引用本文： 董艳, 陆金根. 香连丸对溃疡性结肠炎大鼠细胞凋亡及Bcl-2、Bax mRNA表达的影响. 华西医学, 2016, 31(6): 1046-1051. doi: 10.7507/1002-0179.201600281 复制
溃疡性结肠炎（UC）临床以腹泻、腹痛、大便带血或黏液脓血便为主要表现。虽然其病因尚未十分明确，但有研究表明异常的细胞凋亡参与了溃疡形成的病理过程。细胞凋亡在生物体的进化、内环境的稳定等方面起着重要作用。细胞凋亡的调节机制非常复杂，其中Bcl-2家族的作用突出。Bcl-2家族涉有众多成员，包括Bax等。Bcl-2成员间的二聚体化是其功能调节的主要方式，Bcl-2的生理功能是阻止细胞凋亡，延长细胞寿命，Bcl-2/Bax系统失衡，可能参与UC的发病过程。本研究通过对细胞凋亡因子Bcl-2、Bax的研究，探讨香连丸对UC大鼠结肠组织细胞凋亡的影响。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
7周龄清洁级Wistar雄性大鼠50只，体质量（200±20）g，由上海中医药大学动物实验中心提供。适应性喂养标准饲料7 d后开始进行实验。
1.2 实验药物
5% 2，4，6-三硝基苯磺酸溶液（TNBS）（美国Sigma公司）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号20130407）；香连丸（国药准字Z42020398，湖北诺得胜制药有限公司，主要成分：萸黄连，木香）；AG490（Tyrphostin B42）（美国Selleck公司）；Trizol（美国Invitrogen公司）；逆转录（RT）试剂盒，Sybr green（TAKARA公司），氯仿，异丙醇（国药集团化学试剂有限公司）；原位末端凋亡（TUNEL）检测试剂盒（德国宝灵曼公司）。
1.3 主要仪器
实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（美国ABI公司），高速冷冻离心机（德国EPPENDORF公司），低温冰箱（日本SANYO公司），高压蒸气消毒器（上海医用核子仪器厂），紫外分光光度计（上海第三分析仪器厂），光学显微镜（奥林巴斯CKX41），切片机RM2145（德国Lico公司）。
1.4 方法
1.4.1 造模方法
采用Morris等[1]用5% TNBS/乙醇复制UC模型。除正常组外其余各组造模大鼠造模前1 d均禁食不禁水24 h，按100 mg/kg计算TNBS（约等于TNBS原液0.18 mL/100 g）加50%乙醇0.25 mL，用聚丙烯管插入肛门上段8 cm后一次性注入混合试剂。
1.4.2 分组及给药
应用随机数字表进行完全随机化分组，分为5组，每组10只，即正常组、模型组（UC模型）、中药组、抑制剂组、中药+抑制剂组。于造模开始第1天，各组分别以下列方法处理：① 正常组：蒸馏水灌胃；② 模型组：蒸馏水灌胃；③ 中药组（香连丸）：香连丸研磨成粉，蒸馏水制成混悬液，按 1.6 g/kg生药量灌胃；④ 抑制剂组：按说明指导剂量配制（AG490、二甲基亚砜、双蒸水按1︰1︰3）2 mg/kg 剂量腹腔注射，蒸馏水灌胃；⑤ 中药+抑制剂组：AG4902 mg/kg腹腔注射，1.6 g/kg中药灌胃。连续灌胃给药10 d。
1.4.3 标本采集
于末次给药结束后，禁食12 h。麻醉大鼠，自肛门上2～8 cm处，截取结肠组织，肉眼观察黏膜组织，并按照结肠组织损伤评分标准记录：① 粘连：无粘连，计0分；轻度粘连（结肠与周围组织可较易剥离），计1分；重度粘连（较难分离粘连组织），计2分。② 溃疡形成及炎症评分：无充血、无溃疡，计0分；局部充血、无溃疡，计1分；1处溃疡不伴充血或肠壁增厚，计2分；1处溃疡伴炎症，计 3分；≥2处溃疡伴炎症，计4分；＞2处溃疡和（或）炎症＞1 cm，计5分；溃疡和（或）炎症＞2 cm，病变范围每增加1 cm，计分加1分。
取结肠组织，部分以4%多聚甲醛固定，进行常规石蜡切片，苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜观察，并根据镜下评分标准病理评分。溃疡面：无溃疡，计 0分；溃疡＜3 cm2，计1分；溃疡＞3 cm2，计2分。炎症：无，计0分；轻度，计1分；重度，计2分。肉芽肿：无，计0分；有，计1分。病变深度：无，计0分；黏膜下层，计1分；肌层，计2分；浆膜层，计3分。纤维化：无，计0分；轻度，计1分；重度，计2分。部分结肠组织液氮保存备用荧光定量PCR检测。
1.4.4 TUNEL法检测细胞凋亡
组织用4%甲醛溶液4℃过夜固定，浸蜡、包埋、切片，厚度4 μm，检测前切片常规脱蜡入水。样品片放入新鲜配制的3%过氧化氢溶液中，室温10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗样品片：5 min/次，洗3次。用0.01 mol/L PBS （7.4）稀释DAN蛋白酶K储备液中20 μg/mL，50 μL/片 加至脱蜡入水后的样品片上37℃湿盒中放置 20 min。双蒸水洗样品：5 min/次，洗3次；样品片上加标记缓冲液，20 μL/片，室温放置15 min。将TDT及Biotin-11-dUTP离心混匀后，分别取2 μL加入16 μL标记缓冲液中，混匀。甩掉样品片上标记缓冲液，保证样品片湿润，然后加已混匀的混合液至样品片上，20 μL/片，37℃湿盒中标记60 min。标记后的样品片浸泡于2倍SSC中，室温放置15 min。PBS洗样品片：3 min/次，洗3次。样品片加封闭液 50 μL/片，室温放置30 min，然后甩掉封闭液。以封闭液按1︰50配制Avidin-HRP为工作液；50 μL片加于样品片上，37℃反应60 min。PBS洗样品片：3 min/次，洗3次。二氨基联苯胺显色液显色，苏木素复染，常规封片，显微镜检查。每个样品3个视野镜下计数阳性细胞。
1.4.5 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
取结肠组织50 mg，按照Trizol试剂盒说明提取总RNA，分光光度计测定RNA浓度，互补DNA合成，PCR扩增。引物由上海英俊生物技术有限公司合成（表 1）。PCR反应条件为95℃ 30 s；95℃ 3 s，60℃ 30 s，40个循环。目的基因的相对表达量可以采用∆∆CT法加以分析。通常以正常或阴性作为对照样本。CT值—n：扩增循环，∆CT=目的基因CT-内参CT（注：同一反转录产物扩增后），∆∆CT=观察样本∆CT-对照样本∆CT=（观察样本目的基因CT-观察样本内参CT）-（对照样本目的基因CT-对照样本内参CT）；样本的相对表达量=2-∆∆CT
表1
引物序列
1.5 统计学方法
采用统计软件SPSS 19.0分析数据。计量资料数据以均数±标准差表示，均数的组间差异采用方差分析，组间两两比较采用LSD法。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 各组大鼠肉眼及光学显微镜下观察结肠组织形态及黏膜损伤评分结果
溃疡性大鼠病变结肠黏膜肉眼可见溃疡多发，肠壁增厚，黏膜糜烂并充血；中药组、抑制剂组及中药+抑制组结肠黏膜充血程度减轻，轻度糜烂，溃疡不明显。与正常组比较，模型组大鼠组织学损伤程度严重，有统计学意义（P＜0.001）；与模型组比较，中药及抑制剂干预各组结肠黏膜损伤程度减轻，有统计学意义（P＜0.05）。光学显微镜下，模型组大鼠结肠黏膜溃疡可达肌层，溃疡面较大，炎症反应重度，伴充血、糜烂，轻度纤维化；中药及抑制剂干预各组可见不同程度损伤改变，但程度较模型组轻。组织学评分结果表明，与正常组比较，模型组大鼠组织学损伤程度严重，有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，给药各组结肠黏膜损伤程度减轻，有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
表2
各组大鼠肉眼及光学显微镜下观察黏膜组织损伤分值 （n=10，2.2 结肠组织病理学变化
光学显微镜下可见正常组结肠组织见腺体排列整齐，隐窝正常，杯状细胞无减少，无黏膜糜烂、出血；模型组可见腺腔不规则扩张，腺管排列紊乱，黏膜及黏膜下层血管有高度扩张充血，甚至个别模型的结肠组织切片可见巨大溃疡，溃疡深达肌层，并有大量炎细胞浸润，浸润程度可及黏膜下或固有层，部分浸润全层，以中性粒细胞、淋巴细胞为主；抑制剂组可见黏膜消失或部分消失，腺体排列紊乱，炎性细胞浸润，但较模型组有所减轻；中药组及中药+抑制剂组的组织损伤最轻，多表现为接近正常组。见图 1。
图1
各组结肠组织光学显微镜下病理学变化（HE ×100） 1a. 正常组结肠组织见腺体排列整齐，隐窝正常，杯状细胞正常，无黏膜糜烂、出血 1b. 模型组结肠组织见腺腔不规则扩张，腺管排列紊乱，黏膜及黏膜下层血管有高度扩张充血，有大量炎细胞浸润，以中性粒细胞、淋巴细胞为主 1c. 模型组可见巨大溃疡，溃疡深达肌层 1d. 中药组结肠组织损伤较小，腺管排列基本整齐，隐窝正常，杯状细胞无减少，未见黏膜糜烂 1e.抑制剂组可见黏膜消失或部分消失，腺体排列紊乱，炎性细胞浸润，但较模型组有所减轻 1f. 中药+抑制剂组组织损伤最轻，表现接近正常组 图 2TUNEL法检测细胞凋亡（400倍镜下，电压2.79 V，电流2.51 A，阳性细胞核棕褐色染色） 2a. 正常组：凋亡细胞数目较少（褐色染色细胞少） 2b. 模型组：凋亡细胞数目明显增多（褐色染色细胞核较多） 2c. 中药组：凋亡细胞数目较模型组少（褐色细胞核减少） 2d. 抑制剂组：凋亡细胞数目较模型组少 2e. 中药+抑制剂组：凋亡细胞数目减少（褐色细胞核减少）
2.3 香连丸对大鼠结肠组织细胞凋亡的影响
光学显微镜下可见阳性细胞核棕褐色染色（图 2）。各组凋亡指数分别为正常组（5.53±2.49）%，模型组（21.20±5.37）%，中药组（7.93±2.87）%，抑制剂组（10.60±4.97）%，中药+抑制剂组（8.66±3.24）%，模型组凋亡指数明显高于其他各组，差异有统计学意义（P＜0.001）；经药物干预后的中药组/抑制剂组细胞凋亡指数较模型组明显减少，有统计学意义（P＜0.001）；而药物干预后的各组与正常组相比无明显差异（P＞0.05）。见图 3。
图3
TUNEL 法检测各组细胞凋亡情况
2.4 香连丸对大鼠Bcl-2、Bax mRNA的表达影响
与正常组比较，模型组大鼠结肠组织Bcl-2 mRNA表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药组、抑制剂组及中药+抑制剂组结肠组织中Bcl-2 mRNA表达水平均升高，接近正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与正常组比较，模型组大鼠结肠组织Bax的mRNA表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药组、抑制剂组及中药+抑制剂组结肠组织中Bax mRNA表达水平降低，接近正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 3、图 4。
图4
各组大鼠结肠组织中Bcl-2、Bax mRNA表达
4a. Bcl-2 mRNA的表达 4b. Bax mRNA的表达
表3
各组大鼠结肠组织中Bcl-2、Bax 的mRNA 相对表达量（n=10，3 讨论
正常结肠上皮存在凋亡现象，是肠上皮细胞更新的生理过程，为自发性凋亡；而UC炎症时黏膜上皮细胞凋亡速率明显增加。上皮细胞凋亡的增加可能导致上皮屏障的改变，从而增加肠损伤的发生[2]。细胞凋亡是在某些生理或病理因素诱导下，激活膜信号系统，启动自身内部机制，主要通过内源性DNA内切酶的激活而发生的自然死亡现象[3]。凋亡对确保正常发育、生长以及维持内环境稳定有着重要的作用。细胞凋亡是由参与细胞凋亡的系列基因相对表达程度决定的，并受多种细胞因子的影响，细胞凋亡参与组织中炎症细胞数量的调节。研究表明，UC患者淋巴细胞凋亡延迟[4]，淋巴细胞介导的细胞毒作用在UC发病机制中占重要地位。肠道免疫-炎症调节功能异常，不能将免疫反应下调，使得肠道炎症反应得以持续[5]。
细胞凋亡常通过Bcl-2家族中的Bcl-2和Bax来调节。Bcl-2是抑制细胞凋亡的一种癌基因[6]，编码一个相对分子质量为26×103的蛋白，借助C端疏水区定位于线粒体外膜、内质网膜、核膜上，直接影响线粒体膜功能，其主要生物学功能是延长细胞寿命，增加细胞对多种调亡刺激因素的抗性，被认为是细胞凋亡调控的最后通路之一。Bax是凋亡基因家族的核心成员之一，由p53直接激活，提高凋亡的敏感性，促进p53介导的细胞凋亡。有研究认为Bcl-2可作为促细胞生存信号，而Bax是促进上皮细胞凋亡的组成部分，并且影响Bcl-2的凋亡作用，Bcl-2与Bax的比例决定了细胞的存活或死亡[2, 7]。有研究显示Bax/Bcl-2比率增加，提高线粒体释放细胞色素C，促进肠壁损伤的进行[8]。Bax/Bcl-2比率与上皮细胞凋亡呈正相关[9]。 亦有研究发现Bax蛋白和mRNA在活动性UC的结肠上皮表达减少，在正常黏膜和非活动性UC则增加[10-13]。
本研究的前期试验中，发现白细胞介素-6/信号转导及转录激活蛋白（STAT）3信号通路相关因子表达异常是UC发生的重要分子生物学基础，STAT3活化抑制剂piceatannol可以使细胞凋亡调控蛋白Bcl-2表达减弱[14]，表明STAT3途径可调节Bcl-2表达，STAT3的活化通过增强Bcl-2表达，显示其抗凋亡效应。有研究显示，UC患者肠黏膜中Bcl-2表达增加，且以上皮细胞、淋巴细胞和浆细胞为主，而炎性细胞中Bax表达减少，说明UC肠黏膜炎性细胞的凋亡减少与上皮细胞的凋亡增加同步进行，在UC的溃疡形成中起一定作用[15]。亦有研究表明，UC患者肠黏膜组织中Bcl-2、Bax均下调，其中，Bax的凋亡主要是上皮细胞，Bcl-2的凋亡主要是淋巴细胞，并且两者具有弱相关性[16]。故在本实验中分组采用了STAT3通路中的抑制剂AG-490干预，观察香连丸干预、抑制剂干预及中药+抑制剂共同干预的细胞凋亡结果。本实验研究发现在UC模型大鼠中结肠组织中Bcl-2 mRNA的表达降低，抗凋亡性减退，而Bax mRNA表达相对增加，细胞凋亡加速，肠道上皮细胞凋亡进程加快，促进肠壁损伤。
中药古方香连丸出自《太平惠民和剂局方》，是临床治疗湿热痢疾的主要方剂之一，具有清热燥湿，行气化滞之功效。目前，临床多用于治疗大肠湿热所致的痢疾、肠炎、肠伤寒或者胃炎等属湿热为患者。现代药理研究表明，香连丸具有抗溃疡、解痉、抗病原微生物、止泻等作用，在本实验研究证实，香连丸可提高Bax mRNA、减少Bcl-2 mRNA的表达，改善结肠黏膜损伤，减少上皮细胞凋亡，改善细胞凋亡情况，其机制可能是通过调节凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA表达的平衡，调节Bax/Bcl-2的比例，诱导结肠黏膜固有层淋巴细胞凋亡，达到缓解UC目的，这一发现可能为UC的中药治疗提供新的理论基础。
综上所述，本实验运用TNBS经典造模方法建立UC模型大鼠，观察UC模型大鼠的结肠病理情况，发现结肠黏膜损伤情况与细胞凋亡因子Bcl-2、Bax的变化有关；通过有效中成药香连丸干预，发现可提高Bcl-2 mRNA、减少Bax mRNA的表达，其机制可能是通过调节Bcl-2、Bax mRNA表达的平衡，调节Bax/Bcl-2的比例，缓解上皮细胞凋亡。
溃疡性结肠炎（UC）临床以腹泻、腹痛、大便带血或黏液脓血便为主要表现。虽然其病因尚未十分明确，但有研究表明异常的细胞凋亡参与了溃疡形成的病理过程。细胞凋亡在生物体的进化、内环境的稳定等方面起着重要作用。细胞凋亡的调节机制非常复杂，其中Bcl-2家族的作用突出。Bcl-2家族涉有众多成员，包括Bax等。Bcl-2成员间的二聚体化是其功能调节的主要方式，Bcl-2的生理功能是阻止细胞凋亡，延长细胞寿命，Bcl-2/Bax系统失衡，可能参与UC的发病过程。本研究通过对细胞凋亡因子Bcl-2、Bax的研究，探讨香连丸对UC大鼠结肠组织细胞凋亡的影响。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
7周龄清洁级Wistar雄性大鼠50只，体质量（200±20）g，由上海中医药大学动物实验中心提供。适应性喂养标准饲料7 d后开始进行实验。
1.2 实验药物
5% 2，4，6-三硝基苯磺酸溶液（TNBS）（美国Sigma公司）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号20130407）；香连丸（国药准字Z42020398，湖北诺得胜制药有限公司，主要成分：萸黄连，木香）；AG490（Tyrphostin B42）（美国Selleck公司）；Trizol（美国Invitrogen公司）；逆转录（RT）试剂盒，Sybr green（TAKARA公司），氯仿，异丙醇（国药集团化学试剂有限公司）；原位末端凋亡（TUNEL）检测试剂盒（德国宝灵曼公司）。
1.3 主要仪器
实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（美国ABI公司），高速冷冻离心机（德国EPPENDORF公司），低温冰箱（日本SANYO公司），高压蒸气消毒器（上海医用核子仪器厂），紫外分光光度计（上海第三分析仪器厂），光学显微镜（奥林巴斯CKX41），切片机RM2145（德国Lico公司）。
1.4 方法
1.4.1 造模方法
采用Morris等[1]用5% TNBS/乙醇复制UC模型。除正常组外其余各组造模大鼠造模前1 d均禁食不禁水24 h，按100 mg/kg计算TNBS（约等于TNBS原液0.18 mL/100 g）加50%乙醇0.25 mL，用聚丙烯管插入肛门上段8 cm后一次性注入混合试剂。
1.4.2 分组及给药
应用随机数字表进行完全随机化分组，分为5组，每组10只，即正常组、模型组（UC模型）、中药组、抑制剂组、中药+抑制剂组。于造模开始第1天，各组分别以下列方法处理：① 正常组：蒸馏水灌胃；② 模型组：蒸馏水灌胃；③ 中药组（香连丸）：香连丸研磨成粉，蒸馏水制成混悬液，按 1.6 g/kg生药量灌胃；④ 抑制剂组：按说明指导剂量配制（AG490、二甲基亚砜、双蒸水按1︰1︰3）2 mg/kg 剂量腹腔注射，蒸馏水灌胃；⑤ 中药+抑制剂组：AG4902 mg/kg腹腔注射，1.6 g/kg中药灌胃。连续灌胃给药10 d。
1.4.3 标本采集
于末次给药结束后，禁食12 h。麻醉大鼠，自肛门上2～8 cm处，截取结肠组织，肉眼观察黏膜组织，并按照结肠组织损伤评分标准记录：① 粘连：无粘连，计0分；轻度粘连（结肠与周围组织可较易剥离），计1分；重度粘连（较难分离粘连组织），计2分。② 溃疡形成及炎症评分：无充血、无溃疡，计0分；局部充血、无溃疡，计1分；1处溃疡不伴充血或肠壁增厚，计2分；1处溃疡伴炎症，计 3分；≥2处溃疡伴炎症，计4分；＞2处溃疡和（或）炎症＞1 cm，计5分；溃疡和（或）炎症＞2 cm，病变范围每增加1 cm，计分加1分。
取结肠组织，部分以4%多聚甲醛固定，进行常规石蜡切片，苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜观察，并根据镜下评分标准病理评分。溃疡面：无溃疡，计 0分；溃疡＜3 cm2，计1分；溃疡＞3 cm2，计2分。炎症：无，计0分；轻度，计1分；重度，计2分。肉芽肿：无，计0分；有，计1分。病变深度：无，计0分；黏膜下层，计1分；肌层，计2分；浆膜层，计3分。纤维化：无，计0分；轻度，计1分；重度，计2分。部分结肠组织液氮保存备用荧光定量PCR检测。
1.4.4 TUNEL法检测细胞凋亡
组织用4%甲醛溶液4℃过夜固定，浸蜡、包埋、切片，厚度4 μm，检测前切片常规脱蜡入水。样品片放入新鲜配制的3%过氧化氢溶液中，室温10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗样品片：5 min/次，洗3次。用0.01 mol/L PBS （7.4）稀释DAN蛋白酶K储备液中20 μg/mL，50 μL/片 加至脱蜡入水后的样品片上37℃湿盒中放置 20 min。双蒸水洗样品：5 min/次，洗3次；样品片上加标记缓冲液，20 μL/片，室温放置15 min。将TDT及Biotin-11-dUTP离心混匀后，分别取2 μL加入16 μL标记缓冲液中，混匀。甩掉样品片上标记缓冲液，保证样品片湿润，然后加已混匀的混合液至样品片上，20 μL/片，37℃湿盒中标记60 min。标记后的样品片浸泡于2倍SSC中，室温放置15 min。PBS洗样品片：3 min/次，洗3次。样品片加封闭液 50 μL/片，室温放置30 min，然后甩掉封闭液。以封闭液按1︰50配制Avidin-HRP为工作液；50 μL片加于样品片上，37℃反应60 min。PBS洗样品片：3 min/次，洗3次。二氨基联苯胺显色液显色，苏木素复染，常规封片，显微镜检查。每个样品3个视野镜下计数阳性细胞。
1.4.5 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
取结肠组织50 mg，按照Trizol试剂盒说明提取总RNA，分光光度计测定RNA浓度，互补DNA合成，PCR扩增。引物由上海英俊生物技术有限公司合成（表 1）。PCR反应条件为95℃ 30 s；95℃ 3 s，60℃ 30 s，40个循环。目的基因的相对表达量可以采用∆∆CT法加以分析。通常以正常或阴性作为对照样本。CT值—n：扩增循环，∆CT=目的基因CT-内参CT（注：同一反转录产物扩增后），∆∆CT=观察样本∆CT-对照样本∆CT=（观察样本目的基因CT-观察样本内参CT）-（对照样本目的基因CT-对照样本内参CT）；样本的相对表达量=2-∆∆CT
表1
引物序列
1.5 统计学方法
采用统计软件SPSS 19.0分析数据。计量资料数据以均数±标准差表示，均数的组间差异采用方差分析，组间两两比较采用LSD法。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 各组大鼠肉眼及光学显微镜下观察结肠组织形态及黏膜损伤评分结果
溃疡性大鼠病变结肠黏膜肉眼可见溃疡多发，肠壁增厚，黏膜糜烂并充血；中药组、抑制剂组及中药+抑制组结肠黏膜充血程度减轻，轻度糜烂，溃疡不明显。与正常组比较，模型组大鼠组织学损伤程度严重，有统计学意义（P＜0.001）；与模型组比较，中药及抑制剂干预各组结肠黏膜损伤程度减轻，有统计学意义（P＜0.05）。光学显微镜下，模型组大鼠结肠黏膜溃疡可达肌层，溃疡面较大，炎症反应重度，伴充血、糜烂，轻度纤维化；中药及抑制剂干预各组可见不同程度损伤改变，但程度较模型组轻。组织学评分结果表明，与正常组比较，模型组大鼠组织学损伤程度严重，有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，给药各组结肠黏膜损伤程度减轻，有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
表2
各组大鼠肉眼及光学显微镜下观察黏膜组织损伤分值 （n=10，2.2 结肠组织病理学变化
光学显微镜下可见正常组结肠组织见腺体排列整齐，隐窝正常，杯状细胞无减少，无黏膜糜烂、出血；模型组可见腺腔不规则扩张，腺管排列紊乱，黏膜及黏膜下层血管有高度扩张充血，甚至个别模型的结肠组织切片可见巨大溃疡，溃疡深达肌层，并有大量炎细胞浸润，浸润程度可及黏膜下或固有层，部分浸润全层，以中性粒细胞、淋巴细胞为主；抑制剂组可见黏膜消失或部分消失，腺体排列紊乱，炎性细胞浸润，但较模型组有所减轻；中药组及中药+抑制剂组的组织损伤最轻，多表现为接近正常组。见图 1。
图1
各组结肠组织光学显微镜下病理学变化（HE ×100） 1a. 正常组结肠组织见腺体排列整齐，隐窝正常，杯状细胞正常，无黏膜糜烂、出血 1b. 模型组结肠组织见腺腔不规则扩张，腺管排列紊乱，黏膜及黏膜下层血管有高度扩张充血，有大量炎细胞浸润，以中性粒细胞、淋巴细胞为主 1c. 模型组可见巨大溃疡，溃疡深达肌层 1d. 中药组结肠组织损伤较小，腺管排列基本整齐，隐窝正常，杯状细胞无减少，未见黏膜糜烂 1e.抑制剂组可见黏膜消失或部分消失，腺体排列紊乱，炎性细胞浸润，但较模型组有所减轻 1f. 中药+抑制剂组组织损伤最轻，表现接近正常组 图 2TUNEL法检测细胞凋亡（400倍镜下，电压2.79 V，电流2.51 A，阳性细胞核棕褐色染色） 2a. 正常组：凋亡细胞数目较少（褐色染色细胞少） 2b. 模型组：凋亡细胞数目明显增多（褐色染色细胞核较多） 2c. 中药组：凋亡细胞数目较模型组少（褐色细胞核减少） 2d. 抑制剂组：凋亡细胞数目较模型组少 2e. 中药+抑制剂组：凋亡细胞数目减少（褐色细胞核减少）
2.3 香连丸对大鼠结肠组织细胞凋亡的影响
光学显微镜下可见阳性细胞核棕褐色染色（图 2）。各组凋亡指数分别为正常组（5.53±2.49）%，模型组（21.20±5.37）%，中药组（7.93±2.87）%，抑制剂组（10.60±4.97）%，中药+抑制剂组（8.66±3.24）%，模型组凋亡指数明显高于其他各组，差异有统计学意义（P＜0.001）；经药物干预后的中药组/抑制剂组细胞凋亡指数较模型组明显减少，有统计学意义（P＜0.001）；而药物干预后的各组与正常组相比无明显差异（P＞0.05）。见图 3。
图3
TUNEL 法检测各组细胞凋亡情况
2.4 香连丸对大鼠Bcl-2、Bax mRNA的表达影响
与正常组比较，模型组大鼠结肠组织Bcl-2 mRNA表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药组、抑制剂组及中药+抑制剂组结肠组织中Bcl-2 mRNA表达水平均升高，接近正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与正常组比较，模型组大鼠结肠组织Bax的mRNA表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药组、抑制剂组及中药+抑制剂组结肠组织中Bax mRNA表达水平降低，接近正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 3、图 4。
图4
各组大鼠结肠组织中Bcl-2、Bax mRNA表达
4a. Bcl-2 mRNA的表达 4b. Bax mRNA的表达
表3
各组大鼠结肠组织中Bcl-2、Bax 的mRNA 相对表达量（n=10，3 讨论
正常结肠上皮存在凋亡现象，是肠上皮细胞更新的生理过程，为自发性凋亡；而UC炎症时黏膜上皮细胞凋亡速率明显增加。上皮细胞凋亡的增加可能导致上皮屏障的改变，从而增加肠损伤的发生[2]。细胞凋亡是在某些生理或病理因素诱导下，激活膜信号系统，启动自身内部机制，主要通过内源性DNA内切酶的激活而发生的自然死亡现象[3]。凋亡对确保正常发育、生长以及维持内环境稳定有着重要的作用。细胞凋亡是由参与细胞凋亡的系列基因相对表达程度决定的，并受多种细胞因子的影响，细胞凋亡参与组织中炎症细胞数量的调节。研究表明，UC患者淋巴细胞凋亡延迟[4]，淋巴细胞介导的细胞毒作用在UC发病机制中占重要地位。肠道免疫-炎症调节功能异常，不能将免疫反应下调，使得肠道炎症反应得以持续[5]。
细胞凋亡常通过Bcl-2家族中的Bcl-2和Bax来调节。Bcl-2是抑制细胞凋亡的一种癌基因[6]，编码一个相对分子质量为26×103的蛋白，借助C端疏水区定位于线粒体外膜、内质网膜、核膜上，直接影响线粒体膜功能，其主要生物学功能是延长细胞寿命，增加细胞对多种调亡刺激因素的抗性，被认为是细胞凋亡调控的最后通路之一。Bax是凋亡基因家族的核心成员之一，由p53直接激活，提高凋亡的敏感性，促进p53介导的细胞凋亡。有研究认为Bcl-2可作为促细胞生存信号，而Bax是促进上皮细胞凋亡的组成部分，并且影响Bcl-2的凋亡作用，Bcl-2与Bax的比例决定了细胞的存活或死亡[2, 7]。有研究显示Bax/Bcl-2比率增加，提高线粒体释放细胞色素C，促进肠壁损伤的进行[8]。Bax/Bcl-2比率与上皮细胞凋亡呈正相关[9]。 亦有研究发现Bax蛋白和mRNA在活动性UC的结肠上皮表达减少，在正常黏膜和非活动性UC则增加[10-13]。
本研究的前期试验中，发现白细胞介素-6/信号转导及转录激活蛋白（STAT）3信号通路相关因子表达异常是UC发生的重要分子生物学基础，STAT3活化抑制剂piceatannol可以使细胞凋亡调控蛋白Bcl-2表达减弱[14]，表明STAT3途径可调节Bcl-2表达，STAT3的活化通过增强Bcl-2表达，显示其抗凋亡效应。有研究显示，UC患者肠黏膜中Bcl-2表达增加，且以上皮细胞、淋巴细胞和浆细胞为主，而炎性细胞中Bax表达减少，说明UC肠黏膜炎性细胞的凋亡减少与上皮细胞的凋亡增加同步进行，在UC的溃疡形成中起一定作用[15]。亦有研究表明，UC患者肠黏膜组织中Bcl-2、Bax均下调，其中，Bax的凋亡主要是上皮细胞，Bcl-2的凋亡主要是淋巴细胞，并且两者具有弱相关性[16]。故在本实验中分组采用了STAT3通路中的抑制剂AG-490干预，观察香连丸干预、抑制剂干预及中药+抑制剂共同干预的细胞凋亡结果。本实验研究发现在UC模型大鼠中结肠组织中Bcl-2 mRNA的表达降低，抗凋亡性减退，而Bax mRNA表达相对增加，细胞凋亡加速，肠道上皮细胞凋亡进程加快，促进肠壁损伤。
中药古方香连丸出自《太平惠民和剂局方》，是临床治疗湿热痢疾的主要方剂之一，具有清热燥湿，行气化滞之功效。目前，临床多用于治疗大肠湿热所致的痢疾、肠炎、肠伤寒或者胃炎等属湿热为患者。现代药理研究表明，香连丸具有抗溃疡、解痉、抗病原微生物、止泻等作用，在本实验研究证实，香连丸可提高Bax mRNA、减少Bcl-2 mRNA的表达，改善结肠黏膜损伤，减少上皮细胞凋亡，改善细胞凋亡情况，其机制可能是通过调节凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA表达的平衡，调节Bax/Bcl-2的比例，诱导结肠黏膜固有层淋巴细胞凋亡，达到缓解UC目的，这一发现可能为UC的中药治疗提供新的理论基础。
综上所述，本实验运用TNBS经典造模方法建立UC模型大鼠，观察UC模型大鼠的结肠病理情况，发现结肠黏膜损伤情况与细胞凋亡因子Bcl-2、Bax的变化有关；通过有效中成药香连丸干预，发现可提高Bcl-2 mRNA、减少Bax mRNA的表达，其机制可能是通过调节Bcl-2、Bax mRNA表达的平衡，调节Bax/Bcl-2的比例，缓解上皮细胞凋亡。
