫描电子显微镜、聚合酶链式反应、银染法等。
2.4 抗逆性和再生能力
生物膜的自身结构决定了其对于外界有害因素具有很高的抗性，主要由以下几个因素决定：① EPS含水量高，吸收性佳，含有死亡细菌崩解成分，能够抵御一定的干燥和营养缺乏，同时作为一道物理性的屏障，将细菌包埋于其中，使得吞噬细胞和机体产生的各种抗体无法作用于细菌，足够成熟的生物膜甚至能够抵抗小分子抗菌剂的渗透[22]，研究显示，能够杀灭或清除细菌生物膜的最低抑菌浓度实际上远超出抗菌剂的常规使用剂量[23-25]。② 生物膜内细菌常常不止一种，带有不同基因的细菌分泌的保护性的酶和蛋白不同，但在同一个生物膜结构下可以起到相互保护的作用[26]，同时能通过基因突变和交流相互交换耐药基因型，不管细菌类型是否为同一种均可交换[27]，从而使其耐药性变得极其多样化，这一过程也与细菌的群体感应机制[28]有关。③ 休眠细菌的存在。生物膜从外到内，氧气浓度梯度逐渐下降，营养成分减少，细菌的繁殖减少、代谢降低，尤其是位于深层的细菌很难获得养分，处于休眠状态，代谢几乎完全停止，对各种理化刺激和抗菌药物都不敏感。在大部分细菌被杀灭、生物膜结构被破坏后，这部分休眠细菌又能复苏并快速繁殖，使得生物膜反复出现，难以彻底清除。
生物膜形成时间较短，通常2～4 d就能从细菌初步附着状态演化为完全成熟的生物膜[29]，在生物膜尚未成熟时（24 h内），细菌对抗菌药物仍然较为敏感；但48 h后则敏感性大幅降低[30]。体外实验显示生物膜遭到破坏后，24 h内能够重新形成成熟的生物膜[31]；而体内实验中生物膜重建的时间为48 h[32]。
3 慢性伤口生物膜的治疗
伤口中的细菌生物膜难以检测、容易低估、持续存在和难以清除[33]。Phillips等[6]认为对于存在生物膜的慢性伤口，治疗目标主要有：① 去除生物膜对伤口的负担；② 防止生物膜的再生。而这两个目标不可能仅凭某一种抗菌药物或治疗方式即可达到，因此需要提出综合的治疗方案。
Wolcott等[34]提出了一套基于生物膜的伤口护理程序（BBWC），其主要流程是：① 对慢性伤口患者进行全面评估；② 处理影响伤口愈合的全身因素；③ 根据伤口的具体情况，给予以清创为主的基础处理；④ 使用多种抗生物膜的治疗策略，干扰从细菌黏附、EPS形成、信号传递、细菌代谢等过程，达到抑制生物膜再生的效果。
而针对生物膜的治疗策略重点为清创和抗生物膜药物的使用。也有研究者建议采用辅助疗法。根据证据建议[35]，持续规律的清创是有效去除生物膜的最佳方法。清创能去除伤口中的坏死组织、腐肉、异物及其他生物性负荷，为伤口提供良好的愈合环境，常用的有锐器清创[30]、水刀清创[36]等。Wolcott等[34]在BBWC方案下进行的清创为1次/周，效果良好，但目前清创的理想频率尚不明确。与此同时，为了抑制生物膜的再生，考虑采用广谱抗菌剂如银、碘、蜂蜜、盐酸聚乙缩胍等，已有一些体外和体内试验支持抗菌剂的使用[37-40]，但受生物膜检验方式和人体伤口生物膜的复杂性影响，目前仍缺乏相应的临床证据，证明某种抗菌剂对抑制伤口生物膜有确定效果。此外，高压氧、非接触性低频超声、负压伤口疗法等也被认为对生物膜的治疗有一定作用[41]。
4 结语
伤口生物膜的存在可能是造成慢性伤口难以愈合的重要原因，其具有复杂的内部结构和多种沟通交流机制，对理化刺激、免疫反应和抗菌药物都具有很强的抗性，难以被彻底清除；伤口生物膜的治疗应该是一整套管理方案，包括基本的伤口管理措施、定期清创和抗菌药物的使用，以清除生物膜和防止其再生。
随着人口老龄化和疾病谱的变化，慢性伤口日渐成为一个严重的医疗负担。在发达国家，1%～2%的人口在一生中将会发生伤口迁延不愈[1]；仅在英国，每年因慢性伤口而产生的治疗花费就高达10亿英镑[2]。慢性伤口的病因复杂，其临床表现和病程也因患者个体特点的不同而呈现较大的差异，其发病机制和治疗方式至今仍未完全阐明。近年来，细菌生物膜在伤口慢性化中起到的作用逐渐受到重视[3]，Mustoe等[4]认为伤口的细菌负荷是导致慢性伤口不愈合的机制之一。急性伤口中的细菌一般以游离形式存在并进行繁殖[5]，但对慢性伤口而言，伤口上的细菌常常聚集形成生物膜，附着于伤口床但未深入伤口组织内增殖，既缺少明显的临床感染征象[6]，也难以使用局部灭菌剂对其进行杀灭，可能是伤口难以愈合的重要原因。本文从细菌生物膜的定义、特点和处理方式等方面作一简要介绍，以期为临床伤口管理提供参考。
1 生物膜概述
1.1 生物膜定义
在自然环境中，细菌倾向于以生物膜的形式存在[7]。所谓生物膜，是指一种或多种微生物的聚合体，它们被包埋在主要由多糖构成的基质内，不可逆（难以用温和的冲洗去除）地附着于活体组织、医疗器械或者工业管道等的表面[8]。在生物膜中的微生物与游离状态的微生物的基因表达情况有很大区别，这使得它们具有更强的对于物理因素、化学因素、免疫机制、抗生素等有害因素的耐受性，难以清除或杀灭[3]，是细菌为了促进群体生存而形成的复杂的微生态群落。
1.2 生物膜的形成和结构
生物膜在伤口表面的形成大致可分为5个步骤[9]：① 细菌初步附着于表面，这一过程中的附着主要由黏附因子如鞭毛、菌毛、黏附素等介导，并不牢固，通常可逆[10]；② 细菌在增殖过程中分泌主要由多糖、脂类、蛋白、核酸和酶类构成的细胞外多聚物（EPS），使得菌体之间、菌体与伤口表面的黏附变得更加牢固，形成微菌落；③ 微菌落达到一定大小后群体感应（QS）系统激活，释放信号分子，启动特定基因的表达，使得细菌的毒性、运动性、生物膜形成能力等方面发生改变，开始大量分泌EPS，促进生物膜的形成；④ 多个微菌落通过EPS聚集为一个整体，生物膜的结构和功能趋于成熟；⑤ 生物膜的表层释放出浮游细菌、微生物群落和生物膜碎片，迁移到其他部位并黏附，形成新的生物膜。
成熟的生物膜并非单纯的扁平膜样结构，而是一个三维空间的立体结构[8]。对生物膜的直接观测表明，生物膜由多个柱状或蕈状的微菌落连接构成，微菌落中的菌体被EPS包裹[11]，之间形成充满液体的通道以输送氧气、营养、代谢产物、酶等[8, 12]，此外，生物膜中尚存在大量水分、蛋白、死亡和裂解菌体，乃至宿主的一些成分碎片等。
2 慢性伤口中的生物膜
2.1 普遍存在和难以监测
有学者发现开放伤口在48 h内，周围皮肤中存在的微生物即会污染伤口[13]。慢性伤口存在微生物是无法避免的，但伤口组织中的细菌以生物膜的形式存在，主要位于生物膜的多糖基质内，而非均匀分布在伤口表面或在伤口组织中大量繁殖，这使得常规采集伤口组织渗液进行培养和活体组织检查（活检）的方法难以检出生物膜中的细菌，尤其是厌氧菌。有研究发现，比起分子生物学技术，传统的伤口培养结果严重低估了伤口中绿脓杆菌数量的存在[14]。菌拭子如果不在2 h内被处理，则往往得不到需要的结果[15]。因为临床检查阳性结果的缺乏，对于伤口中生物膜的关注起步较晚，直到2007年才有研究对慢性伤口中的生物膜进行了直接的检测，研究者对50例慢性伤口和16例急性伤口活检取样并使用扫描电子显微镜进行观察，发现慢性伤口中有60%存在细菌生物膜，而急性伤口检出细菌生物膜的比例仅有6%[16]。同年，Ngo等[17]对8例患者的12处伤口进行检测，发现其中有7处伤口存在细菌生物膜，且大多存在于伤口表面的坏死组织中。
2.2 对伤口愈合的影响
当细菌在伤口存在并增殖后，会激发伤口的炎症反应以清除细菌，宿主产生大量的中性粒细胞和巨噬细胞围绕生物膜，这些炎症细胞分泌大量的活性氧簇（ROS）和蛋白酶（金属蛋白酶和弹性蛋白酶）[6]。蛋白酶能够破坏生物膜和组织间的黏着，使生物膜脱离伤口。但同时ROS和蛋白酶也会损害正常的组织、蛋白和免疫细胞，反过来抑制伤口修复。由于生物膜自身的特殊结构，其难以被机体的免疫反应清除，导致炎症反应持续，机体的愈合过程停滞，甚至发展为反复发作的慢性感染。
并非所有生物膜的存在都会影响伤口愈合，大多数慢性伤口都无法避免生物膜的存在，但经过规范的病因治疗和局部伤口管理，多数慢性伤口能够顺利愈合，只有一部分伤口会因为种种未知原因（其中包括生物膜的存在）而表现为所谓的难愈性伤口[18]，对于这一类伤口，对生物膜的去除可能促进伤口愈合。
2.3 临床诊断依据
生物膜是一种保护性的生长方式[19]，细菌主要存在于生物膜内部，而感染则是细菌在伤口组织中的大量繁殖和进一步播散，因而二者的临床表现不尽相同；如果细菌在伤口局部繁殖并阻碍伤口的愈合，但不伴随明显的感染征象和阳性的检查结果，这种状态被称为严重定植，有观点认为其实质是伤口床中生物膜的存在[20]。
至今尚无用于诊断生物膜的特异性临床表现，许多文献报道的怀疑有细菌生物膜的伤口的症状与慢性伤口感染症状是重合的，如伤口床苍白，黄色分泌物，坏死组织，表面黏液和腐败的气味等；一些研究把培养出的细菌是否具有形成生物膜的能力作为诊断的标准之一[21]；此外尚有研究把肉芽组织脆弱和伤口颜色鲜红也作为判断标准[3]。Percival等[3]在回顾伤口生物膜的相关证据时总结出可能的症状主要有：伤口不愈合并伴有腐肉或有光泽的表层；特殊气味；坏死组织的存在；对抗菌药物耐药；伤口分离出的细菌具有形成生物膜的能力；活检后观察到微菌落形成、EPS或炎性反应的存在等。但临床观察往往是主观和不确切的，目前认为确认生物膜存在的最可靠方法是某些特殊检查方法，如激光共聚焦显微镜、扫描电子显微镜、聚合酶链式反应、银染法等。
2.4 抗逆性和再生能力
生物膜的自身结构决定了其对于外界有害因素具有很高的抗性，主要由以下几个因素决定：① EPS含水量高，吸收性佳，含有死亡细菌崩解成分，能够抵御一定的干燥和营养缺乏，同时作为一道物理性的屏障，将细菌包埋于其中，使得吞噬细胞和机体产生的各种抗体无法作用于细菌，足够成熟的生物膜甚至能够抵抗小分子抗菌剂的渗透[22]，研究显示，能够杀灭或清除细菌生物膜的最低抑菌浓度实际上远超出抗菌剂的常规使用剂量[23-25]。② 生物膜内细菌常常不止一种，带有不同基因的细菌分泌的保护性的酶和蛋白不同，但在同一个生物膜结构下可以起到相互保护的作用[26]，同时能通过基因突变和交流相互交换耐药基因型，不管细菌类型是否为同一种均可交换[27]，从而使其耐药性变得极其多样化，这一过程也与细菌的群体感应机制[28]有关。③ 休眠细菌的存在。生物膜从外到内，氧气浓度梯度逐渐下降，营养成分减少，细菌的繁殖减少、代谢降低，尤其是位于深层的细菌很难获得养分，处于休眠状态，代谢几乎完全停止，对各种理化刺激和抗菌药物都不敏感。在大部分细菌被杀灭、生物膜结构被破坏后，这部分休眠细菌又能复苏并快速繁殖，使得生物膜反复出现，难以彻底清除。
生物膜形成时间较短，通常2～4 d就能从细菌初步附着状态演化为完全成熟的生物膜[29]，在生物膜尚未成熟时（24 h内），细菌对抗菌药物仍然较为敏感；但48 h后则敏感性大幅降低[30]。体外实验显示生物膜遭到破坏后，24 h内能够重新形成成熟的生物膜[31]；而体内实验中生物膜重建的时间为48 h[32]。
3 慢性伤口生物膜的治疗
伤口中的细菌生物膜难以检测、容易低估、持续存在和难以清除[33]。Phillips等[6]认为对于存在生物膜的慢性伤口，治疗目标主要有：① 去除生物膜对伤口的负担；② 防止生物膜的再生。而这两个目标不可能仅凭某一种抗菌药物或治疗方式即可达到，因此需要提出综合的治疗方案。
Wolcott等[34]提出了一套基于生物膜的伤口护理程序（BBWC），其主要流程是：① 对慢性伤口患者进行全面评估；② 处理影响伤口愈合的全身因素；③ 根据伤口的具体情况，给予以清创为主的基础处理；④ 使用多种抗生物膜的治疗策略，干扰从细菌黏附、EPS形成、信号传递、细菌代谢等过程，达到抑制生物膜再生的效果。
而针对生物膜的治疗策略重点为清创和抗生物膜药物的使用。也有研究者建议采用辅助疗法。根据证据建议[35]，持续规律的清创是有效去除生物膜的最佳方法。清创能去除伤口中的坏死组织、腐肉、异物及其他生物性负荷，为伤口提供良好的愈合环境，常用的有锐器清创[30]、水刀清创[36]等。Wolcott等[34]在BBWC方案下进行的清创为1次/周，效果良好，但目前清创的理想频率尚不明确。与此同时，为了抑制生物膜的再生，考虑采用广谱抗菌剂如银、碘、蜂蜜、盐酸聚乙缩胍等，已有一些体外和体内试验支持抗菌剂的使用[37-40]，但受生物膜检验方式和人体伤口生物膜的复杂性影响，目前仍缺乏相应的临床证据，证明某种抗菌剂对抑制伤口生物膜有确定效果。此外，高压氧、非接触性低频超声、负压伤口疗法等也被认为对生物膜的治疗有一定作用[41]。
4 结语
伤口生物膜的存在可能是造成慢性伤口难以愈合的重要原因，其具有复杂的内部结构和多种沟通交流机制，对理化刺激、免疫反应和抗菌药物都具有很强的抗性，难以被彻底清除；伤口生物膜的治疗应该是一整套管理方案，包括基本的伤口管理措施、定期清创和抗菌药物的使用，以清除生物膜和防止其再生。