引用本文： 胡静, 李立新, 罗俐梅, 李壹, 黄卓春, 彭晓东, 武永康. 全自动间接免疫荧光法分析仪检测抗核抗体与人工判读的对比研究. 华西医学, 2016, 31(6): 1084-1087. doi: 10.7507/1002-0179.201600291 复制
抗核抗体（ANA）是泛指一类具有抗各种细胞成分的自身抗体，现已被证实ANA与某些自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化症、干燥综合征等）的致病机制有关[1-2]。ANA的检测主要应用于医学诊断领域，但同时也被认为是一个可以评估预后和指导治疗方法的指标[3]。目前，对于实现ANA标准化测试的需求仍然是一个挑战，因为其分析变异性是很高的[4-7]。目前临床上有多种检测ANA的方法，其中间接免疫荧光（IIF）法是ANA检测的推荐方法[8]，此方法具有较高的灵敏度，能够检测出50余种抗体，所以通常作为诊断自身免疫性疾病的首选方法[8-12]。但IIF法荧光载片必须要由有经验的检验人员进行显微镜检查以判断其核型和滴度，在标本量大的情况下，全部人工显微镜检查任务繁重，并且有一定的主观性，标准化和自动化程度相对比较低[13-15]。全自动间接免疫荧光法分析仪（HELIOS）是一种全新的IIF实验处理平台，可以集荧光实验前端染色处理与后端图像采集、判读于一体，具有通量高、操作速度快、设计人性化、性能稳定、外形小巧等特点。本研究将探讨HELIOS对ANA的读片结果与人工显微镜检查结果的一致性。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源
选取四川大学华西医院实验医学科2015年2月来院就诊的门诊及住院患者的标本共281例。
1.1.2 采用试剂及仪器
德国 AESKU.DIAGNOSTICS GmbH&Co.KG公司生产的ANA检测试剂盒（IIF法）和HELIOS分析仪；Nikon E600 荧光显微镜（日本尼康株式会社）。
1.2 方法
用HELIOS检测ANA，按其仪器操作规程将281例标本上机实验并自动判读阴阳性及滴度结果；对比方法：实验后的载片由专业人员在荧光显微镜下进行阴阳性及滴度判读，在荧光显微镜下观察人喉癌上皮（Hep-2）细胞的荧光染色情况，若无荧光染色为阴性，若有荧光染色，但是不能区分是何种荧光模型则判断为可疑（±），若有较强的荧光染色并且能判断荧光模型则为阳性。阳性结果的滴度判断则与HELIOS的滴度判断一致，依次为1︰80、1︰160、1︰320、1︰640、1︰1 280、1︰2 560。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。两种方法阴阳性比较采用配对χ2检验；采用kappa值进行一致性检验；两种方法的一致程度用符合率表示，总的符合率= （两种方法结果一致的总数/样本总数）×100%，阳性符合率= （两种方法都阳性的总数/实验方法的阳性总数） ×100%，阴性符合率=（两种方法都阴性的总数/实验方法的阴性总数）×100%；两种方法各个滴度之间的比较采用秩和检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 HELIOS判读与人工显微镜检查的阴阳性比较
281例样本中，人工显微镜检查阳性203例，HELIOS阳性者201例，两者差异无统计学意义（P＞0.05），一致性检验kappa值为0.973。通过计算得出总的符合率是98.9%，阳性符合率为99.5%，阴性符合率为97.4%。人工显微镜检查结果和HELIOS判读结果比较见表 1。
表1
HELIOS判读与人工显微镜检查的阴阳性比较（例）
2.2 HELIOS判读与人工显微镜检查的各个滴度比较
HELIOS判读与人工显微镜检查的各个滴度的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
HELIOS判读与人工显微镜检查的各个滴度比较（例）
3 讨论
ANA是诊断自身免疫性疾病的重要指标，以Hep-2细胞作为基质的IIF法是检测ANA的最主要的方法，而此方法结果的准确性除了取决于荧光载片的质量、操作过程的准确，更重要的是实验室专业人员对荧光载片的显微镜检查。由于实验室工作人员对于样本荧光核型的判断容易出现错判或漏判，而对于滴度的判断容易高判或弱判，目前人工实验滴度准确判断的唯一途径是梯度稀释法，不仅浪费时间、试剂，且临床应用极少。所以，实现自身抗体的全自动检测（包括自动化实验操作与结果判读）并在此基础上逐渐实现全过程的标准化是未来的发展趋势。
ANA的IIF实验结果判断包括阴阳性、荧光核型和对应的荧光滴度，其中阴阳性和荧光滴度对于临床来说最为重要，而荧光核型可以辅助ANA谱对应自身抗体的确认和疾病临床诊断。从现有IIF自动化结果判断系统的功能及其状态来看，所有系统均采用自动化荧光显微镜及成像系统，对荧光反应区进行区域多点自动化成像后通过软件进行结果判读；大部分系统均可以对阴阳性、荧光滴度和荧光核型进行自动化判读。Bizzaro等[13]的研究对市场上现存的6种IIF荧光片自动判读系统进行了单独Hep-2细胞基质的ANA荧光结果多中心比对试验，从结果来看，所有系统仅有阴阳性及滴度判断可应用于临床，准确度及特异度均可达90%左右；而荧光核型由于其仅能实现针对检测ANA的Hep-2细胞基质部分单独荧光模型（最多7种）达到约60%～70%左右准确性的判读，对于其他模型尤其是广泛存在的混合模型无法实现自动化判读，且所有结果均须经过阅片专家确认后方可报告，一定程度上反而增加了检测实验的时间精力耗费，因此不建议将其直接应用于临床检测。
本研究对同一批临床随机常规标本采用HELIOS自动判读系统与人工显微镜检查进行比较，HELIOS自动判读系统是将标本检测和载片判读（仅限于阴阳性与滴度）集于一体的自动化仪器，从开始检测到最后仪器自动出读片结果，可无人值守，但其最后结果也须经阅片专家确认方可报告。
本研究比较了两种方法的阴阳性结果以及阳性滴度的结果。经过统计分析，配对χ2检验差异无统计学意义，方法学比较的一致性检验kappa=0.973，表明一致性较好，说明HELIOS自动判读系统可以用于临床。但大多数医院在报告ANA阳性结果时，内容都包含核型和滴度，但这套系统只能用于滴度的判断，而不能对标本核型进行判读。所以，如果将这套系统应用于临床，在仪器自动出结果之后实验人员需再调取标本相应的图片，进行滴度的复核，以及核型的判断。虽然HELIOS自动判读系统不能完全实现自动化，但是能够有效筛选出阳性标本，并减少人工判断滴度的步骤并提高滴度判读的准确性和稳定性，从目前ANA 的IIF常规标本检查阳性率10%～30%左右、体检标本阳性率不超过5%的现状来看，应用HELIOS确实可以提高工作效率。而且HELIOS通过实验操作和结果判读的全过程自动化，所有实验过程均全部记录储存可完整回溯，疑难结果可由专家进行远程和补充会诊确认；而不同实验室间采用该系统可实现室内结果稳定和室间结果无差别互认，对于IIF的标准化是一个显著进展。
HELIOS自动判读系统的自动化程度相对较高，重复性好，可以降低人工判读所带来的误差，提高滴度判读的准确性。仪器可在无人值守的情况下正常运行，提高工作效率。载片经封片后可长期保存，不影响判读结果。仪器采集的样本图片可永久保存，方便实验人员对样本的荧光核型进行再判断，遇到有疑问或需复查的患者可进行图片比对。仪器通量较大（可同时检测最多190个样本，20张载片），速度较快、外形小巧，既适用于不同规模的临床实验检测，更有利于自身抗体体检。
综上所述，本研究认为HELIOS自动判读系统应用于临床可以提高工作效率，促进标准统一。
抗核抗体（ANA）是泛指一类具有抗各种细胞成分的自身抗体，现已被证实ANA与某些自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化症、干燥综合征等）的致病机制有关[1-2]。ANA的检测主要应用于医学诊断领域，但同时也被认为是一个可以评估预后和指导治疗方法的指标[3]。目前，对于实现ANA标准化测试的需求仍然是一个挑战，因为其分析变异性是很高的[4-7]。目前临床上有多种检测ANA的方法，其中间接免疫荧光（IIF）法是ANA检测的推荐方法[8]，此方法具有较高的灵敏度，能够检测出50余种抗体，所以通常作为诊断自身免疫性疾病的首选方法[8-12]。但IIF法荧光载片必须要由有经验的检验人员进行显微镜检查以判断其核型和滴度，在标本量大的情况下，全部人工显微镜检查任务繁重，并且有一定的主观性，标准化和自动化程度相对比较低[13-15]。全自动间接免疫荧光法分析仪（HELIOS）是一种全新的IIF实验处理平台，可以集荧光实验前端染色处理与后端图像采集、判读于一体，具有通量高、操作速度快、设计人性化、性能稳定、外形小巧等特点。本研究将探讨HELIOS对ANA的读片结果与人工显微镜检查结果的一致性。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源
选取四川大学华西医院实验医学科2015年2月来院就诊的门诊及住院患者的标本共281例。
1.1.2 采用试剂及仪器
德国 AESKU.DIAGNOSTICS GmbH&Co.KG公司生产的ANA检测试剂盒（IIF法）和HELIOS分析仪；Nikon E600 荧光显微镜（日本尼康株式会社）。
1.2 方法
用HELIOS检测ANA，按其仪器操作规程将281例标本上机实验并自动判读阴阳性及滴度结果；对比方法：实验后的载片由专业人员在荧光显微镜下进行阴阳性及滴度判读，在荧光显微镜下观察人喉癌上皮（Hep-2）细胞的荧光染色情况，若无荧光染色为阴性，若有荧光染色，但是不能区分是何种荧光模型则判断为可疑（±），若有较强的荧光染色并且能判断荧光模型则为阳性。阳性结果的滴度判断则与HELIOS的滴度判断一致，依次为1︰80、1︰160、1︰320、1︰640、1︰1 280、1︰2 560。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。两种方法阴阳性比较采用配对χ2检验；采用kappa值进行一致性检验；两种方法的一致程度用符合率表示，总的符合率= （两种方法结果一致的总数/样本总数）×100%，阳性符合率= （两种方法都阳性的总数/实验方法的阳性总数） ×100%，阴性符合率=（两种方法都阴性的总数/实验方法的阴性总数）×100%；两种方法各个滴度之间的比较采用秩和检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 HELIOS判读与人工显微镜检查的阴阳性比较
281例样本中，人工显微镜检查阳性203例，HELIOS阳性者201例，两者差异无统计学意义（P＞0.05），一致性检验kappa值为0.973。通过计算得出总的符合率是98.9%，阳性符合率为99.5%，阴性符合率为97.4%。人工显微镜检查结果和HELIOS判读结果比较见表 1。
表1
HELIOS判读与人工显微镜检查的阴阳性比较（例）
2.2 HELIOS判读与人工显微镜检查的各个滴度比较
HELIOS判读与人工显微镜检查的各个滴度的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
HELIOS判读与人工显微镜检查的各个滴度比较（例）
3 讨论
ANA是诊断自身免疫性疾病的重要指标，以Hep-2细胞作为基质的IIF法是检测ANA的最主要的方法，而此方法结果的准确性除了取决于荧光载片的质量、操作过程的准确，更重要的是实验室专业人员对荧光载片的显微镜检查。由于实验室工作人员对于样本荧光核型的判断容易出现错判或漏判，而对于滴度的判断容易高判或弱判，目前人工实验滴度准确判断的唯一途径是梯度稀释法，不仅浪费时间、试剂，且临床应用极少。所以，实现自身抗体的全自动检测（包括自动化实验操作与结果判读）并在此基础上逐渐实现全过程的标准化是未来的发展趋势。
ANA的IIF实验结果判断包括阴阳性、荧光核型和对应的荧光滴度，其中阴阳性和荧光滴度对于临床来说最为重要，而荧光核型可以辅助ANA谱对应自身抗体的确认和疾病临床诊断。从现有IIF自动化结果判断系统的功能及其状态来看，所有系统均采用自动化荧光显微镜及成像系统，对荧光反应区进行区域多点自动化成像后通过软件进行结果判读；大部分系统均可以对阴阳性、荧光滴度和荧光核型进行自动化判读。Bizzaro等[13]的研究对市场上现存的6种IIF荧光片自动判读系统进行了单独Hep-2细胞基质的ANA荧光结果多中心比对试验，从结果来看，所有系统仅有阴阳性及滴度判断可应用于临床，准确度及特异度均可达90%左右；而荧光核型由于其仅能实现针对检测ANA的Hep-2细胞基质部分单独荧光模型（最多7种）达到约60%～70%左右准确性的判读，对于其他模型尤其是广泛存在的混合模型无法实现自动化判读，且所有结果均须经过阅片专家确认后方可报告，一定程度上反而增加了检测实验的时间精力耗费，因此不建议将其直接应用于临床检测。
本研究对同一批临床随机常规标本采用HELIOS自动判读系统与人工显微镜检查进行比较，HELIOS自动判读系统是将标本检测和载片判读（仅限于阴阳性与滴度）集于一体的自动化仪器，从开始检测到最后仪器自动出读片结果，可无人值守，但其最后结果也须经阅片专家确认方可报告。
本研究比较了两种方法的阴阳性结果以及阳性滴度的结果。经过统计分析，配对χ2检验差异无统计学意义，方法学比较的一致性检验kappa=0.973，表明一致性较好，说明HELIOS自动判读系统可以用于临床。但大多数医院在报告ANA阳性结果时，内容都包含核型和滴度，但这套系统只能用于滴度的判断，而不能对标本核型进行判读。所以，如果将这套系统应用于临床，在仪器自动出结果之后实验人员需再调取标本相应的图片，进行滴度的复核，以及核型的判断。虽然HELIOS自动判读系统不能完全实现自动化，但是能够有效筛选出阳性标本，并减少人工判断滴度的步骤并提高滴度判读的准确性和稳定性，从目前ANA 的IIF常规标本检查阳性率10%～30%左右、体检标本阳性率不超过5%的现状来看，应用HELIOS确实可以提高工作效率。而且HELIOS通过实验操作和结果判读的全过程自动化，所有实验过程均全部记录储存可完整回溯，疑难结果可由专家进行远程和补充会诊确认；而不同实验室间采用该系统可实现室内结果稳定和室间结果无差别互认，对于IIF的标准化是一个显著进展。
HELIOS自动判读系统的自动化程度相对较高，重复性好，可以降低人工判读所带来的误差，提高滴度判读的准确性。仪器可在无人值守的情况下正常运行，提高工作效率。载片经封片后可长期保存，不影响判读结果。仪器采集的样本图片可永久保存，方便实验人员对样本的荧光核型进行再判断，遇到有疑问或需复查的患者可进行图片比对。仪器通量较大（可同时检测最多190个样本，20张载片），速度较快、外形小巧，既适用于不同规模的临床实验检测，更有利于自身抗体体检。
综上所述，本研究认为HELIOS自动判读系统应用于临床可以提高工作效率，促进标准统一。
