引用本文： 石华, 刘丽红, 董涛, 王建新, 王泉武. 乙型肝炎病毒e抗体检测中和试验的应用评价. 华西医学, 2015, 30(10): 1930-1932. doi: 10.7507/1002-0179.20150551 复制
乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）是乙型肝炎病毒（HBV）感染的重要血清学标志物，乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的消失、抗-HBe的出现，被称为血清学转换，是HBV复制水平降低的标志。目前，由于缺少抗-HBe检测的标准方法，临床实验室对可疑标本通常采用不同的方法进行复检，然而不同检测方法，甚至相同方法不同试剂检测抗-HBe常出现不一致的结果[1-2]，给临床决策造成困扰。参考乙型肝炎病毒表面抗原（HBeAg）和表面抗体以中和试验作为临床确认实验的做法[3]，我们建立了抗-HBe检测的中和试验，并初步探讨其临床应用价值。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 标本来源
将2013年2月－5月本实验室采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测的103份抗-HBe样本吸光度[A，旧称光密度（OD）]值与临界值的比值（S/CO）界于0.8～1.5的标本作为待确认标本，剔除溶血、乳糜及严重黄疸标本后将血清储存于-20℃，其中S/CO界于0.8～1.0的阴性标本44份（S/CO=1.0时为阴性），S/CO界于1.0～1.5的阳性标本59份。
1.2 方法
1.2.1 仪器与试剂
Multiskan Ascent酶标仪（芬兰雷勃公司）；ROCHE Cobas E-601全自动免疫分析仪而及配套试剂（德国罗氏公司），批号：16799204；科华洗板机（上海科华公司）；HBeAg检测试剂（上海科华公司），试剂批号：201212021；抗-HBe检测试剂（上海科华公司），试剂批号：201211020。
1.2.2 试验方法
① 中和试验检测103例抗-HBe待确认血清。② 选取乙型肝炎5项结果均为阴性的标本25份，剔除溶血、乳糜及严重黄疸标本，且其他感染性指标均为阴性，充分混匀，作为阴性对照血清。③ 用HBeAg强阳性、抗-HBe阴性的急性乙型肝炎患者血清作为HBeAg阳性中和血清。充分混合后用阴性对照血清将其稀释为A450 nm 1.5～2.0之间。④ 取50 mL配制好的HBeAg阳性血清与50 mL待测标本充分混匀作为中和组。将50 mL配制好的HBeAg阳性血清与50 mL阴性对照血清充分混匀作为对照组。两组均在微量振荡器上充分混匀15 s，然后置37℃ 1 h，再用HBeAg检测试剂进行检测，即待测血清中的抗-HBe与微孔板上包被的抗-HBe，及试剂中的酶标抗-HBe，共同竞争结合中和血清中的HBeAg。中和组用复孔检测，对照组检测20孔，检测步骤参照试剂说明书进行。⑤ 结果判定：该方法为中和竞争法，标本中抗-HBe的含量与A值呈反比。以中和组A450 nm≤对照组A450 nm（取20个孔的均值）的50%判断为抗-HBe具有反应性。⑥ 电化学发光法验证实验：将留取的103份标本编号，用随机数字表法随机选取72份标本，用ROCHE Cobas E-601 全自动免疫分析仪及配套试剂（德国罗氏公司）进行抗-HBe检测，检测步骤及结果判断依照说明书进行，室内质量控制均应在控。
1.3 统计学方法
本研究为配对设计的计数资料，制作四格表，用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计算一致性系数（Kappa值）分析不同检测方法间的一致性[4]，相关计算公式：检测结果一致率（P0）=（真阳性+真阴性）/n；期望一致率（Pe）=1/n[（真阳性+假阴性）（真阳性+假阳性）+（假阳性+真阴性）（假阴性+真阴性）]；Kappa值=（P0-Pe）/（1-Pe）。再用μ检验做假设检验（α=0.05），相关计算公式为[5]：
| $\mu = \frac{K}{{Se\left( K \right)}},Se\left( K \right) = \sqrt {\frac{{{P_0}\left( {1 - {P_0}} \right)}}{{N\left( {1 - {P_e}} \right)}}}。$ |
2 结果
2.1 中和试验确认抗-HBe待确认血清的结果
20个对照孔的A450 nm均值为1.105 6，以其50%（0.552 8）作为临界点，＜0.552 8为中和试验有反应性；＞0.552 8为中和试验无反应性。103份ELISA法抗-HBe处于检测灰区标本，经中和试验确认为真阳性的有57份，假阳性2份，真阴性18份，假阴性26份。见表 1。
表1
ELISA与中和试验检测结果的比较（份）
2.2 中和试验经电化学发光法验证的结果
从103例待确认标本中随机抽取72份，用电化学发光法对中和试验的结果进行验证，将两种方法的检测结果制成诊断试验四格表，经电化学发光法确认为真阳性的34份，假阳性3份，真阴性29份，假阴性6份。见表 2。
表2
电化学发光和中和试验检测结果的比较（份）
2.3 统计分析的结果
以中和试验为基准，ELISA方法检测抗-HBe的灵敏度为68.67%，特异度为90.00%，总符合率为72.82%。
中和试验和电化学发光法检测抗-HBe的P0=87.50%，Pe=50.15%，Kappa值=0.749。μ=13.64，＞95%标准正态分位数1.96，故P＜0.05，可认为两种检测方法结果具有一致性。
3 讨论
在HBV感染的自然病程中，抗-HBe阴性的HBsAg和乙型肝炎病毒c抗体（抗-HBc）低滴度者被认为是急性期感染，而伴随抗-HBe阳性者多为恢复期患者。抗-HBe处于检测灰区的可疑标本，尤其是伴随HBsAg和抗-HBc低滴度者，其感染状态较难判断。灰区的存在是ELISA方法学的重要特征，常导致临床标本初筛和复检时结果不一致[6]，用浓度接近临界值的标本作为评价材料，比用强阳性或低阴性标本更能发现检测误差[7]。因此，本研究选择ELISA法检测抗-HBe的S/CO值界于0.8～1.5的标本来评价自建中和试验检测系统的临床应用价值。
本研究结果显示，59份ELISA法抗-HBe阳性标本经中和试验确认为57份具有反应性；无反应性的2份经电化学发光法检测也显示阴性，认为是ELISA法检测抗-HBe的非特异性反应，为假阳性结果。44份ELISA法抗-HBe阴性标本经中和试验确认后有26份显示有反应性，表明该ELISA试剂检测抗-HBe的漏诊率较高。我们的前期研究也表明临床实验室用于检测抗-HBe的不同方法间检出率差距较大[8]，亟需建立标准化的检测方法用于确认各实验室间的不一致结果。
在无“金标准”的情况下，两种检测方法的一致性评价常用Kappa检验。电化学发光法检测抗-HBe 是一项成熟的技术，灵敏度和特异度均较好，因此我们将中和试验与电化学发光法相比较，评价中和试验的性能。经计算，Kappa值为0.75，说明两种方法的一致性较好。值得注意的是有4份中和试验显示有反应性的标本用电化学发光检测时为阴性结果，结合病史及其他HBV感染标志物，分析可能是基因重组抗原/抗体的反应特异性较野生株较差所致[9]。
用于中和抗-HBe的HBeAg阳性血清选自抗-HBe阴性的急性HBV感染者的混合血清，血清型较多，有利于不同亚型及变异株的检出；待测血清与HBeAg阳性血清的预反应形成“优势竞争”也是自建中和试验检测较为灵敏的原因；更加重要的是取自急性感染者的HBeAg与抗-HBe结合的特异性优于基因重组方式制备的抗原[10]；因此，该自建中和试验检测系统用于抗-HBe检测实用、经济、操作简便，可作为补充试验对不确定结果进行确认。
乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）是乙型肝炎病毒（HBV）感染的重要血清学标志物，乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的消失、抗-HBe的出现，被称为血清学转换，是HBV复制水平降低的标志。目前，由于缺少抗-HBe检测的标准方法，临床实验室对可疑标本通常采用不同的方法进行复检，然而不同检测方法，甚至相同方法不同试剂检测抗-HBe常出现不一致的结果[1-2]，给临床决策造成困扰。参考乙型肝炎病毒表面抗原（HBeAg）和表面抗体以中和试验作为临床确认实验的做法[3]，我们建立了抗-HBe检测的中和试验，并初步探讨其临床应用价值。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 标本来源
将2013年2月－5月本实验室采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测的103份抗-HBe样本吸光度[A，旧称光密度（OD）]值与临界值的比值（S/CO）界于0.8～1.5的标本作为待确认标本，剔除溶血、乳糜及严重黄疸标本后将血清储存于-20℃，其中S/CO界于0.8～1.0的阴性标本44份（S/CO=1.0时为阴性），S/CO界于1.0～1.5的阳性标本59份。
1.2 方法
1.2.1 仪器与试剂
Multiskan Ascent酶标仪（芬兰雷勃公司）；ROCHE Cobas E-601全自动免疫分析仪而及配套试剂（德国罗氏公司），批号：16799204；科华洗板机（上海科华公司）；HBeAg检测试剂（上海科华公司），试剂批号：201212021；抗-HBe检测试剂（上海科华公司），试剂批号：201211020。
1.2.2 试验方法
① 中和试验检测103例抗-HBe待确认血清。② 选取乙型肝炎5项结果均为阴性的标本25份，剔除溶血、乳糜及严重黄疸标本，且其他感染性指标均为阴性，充分混匀，作为阴性对照血清。③ 用HBeAg强阳性、抗-HBe阴性的急性乙型肝炎患者血清作为HBeAg阳性中和血清。充分混合后用阴性对照血清将其稀释为A450 nm 1.5～2.0之间。④ 取50 mL配制好的HBeAg阳性血清与50 mL待测标本充分混匀作为中和组。将50 mL配制好的HBeAg阳性血清与50 mL阴性对照血清充分混匀作为对照组。两组均在微量振荡器上充分混匀15 s，然后置37℃ 1 h，再用HBeAg检测试剂进行检测，即待测血清中的抗-HBe与微孔板上包被的抗-HBe，及试剂中的酶标抗-HBe，共同竞争结合中和血清中的HBeAg。中和组用复孔检测，对照组检测20孔，检测步骤参照试剂说明书进行。⑤ 结果判定：该方法为中和竞争法，标本中抗-HBe的含量与A值呈反比。以中和组A450 nm≤对照组A450 nm（取20个孔的均值）的50%判断为抗-HBe具有反应性。⑥ 电化学发光法验证实验：将留取的103份标本编号，用随机数字表法随机选取72份标本，用ROCHE Cobas E-601 全自动免疫分析仪及配套试剂（德国罗氏公司）进行抗-HBe检测，检测步骤及结果判断依照说明书进行，室内质量控制均应在控。
1.3 统计学方法
本研究为配对设计的计数资料，制作四格表，用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计算一致性系数（Kappa值）分析不同检测方法间的一致性[4]，相关计算公式：检测结果一致率（P0）=（真阳性+真阴性）/n；期望一致率（Pe）=1/n[（真阳性+假阴性）（真阳性+假阳性）+（假阳性+真阴性）（假阴性+真阴性）]；Kappa值=（P0-Pe）/（1-Pe）。再用μ检验做假设检验（α=0.05），相关计算公式为[5]：
| $\mu = \frac{K}{{Se\left( K \right)}},Se\left( K \right) = \sqrt {\frac{{{P_0}\left( {1 - {P_0}} \right)}}{{N\left( {1 - {P_e}} \right)}}}。$ |
2 结果
2.1 中和试验确认抗-HBe待确认血清的结果
20个对照孔的A450 nm均值为1.105 6，以其50%（0.552 8）作为临界点，＜0.552 8为中和试验有反应性；＞0.552 8为中和试验无反应性。103份ELISA法抗-HBe处于检测灰区标本，经中和试验确认为真阳性的有57份，假阳性2份，真阴性18份，假阴性26份。见表 1。
表1
ELISA与中和试验检测结果的比较（份）
2.2 中和试验经电化学发光法验证的结果
从103例待确认标本中随机抽取72份，用电化学发光法对中和试验的结果进行验证，将两种方法的检测结果制成诊断试验四格表，经电化学发光法确认为真阳性的34份，假阳性3份，真阴性29份，假阴性6份。见表 2。
表2
电化学发光和中和试验检测结果的比较（份）
2.3 统计分析的结果
以中和试验为基准，ELISA方法检测抗-HBe的灵敏度为68.67%，特异度为90.00%，总符合率为72.82%。
中和试验和电化学发光法检测抗-HBe的P0=87.50%，Pe=50.15%，Kappa值=0.749。μ=13.64，＞95%标准正态分位数1.96，故P＜0.05，可认为两种检测方法结果具有一致性。
3 讨论
在HBV感染的自然病程中，抗-HBe阴性的HBsAg和乙型肝炎病毒c抗体（抗-HBc）低滴度者被认为是急性期感染，而伴随抗-HBe阳性者多为恢复期患者。抗-HBe处于检测灰区的可疑标本，尤其是伴随HBsAg和抗-HBc低滴度者，其感染状态较难判断。灰区的存在是ELISA方法学的重要特征，常导致临床标本初筛和复检时结果不一致[6]，用浓度接近临界值的标本作为评价材料，比用强阳性或低阴性标本更能发现检测误差[7]。因此，本研究选择ELISA法检测抗-HBe的S/CO值界于0.8～1.5的标本来评价自建中和试验检测系统的临床应用价值。
本研究结果显示，59份ELISA法抗-HBe阳性标本经中和试验确认为57份具有反应性；无反应性的2份经电化学发光法检测也显示阴性，认为是ELISA法检测抗-HBe的非特异性反应，为假阳性结果。44份ELISA法抗-HBe阴性标本经中和试验确认后有26份显示有反应性，表明该ELISA试剂检测抗-HBe的漏诊率较高。我们的前期研究也表明临床实验室用于检测抗-HBe的不同方法间检出率差距较大[8]，亟需建立标准化的检测方法用于确认各实验室间的不一致结果。
在无“金标准”的情况下，两种检测方法的一致性评价常用Kappa检验。电化学发光法检测抗-HBe 是一项成熟的技术，灵敏度和特异度均较好，因此我们将中和试验与电化学发光法相比较，评价中和试验的性能。经计算，Kappa值为0.75，说明两种方法的一致性较好。值得注意的是有4份中和试验显示有反应性的标本用电化学发光检测时为阴性结果，结合病史及其他HBV感染标志物，分析可能是基因重组抗原/抗体的反应特异性较野生株较差所致[9]。
用于中和抗-HBe的HBeAg阳性血清选自抗-HBe阴性的急性HBV感染者的混合血清，血清型较多，有利于不同亚型及变异株的检出；待测血清与HBeAg阳性血清的预反应形成“优势竞争”也是自建中和试验检测较为灵敏的原因；更加重要的是取自急性感染者的HBeAg与抗-HBe结合的特异性优于基因重组方式制备的抗原[10]；因此，该自建中和试验检测系统用于抗-HBe检测实用、经济、操作简便，可作为补充试验对不确定结果进行确认。
