引用本文： 胡静, 李立新, 武永康, 魏大鹏, 彭晓东. 抗细胞膜DNA抗体与其他自身抗体的检测及相关分析. 华西医学, 2016, 31(8): 1372-1375. doi: 10.7507/1002-0179.201600374 复制
系统性红斑狼疮（SLE）是一种常见的自身免疫性疾病，常累及多个器官和系统，对患者危害性极大，准确诊断该病对指导治疗有重要意义。患者血清中可出现多种自身抗体，其中具有诊断价值的特异性自身抗体有抗Sm抗体、抗双链DNA（dsDNA）抗体及抗核糖体抗体等，但其灵敏度不高，仅有10%～40%[1-3]。细胞膜DNA（mDNA）是一种线性双链DNA分子，有17 000个碱基对[4]，SLE患者中存在mDNA受体功能障碍，使mDNA不能正常移除[5]，诱导机体产生特异性的抗mDNA抗体。有文献报道，抗mDNA在SLE中阳性率高且特异性强[6]，并且在dsDNA、Sm及抗核小体抗体阴性的SLE中也能检出[7-8]。本研究拟收集我院门诊和住院患者，检测抗mDNA自身抗体以及其他相关自身抗体，评价几种自身抗体的相关性及其在SLE中的诊断价值。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 标本来源
收集2015年1月－8月四川大学华西医院门诊和住院的254例自身免疫性疾病患者血清，包括SLE 106例，类风湿关节炎（RA）80例，混合性结缔组织病（MCTD）32例，干燥综合征（SS）29例，多发性肌炎/皮肌炎（PM/DM）7例，以上各种疾病均符合目前国际诊断标准；另收集20例来我院作健康体检正常者的血清。所有血清放置−20℃冻存待用。
1.2 试剂及仪器
1.2.1 试剂
Raji细胞（Burkitt淋巴瘤细胞）来自四川大学基础与法医学院免疫学教研室；抗核抗体（ANA）、抗dsDNA抗体、抗角蛋白抗体（AKA）检测试剂盒由德国欧蒙实验诊断试剂有限公司提供，荧光二抗采用异硫氰酸荧光素（FITC）标记羊抗人免疫球蛋白（Ig）G抗体；抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体检测试剂盒由广州万孚生物技术有限公司提供；Sm检测采用德国欧蒙实验诊断试剂有限公司提供的抗可溶性抗原谱试剂盒。
1.2.2 仪器
荧光显微镜（日本尼康公司）；IMMAGE自动分析仪（美国贝克曼公司）；酶标仪（日本Benchmark公司）。
1.3 方法
1.3.1 抗mDNA抗体检测
①抗原基质片的制备：收集处于对数生长期的Raji细胞，用Hank液洗涤3次，调节细胞浓度为1×106个/mL，混匀后用微量移液器取10μL加于载物片上反应区，待干燥后分别用70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%乙醇固定30 min，取出待干燥后密封置于−20℃冻存备用。②间接免疫荧光方法检测：待测血清用0.01 mol/L pH值7.2磷酸盐缓冲液1：20稀释，滴加25µL于固定有Raji细胞的载物片反应区内，湿盒室温孵育30 min，洗涤浸泡1～5 min，滴加20µL FITC标记的二抗于载物片反应区内，室温孵育30 min，洗涤浸泡1～5 min，滴加缓冲甘油封片，在荧光显微镜下观察。Raji细胞膜呈现光滑荧光者判为阳性（图 1）。
图1
荧光显微镜下抗mDNA抗体阳性图
1.3.2 ANA、抗dsDNA抗体、AKA检测
严格按使用说明书进行操作和结果判断，血清稀释为ANA1：100，抗dsDNA抗体和AKA 1：10。
1.3.3 类风湿因子（RF）检测
用美国贝克曼公司生产的IMMAGE自动分析仪进行检测，采用速率散射比浊法，RF值＞20 U/mL为阳性。
1.3.4 抗CCP抗体检测
严格按使用说明书操作，结果判断使用标准曲线：将CCP IgG强阳性标准品用样品稀释液作倍比稀释（其浓度分别为200、100、50 U），加上弱阳性标准品（浓度25 U）和试剂空白（样品稀释液）绘制标准曲线，以样品吸光度值在标准曲线上查出抗体浓度，＜20 U为阴性，≥20 U为阳性。
1.3.5 抗Sm抗体检测
严格按使用说明书进行操作和结果判断，血清稀释为1：100。
1.4 统计学方法
用SPSS 11.0统计软件进行统计分析。采用四格表计算抗mDNA抗体对诊断SLE的灵敏度和特异度，计数资料的统计采用χ2检验，对抗mDNA抗体与其他6种抗体的相关性采用Pearson相关分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 各组抗mDNA抗体阳性率
抗mDNA抗体在SLE患者中的阳性率最高（72.6%），高于其他疾病组（0.0%～18.7%）及健康对照组（0.0%），差异有统计学意义（P < 0.001）。见表 1。
表1
抗mDNA抗体在各组中的分布情况
2.2 抗mDNA抗体对于SLE的灵敏度和特异度
对274例研究血清检测抗mDNA抗体，106例SLE中有77例抗mDNA抗体阳性，168例非SLE中有14例阳性，抗mDNA抗体对SLE诊断的灵敏度为72.6%，特异度为91.7%（154/168），诊断效率为84.3%。见表 2。
表2
抗mDNA抗体对SLE诊断的四格表（例）
2.3 抗mDNA抗体与几种自身抗体的相关性分析
对179例血清进行了抗mDNA抗体、抗CCP抗体、AKA、RF、ANA及dsDNA检测，其中83例血清检测了抗Sm抗体，结果见表 3。Pearson相关分析结果显示抗mDNA抗体与ANA、抗dsDNA抗体和抗Sm抗体相关（P < 0.001），与抗CCP抗体、AKA和RF无相关性（P > 0.05）。
表3
抗mDNA抗体与其他6种抗体的相关性（例）
3 讨论
Raji细胞是EB病毒感染的B细胞，以Raji细胞为底物检测自身抗体的研究始于1975年[9]，有学者将Raji细胞与HL60细胞分别作为底物用间接免疫荧光的方法检测抗mDNA抗体，其两者的特异度和灵敏度无较明显的区别，但Raji细胞作为底物的荧光强度更明显，结果更稳定[10]。本研究中我们以Raji细胞为底物，用间接免疫荧光方法检测多种自身免疫性疾病患者血清中的抗mDNA抗体，发现Raji细胞呈荧光阳性者中SLE占大多数（72.6%），明显高于RA（5.0%）、MCTD（18.7%）、SS（14.7%）、PM/DM（0.0%）及健康对照组（0.0%），差异有统计学意义（P < 0.001），抗mDNA抗体对SLE诊断的灵敏度和特异度分别为72.6%和91.7%，该结果提示抗mDNA抗体应用于SLE疾病的诊断是高敏感和高特异的，与之前的报道结果基本一致[11-13]。
针对这几个抗体，本研究进一步将抗mDNA抗体与3种RA特异性自身抗体（包括抗CCP抗体、RF和AKA）、2种SLE特异性自身抗体（包括抗Sm抗体、抗dsDNA抗体）以及ANA的相关性进行研究，结果显示：抗mDNA抗体与抗CCP抗体、AKA及RF均无显著相关性（P > 0.05）；抗mDNA抗体与ANA、抗Sm抗体及抗dsDNA抗体显著相关（P < 0.001）。因此，本研究的结果再次表明以Raji细胞为底物用间接免疫荧光法检测的抗mDNA抗体是SLE特异的自身抗体。
已有学者研究发现EB病毒是SLE的病原学因素，几乎所有成人SLE均感染过EB病毒，感染率可达95%[14]，EB病毒持续感染产生的EB病毒核抗原（EBNA）可能诱导机体发生自身免疫反应[15]。在SLE的成人及儿童患者中可以检测到抗EB病毒早期抗原（EBV-EA）抗体、抗EB病毒核抗原抗体（EBV-VCA），且阳性率均高于健康对照组[16]。EB病毒与自身抗体的产生有关，已有研究发现EBNA-1N端35-38序列（EB病毒编码核抗原之一）与核糖核蛋白SmD C端95-119具有高度同源性，正常人、EB病毒相关疾病和自身免疫疾病均可产生抗EBNA-1 N端35-38抗体，但只有从SLE亲和纯化来的该抗体与SmD C端有相似的亲和力，也和SmD结合（免疫印迹法），即SLE有与自身抗原交叉反应的抗病毒抗体，其阳性率为38%；EBNA-2354GRGKGKSRDKQRK PGGPWRP373序列和核糖核蛋白SmD1 101GRGRGRGRGRGRGRGGPRR119具有高度同源性，EBNA-2病毒诱导的抗体可能与SmD1抗体发生交叉反应[17]。本研究也发现抗mDNA抗体与抗Sm抗体显著相关，是否提示以Raji细胞（EB病毒感染B细胞）为底物检测到的抗mDNA抗体所针对抗原的本质是EB病毒成分？这还有待于进一步研究。
综上所述，抗mDNA抗体对SLE的诊断具有高度敏感性和特异性，推广此项检测有助于提高临床医生诊断SLE的准确性，具有重要意义。进一步研究抗mDNA抗体所针对抗原的本质，可能会有助于揭示SLE发病机制，为诊断和治疗SLE提供更加可靠的科学依据。
系统性红斑狼疮（SLE）是一种常见的自身免疫性疾病，常累及多个器官和系统，对患者危害性极大，准确诊断该病对指导治疗有重要意义。患者血清中可出现多种自身抗体，其中具有诊断价值的特异性自身抗体有抗Sm抗体、抗双链DNA（dsDNA）抗体及抗核糖体抗体等，但其灵敏度不高，仅有10%～40%[1-3]。细胞膜DNA（mDNA）是一种线性双链DNA分子，有17 000个碱基对[4]，SLE患者中存在mDNA受体功能障碍，使mDNA不能正常移除[5]，诱导机体产生特异性的抗mDNA抗体。有文献报道，抗mDNA在SLE中阳性率高且特异性强[6]，并且在dsDNA、Sm及抗核小体抗体阴性的SLE中也能检出[7-8]。本研究拟收集我院门诊和住院患者，检测抗mDNA自身抗体以及其他相关自身抗体，评价几种自身抗体的相关性及其在SLE中的诊断价值。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 标本来源
收集2015年1月－8月四川大学华西医院门诊和住院的254例自身免疫性疾病患者血清，包括SLE 106例，类风湿关节炎（RA）80例，混合性结缔组织病（MCTD）32例，干燥综合征（SS）29例，多发性肌炎/皮肌炎（PM/DM）7例，以上各种疾病均符合目前国际诊断标准；另收集20例来我院作健康体检正常者的血清。所有血清放置−20℃冻存待用。
1.2 试剂及仪器
1.2.1 试剂
Raji细胞（Burkitt淋巴瘤细胞）来自四川大学基础与法医学院免疫学教研室；抗核抗体（ANA）、抗dsDNA抗体、抗角蛋白抗体（AKA）检测试剂盒由德国欧蒙实验诊断试剂有限公司提供，荧光二抗采用异硫氰酸荧光素（FITC）标记羊抗人免疫球蛋白（Ig）G抗体；抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体检测试剂盒由广州万孚生物技术有限公司提供；Sm检测采用德国欧蒙实验诊断试剂有限公司提供的抗可溶性抗原谱试剂盒。
1.2.2 仪器
荧光显微镜（日本尼康公司）；IMMAGE自动分析仪（美国贝克曼公司）；酶标仪（日本Benchmark公司）。
1.3 方法
1.3.1 抗mDNA抗体检测
①抗原基质片的制备：收集处于对数生长期的Raji细胞，用Hank液洗涤3次，调节细胞浓度为1×106个/mL，混匀后用微量移液器取10μL加于载物片上反应区，待干燥后分别用70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%乙醇固定30 min，取出待干燥后密封置于−20℃冻存备用。②间接免疫荧光方法检测：待测血清用0.01 mol/L pH值7.2磷酸盐缓冲液1：20稀释，滴加25µL于固定有Raji细胞的载物片反应区内，湿盒室温孵育30 min，洗涤浸泡1～5 min，滴加20µL FITC标记的二抗于载物片反应区内，室温孵育30 min，洗涤浸泡1～5 min，滴加缓冲甘油封片，在荧光显微镜下观察。Raji细胞膜呈现光滑荧光者判为阳性（图 1）。
图1
荧光显微镜下抗mDNA抗体阳性图
1.3.2 ANA、抗dsDNA抗体、AKA检测
严格按使用说明书进行操作和结果判断，血清稀释为ANA1：100，抗dsDNA抗体和AKA 1：10。
1.3.3 类风湿因子（RF）检测
用美国贝克曼公司生产的IMMAGE自动分析仪进行检测，采用速率散射比浊法，RF值＞20 U/mL为阳性。
1.3.4 抗CCP抗体检测
严格按使用说明书操作，结果判断使用标准曲线：将CCP IgG强阳性标准品用样品稀释液作倍比稀释（其浓度分别为200、100、50 U），加上弱阳性标准品（浓度25 U）和试剂空白（样品稀释液）绘制标准曲线，以样品吸光度值在标准曲线上查出抗体浓度，＜20 U为阴性，≥20 U为阳性。
1.3.5 抗Sm抗体检测
严格按使用说明书进行操作和结果判断，血清稀释为1：100。
1.4 统计学方法
用SPSS 11.0统计软件进行统计分析。采用四格表计算抗mDNA抗体对诊断SLE的灵敏度和特异度，计数资料的统计采用χ2检验，对抗mDNA抗体与其他6种抗体的相关性采用Pearson相关分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 各组抗mDNA抗体阳性率
抗mDNA抗体在SLE患者中的阳性率最高（72.6%），高于其他疾病组（0.0%～18.7%）及健康对照组（0.0%），差异有统计学意义（P < 0.001）。见表 1。
表1
抗mDNA抗体在各组中的分布情况
2.2 抗mDNA抗体对于SLE的灵敏度和特异度
对274例研究血清检测抗mDNA抗体，106例SLE中有77例抗mDNA抗体阳性，168例非SLE中有14例阳性，抗mDNA抗体对SLE诊断的灵敏度为72.6%，特异度为91.7%（154/168），诊断效率为84.3%。见表 2。
表2
抗mDNA抗体对SLE诊断的四格表（例）
2.3 抗mDNA抗体与几种自身抗体的相关性分析
对179例血清进行了抗mDNA抗体、抗CCP抗体、AKA、RF、ANA及dsDNA检测，其中83例血清检测了抗Sm抗体，结果见表 3。Pearson相关分析结果显示抗mDNA抗体与ANA、抗dsDNA抗体和抗Sm抗体相关（P < 0.001），与抗CCP抗体、AKA和RF无相关性（P > 0.05）。
表3
抗mDNA抗体与其他6种抗体的相关性（例）
3 讨论
Raji细胞是EB病毒感染的B细胞，以Raji细胞为底物检测自身抗体的研究始于1975年[9]，有学者将Raji细胞与HL60细胞分别作为底物用间接免疫荧光的方法检测抗mDNA抗体，其两者的特异度和灵敏度无较明显的区别，但Raji细胞作为底物的荧光强度更明显，结果更稳定[10]。本研究中我们以Raji细胞为底物，用间接免疫荧光方法检测多种自身免疫性疾病患者血清中的抗mDNA抗体，发现Raji细胞呈荧光阳性者中SLE占大多数（72.6%），明显高于RA（5.0%）、MCTD（18.7%）、SS（14.7%）、PM/DM（0.0%）及健康对照组（0.0%），差异有统计学意义（P < 0.001），抗mDNA抗体对SLE诊断的灵敏度和特异度分别为72.6%和91.7%，该结果提示抗mDNA抗体应用于SLE疾病的诊断是高敏感和高特异的，与之前的报道结果基本一致[11-13]。
针对这几个抗体，本研究进一步将抗mDNA抗体与3种RA特异性自身抗体（包括抗CCP抗体、RF和AKA）、2种SLE特异性自身抗体（包括抗Sm抗体、抗dsDNA抗体）以及ANA的相关性进行研究，结果显示：抗mDNA抗体与抗CCP抗体、AKA及RF均无显著相关性（P > 0.05）；抗mDNA抗体与ANA、抗Sm抗体及抗dsDNA抗体显著相关（P < 0.001）。因此，本研究的结果再次表明以Raji细胞为底物用间接免疫荧光法检测的抗mDNA抗体是SLE特异的自身抗体。
已有学者研究发现EB病毒是SLE的病原学因素，几乎所有成人SLE均感染过EB病毒，感染率可达95%[14]，EB病毒持续感染产生的EB病毒核抗原（EBNA）可能诱导机体发生自身免疫反应[15]。在SLE的成人及儿童患者中可以检测到抗EB病毒早期抗原（EBV-EA）抗体、抗EB病毒核抗原抗体（EBV-VCA），且阳性率均高于健康对照组[16]。EB病毒与自身抗体的产生有关，已有研究发现EBNA-1N端35-38序列（EB病毒编码核抗原之一）与核糖核蛋白SmD C端95-119具有高度同源性，正常人、EB病毒相关疾病和自身免疫疾病均可产生抗EBNA-1 N端35-38抗体，但只有从SLE亲和纯化来的该抗体与SmD C端有相似的亲和力，也和SmD结合（免疫印迹法），即SLE有与自身抗原交叉反应的抗病毒抗体，其阳性率为38%；EBNA-2354GRGKGKSRDKQRK PGGPWRP373序列和核糖核蛋白SmD1 101GRGRGRGRGRGRGRGGPRR119具有高度同源性，EBNA-2病毒诱导的抗体可能与SmD1抗体发生交叉反应[17]。本研究也发现抗mDNA抗体与抗Sm抗体显著相关，是否提示以Raji细胞（EB病毒感染B细胞）为底物检测到的抗mDNA抗体所针对抗原的本质是EB病毒成分？这还有待于进一步研究。
综上所述，抗mDNA抗体对SLE的诊断具有高度敏感性和特异性，推广此项检测有助于提高临床医生诊断SLE的准确性，具有重要意义。进一步研究抗mDNA抗体所针对抗原的本质，可能会有助于揭示SLE发病机制，为诊断和治疗SLE提供更加可靠的科学依据。
