引用本文： 段瑞岐, 郄明蓉. p53基因突变与上皮性卵巢癌发病分型关系初探. 华西医学, 2016, 31(8): 1389-1393. doi: 10.7507/1002-0179.201600378 复制
卵巢癌是目前死亡率最高的女性生殖系统肿瘤[1]，其中上皮性卵巢癌（EOC）占卵巢癌发病的大多数，在所有卵巢癌中致死率最高[2]。EOC起病隐匿，难以早期发现[3]，大部分患者临床发现已属晚期，目前国际上虽采用了综合治疗的方案，但晚期患者长期生存率仍不容乐观[4]。EOC病因学复杂，目前具体发病机制尚不清楚[5-6]。近来有研究提出可将EOC分为Ⅰ、Ⅱ两种类型的“二元论”发病分型[6-9]，Ⅱ型EOC起病隐匿，恶性程度高，进展迅速，病死率高。p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，p53突变是EOC中常被描述的基因事件[5]，但目前关于p53基因在EOC发病中的具体作用仍有不同看法[10-12]。p53基因多数突变发生于保守区内的5-8外显子上，目前p53基因5-8外显子突变与EOC发病分型的相关性研究较少，本研究通过研究45例中国西部汉族人群原发EOC患者p53基因5-8外显子区域突变情况，分析p53基因突变与EOC发病分型间的相关性。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2011年8月－2012年12月在四川大学华西第二医院手术并病理确诊的四川省汉族原发性EOC患者45例，纳入标准为术前未接受物理或手术治疗，无全身或局部化学疗法（化疗）药物使用史者。病理诊断由医院妇科病理专家复核、确诊。具体病理诊断标准为卵巢上皮细胞增生活跃及核异型，核分裂象增加，上皮细胞层次增加，如无间质浸润，则为交界性卵巢癌（BOT）；如伴间质浸润，则为EOC。
卵巢癌的临床分期采用国际妇产科盟联2000年制定的标准，卵巢癌病理组织学分级根据世界卫生组织分级标准并参照细胞分化程度进行组织学分级。所选EOC患者依据Shih等[7]提出的“二元论”发病分型，EOC患者可分为Ⅰ型（29例）、Ⅱ型（16例）2组，Ⅰ型肿瘤中包括8例BOT及21例低度恶性EOC；Ⅱ型包括高度恶性浆液性腺癌14例，混合性上皮癌及未分化癌各1例。
1.2 方法
应用聚合酶链反应（PCR）、PCR产物纯化后DNA测序技术，分析45例原发性EOC患者p53基因第5、6、7、8外显子突变情况，并结合研究对象的临床病理参数进行统计分析。
1.2.1 样本DNA的提取
取抗凝静脉血200μL，使用离心柱型全血基因组DNA快速提取试剂盒（北京百泰克公司）提取外周血有核细胞基因组DNA，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。用紫外分光检测仪（美国Beckman公司）检测提取后的DNA的浓度和纯度，并记录结果，−20℃保存。
1.2.2 目标片段体外扩增及DNA测序
p53基因第5-8外显子区域共分成5-6、7、8外显子3个DNA片段，使用表 1中的引物对各片段进行PCR扩增，经36个循环的PCR扩增后，对PCR扩增产物进行DNA测序。测序前先用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。纯化后的PCR产物交由上海华津生物有限公司采用ABI 3730XL测序仪进行测序，具体操作严格按照Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ABI）试剂盒说明书进行。
表1
p53基因第5-8外显子PCR扩增引物
1.2.3 观察指标
在凝胶成像仪上观察PCR扩增产物电泳条带位置，若条带清晰均匀且无杂带，则表明该PCR扩增产物合格，并与核酸相对分子质量标准Marker比较扩增产物大小，判断PCR扩增产物片段大小是否与目标片段相符合。将PCR扩增产物测序结果与人p53标准序列进行人工比对，并结合美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站BLAST分析软件，来判定突变情况，并根据其是否突变分为p53突变型和p53野生型。每组p53突变率=突变例数/每组总例数。
1.3 统计学方法
运用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计学分析。计算各组患者样本基因突变频率及类型。计量资料采用均数±标准差表示，组间比较行成组设计两样本t检验；计数资料采用百分比表示，组间比较行χ2检验或Fisher确切概率法。检验水准α=0.05（双侧）。
2 结果
2.1 p53基因5-8外显子区域突变检测结果
分析45例EOC患者目标片段突变情况，共有9例患者在p53基因5-8外显子区域发生了基因突变，其余36例EOC患者在目标区域未检测到突变，突变患者检测结果见表 2，突变位点测序图见图 1。其中29号患者发生了2处突变，其他8例患者各有1处突变。从突变类型来看，点突变有8处，均为单碱基替换突变，G:C→A:T型置换最多，占1/2；C:G→A:T型占1/4；A:T→C:G型及C: G→G:C型各占1/8。插入突变有2处，且均为G插入突变。按突变影响分类，有7例错义突变，1例同义突变，2例插入突变。从突变区域来看，第5、6、7、8外显子突变各有5、2、1、2处，发生于第5外显子的突变明显高于其他外显子区域，但差异无统计学意义（P > 0.05）。
表2
突变病例p53基因5-8外显子的检测结果
图1
患者突变位点测序图可见突变位点（蓝箭）a. p53基因第5外显子175密码子突变（CGC→CAC）b. p53基因第6外显子223密码子突变（CCT→CAT）c. p53基因第6外显子224密码子突变（GAG→GAA）d. p53基因第7外显子230密码子突变（ACC→CCC）e. p53基因第8外显子264、265密码子突变（CTA→ATA，CTG→GTG）f. p53基因第5外显子138密码子插入突变（GCC→GGCC）g. p53基因第5外显子164密码子插入突变（AAG→AAGG）
分析Ⅰ、Ⅱ型患者中目标片段突变情况，发现Ⅰ型患者中p53基因突变仅1例（1/29）；而Ⅱ型患者p53基因突变8例（8/16），发生率明显高于Ⅰ型患者，差异有统计学意义（P < 0.05）。分析各型EOC患者p53基因突变，发现Ⅰ型患者中仅24号患者的p53基因目标区域发生了突变，为同义突变，发生于第6外显子，对应224位密码子，编码的氨基酸并未改变。而Ⅱ型突变患者中均为有效突变（6例错义突变、2例插入突变）。可见Ⅱ型患者p53基因突变频率和效率均明显高于Ⅰ型患者。同时发现在Ⅱ型患者中p53基因第5外显子突变率明显高于其他外显子，有3例患者在此区域检测出175密码子发生了错义突变。
2.2 EOC患者临床病理参数的比较
分析对比Ⅰ、Ⅱ型EOC患者临床病理情况，发现Ⅰ型患者中淋巴结转移1例（1/29）；而Ⅱ型患者中有7例（7/16），发生率明显高于Ⅰ型患者，二者差异有统计学意义（P < 0.05）。Ⅱ型患者中累及输卵管者有6例（6/16），组织学类型均为低分化浆液性腺癌；而Ⅰ型患者中累及输卵管仅有1例（1/29），发生率明显低于Ⅱ型患者，差异有统计学意义（P < 0.05）。Ⅰ型患者合并卵巢良性病变者有8例（8/29），而Ⅱ型患者中未发现有合并卵巢良性病变者，二者差异有统计学意义（P < 0.05）。Ⅱ型患者盆腹腔弥漫播散有8例（8/16），而Ⅰ型患者中仅发现有2例（2/29），二者差异有统计学意义（P < 0.05）。
在组织学分化差、淋巴结转移、输卵管受累、腹腔弥漫播散患者中p53突变率显著升高，差异有统计学意义（P < 0.01）。临床分期越晚、卵巢双侧受累及未合并良性病变患者中p53突变率也有升高趋势，但与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。EOC患者病理参数间p53基因突变情况分析，见表 3。
表3
p53基因突变与EOC各病理参数的关系
3 讨论
EOC患者中有9例在p53基因第5-8外显子区域发生基因突变。对比Ⅰ、Ⅱ类型患者p53基因突变情况，发现Ⅱ型EOC突变率显著高于Ⅰ型，提示p53突变在Ⅰ、Ⅱ型EOC分型中可能具有重要意义。有研究发现p53突变类型可影响p53抗体产生[13]，只有发生在基因中央部位的错义突变才可诱导抗体的产生，而后者与宿主免疫状态、恶性肿瘤发生等方面联系密切[14]。本研究对比两种类型EOC患者p53突变类型，发现只有Ⅱ型EOC在5-8外显子区域发生错义突变，而Ⅰ型患者中仅有1例同义突变。Ⅱ型EOC患者7处错义突变中有3处发生于第175密码子，而对应的3例患者均为高级别浆液性癌，推测175位密码子突变可能与Ⅱ型EOC，尤其是高级别浆液性癌发生可能关系密切。
本研究分析p53基因突变与EOC组织学分级、淋巴转移、卵巢受累、腹腔播散参数关系发现，在肿瘤恶性程度高，即组织学分化差、有淋巴结转移、弥漫腹腔播散、双侧卵巢受累的患者中p53基因突变率显著升高，而相应对照组突变率明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。同时结合Ⅰ、Ⅱ类型患者临床病理分析，Ⅱ型EOC患者临床病理与Ⅰ型明显不同，其恶性程度更高，进展更迅速。本研究结果支持将EOC“二元论”学说，并佐证了Ⅱ型EOC恶性程度更高，预后更差的观点。
关于Ⅰ、Ⅱ型EOC具体发病机制，有研究认为Ⅰ型肿瘤起源于卵巢生发上皮，有促进生长功能的激素可诱导皮质包涵囊肿上皮增生[15]，逐渐引发癌变。本研究对比了Ⅰ、Ⅱ型EOC患者合并良性病变（卵巢良性囊肿）情况，发现Ⅰ型患者中合并有良性病变率较高；而Ⅱ型患者未发现有此现象。因此，本研究结果支持Ⅰ型肿瘤由前体病变发展逐渐致癌的观点。Ⅱ型EOC的发病机制目前尚不清楚，有研究发现高级别浆液性癌来源于输卵管伞部[16-18]，p53突变可促使输卵管上皮细胞增生，促发前体病变[19]，致癌因子可促使其获得增生能力，发生输卵管上皮内癌。由于输卵管伞部在盆腔的位置特殊，在进展早期癌细胞即可脱落至卵巢表面或直接播散至盆腹腔。本研究对比了Ⅰ、Ⅱ型EOC患者切除的输卵管组织病理结果，发现6例Ⅱ型患者输卵管组织内发现有上皮癌灶，且组织学类型均为低分化浆液性腺癌，并伴有盆腹腔广泛播散。Ⅰ型肿瘤患者中仅1例累及输卵管，发生率明显低于Ⅱ型，因此本研究结果亦支持Ⅱ型肿瘤可能来源于输卵管的观点，起病隐匿，肿瘤侵犯卵巢时已为转移癌，故肿瘤迅速弥漫播散，预后极差。p53基因突变在Ⅱ型肿瘤发生中可能发挥至关重要作用[20]。
综上所述，本研究结果支持EOC分为Ⅰ、Ⅱ两型的构想，Ⅱ型EOC起病隐匿，恶性程度高，进展迅速，p53基因突变与EOC发病分型间可能有密切关系。p53基因突变在Ⅱ型EOC发生发展过程中可能发挥重要作用，其中175位密码子有可能是Ⅱ型EOC的突变热点。临床有望通过检测p53基因突变情况，对EOC高危人群进行筛查。对p53突变阳性的高危妇女，尽量完善输卵管镜检查；在妇科手术中可对患者输卵管伞部彻底详细检查，以期减少隐匿性癌的漏诊率，从而提高EOC的早期诊断率。
卵巢癌是目前死亡率最高的女性生殖系统肿瘤[1]，其中上皮性卵巢癌（EOC）占卵巢癌发病的大多数，在所有卵巢癌中致死率最高[2]。EOC起病隐匿，难以早期发现[3]，大部分患者临床发现已属晚期，目前国际上虽采用了综合治疗的方案，但晚期患者长期生存率仍不容乐观[4]。EOC病因学复杂，目前具体发病机制尚不清楚[5-6]。近来有研究提出可将EOC分为Ⅰ、Ⅱ两种类型的“二元论”发病分型[6-9]，Ⅱ型EOC起病隐匿，恶性程度高，进展迅速，病死率高。p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，p53突变是EOC中常被描述的基因事件[5]，但目前关于p53基因在EOC发病中的具体作用仍有不同看法[10-12]。p53基因多数突变发生于保守区内的5-8外显子上，目前p53基因5-8外显子突变与EOC发病分型的相关性研究较少，本研究通过研究45例中国西部汉族人群原发EOC患者p53基因5-8外显子区域突变情况，分析p53基因突变与EOC发病分型间的相关性。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2011年8月－2012年12月在四川大学华西第二医院手术并病理确诊的四川省汉族原发性EOC患者45例，纳入标准为术前未接受物理或手术治疗，无全身或局部化学疗法（化疗）药物使用史者。病理诊断由医院妇科病理专家复核、确诊。具体病理诊断标准为卵巢上皮细胞增生活跃及核异型，核分裂象增加，上皮细胞层次增加，如无间质浸润，则为交界性卵巢癌（BOT）；如伴间质浸润，则为EOC。
卵巢癌的临床分期采用国际妇产科盟联2000年制定的标准，卵巢癌病理组织学分级根据世界卫生组织分级标准并参照细胞分化程度进行组织学分级。所选EOC患者依据Shih等[7]提出的“二元论”发病分型，EOC患者可分为Ⅰ型（29例）、Ⅱ型（16例）2组，Ⅰ型肿瘤中包括8例BOT及21例低度恶性EOC；Ⅱ型包括高度恶性浆液性腺癌14例，混合性上皮癌及未分化癌各1例。
1.2 方法
应用聚合酶链反应（PCR）、PCR产物纯化后DNA测序技术，分析45例原发性EOC患者p53基因第5、6、7、8外显子突变情况，并结合研究对象的临床病理参数进行统计分析。
1.2.1 样本DNA的提取
取抗凝静脉血200μL，使用离心柱型全血基因组DNA快速提取试剂盒（北京百泰克公司）提取外周血有核细胞基因组DNA，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。用紫外分光检测仪（美国Beckman公司）检测提取后的DNA的浓度和纯度，并记录结果，−20℃保存。
1.2.2 目标片段体外扩增及DNA测序
p53基因第5-8外显子区域共分成5-6、7、8外显子3个DNA片段，使用表 1中的引物对各片段进行PCR扩增，经36个循环的PCR扩增后，对PCR扩增产物进行DNA测序。测序前先用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。纯化后的PCR产物交由上海华津生物有限公司采用ABI 3730XL测序仪进行测序，具体操作严格按照Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ABI）试剂盒说明书进行。
表1
p53基因第5-8外显子PCR扩增引物
1.2.3 观察指标
在凝胶成像仪上观察PCR扩增产物电泳条带位置，若条带清晰均匀且无杂带，则表明该PCR扩增产物合格，并与核酸相对分子质量标准Marker比较扩增产物大小，判断PCR扩增产物片段大小是否与目标片段相符合。将PCR扩增产物测序结果与人p53标准序列进行人工比对，并结合美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站BLAST分析软件，来判定突变情况，并根据其是否突变分为p53突变型和p53野生型。每组p53突变率=突变例数/每组总例数。
1.3 统计学方法
运用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计学分析。计算各组患者样本基因突变频率及类型。计量资料采用均数±标准差表示，组间比较行成组设计两样本t检验；计数资料采用百分比表示，组间比较行χ2检验或Fisher确切概率法。检验水准α=0.05（双侧）。
2 结果
2.1 p53基因5-8外显子区域突变检测结果
分析45例EOC患者目标片段突变情况，共有9例患者在p53基因5-8外显子区域发生了基因突变，其余36例EOC患者在目标区域未检测到突变，突变患者检测结果见表 2，突变位点测序图见图 1。其中29号患者发生了2处突变，其他8例患者各有1处突变。从突变类型来看，点突变有8处，均为单碱基替换突变，G:C→A:T型置换最多，占1/2；C:G→A:T型占1/4；A:T→C:G型及C: G→G:C型各占1/8。插入突变有2处，且均为G插入突变。按突变影响分类，有7例错义突变，1例同义突变，2例插入突变。从突变区域来看，第5、6、7、8外显子突变各有5、2、1、2处，发生于第5外显子的突变明显高于其他外显子区域，但差异无统计学意义（P > 0.05）。
表2
突变病例p53基因5-8外显子的检测结果
图1
患者突变位点测序图可见突变位点（蓝箭）a. p53基因第5外显子175密码子突变（CGC→CAC）b. p53基因第6外显子223密码子突变（CCT→CAT）c. p53基因第6外显子224密码子突变（GAG→GAA）d. p53基因第7外显子230密码子突变（ACC→CCC）e. p53基因第8外显子264、265密码子突变（CTA→ATA，CTG→GTG）f. p53基因第5外显子138密码子插入突变（GCC→GGCC）g. p53基因第5外显子164密码子插入突变（AAG→AAGG）
分析Ⅰ、Ⅱ型患者中目标片段突变情况，发现Ⅰ型患者中p53基因突变仅1例（1/29）；而Ⅱ型患者p53基因突变8例（8/16），发生率明显高于Ⅰ型患者，差异有统计学意义（P < 0.05）。分析各型EOC患者p53基因突变，发现Ⅰ型患者中仅24号患者的p53基因目标区域发生了突变，为同义突变，发生于第6外显子，对应224位密码子，编码的氨基酸并未改变。而Ⅱ型突变患者中均为有效突变（6例错义突变、2例插入突变）。可见Ⅱ型患者p53基因突变频率和效率均明显高于Ⅰ型患者。同时发现在Ⅱ型患者中p53基因第5外显子突变率明显高于其他外显子，有3例患者在此区域检测出175密码子发生了错义突变。
2.2 EOC患者临床病理参数的比较
分析对比Ⅰ、Ⅱ型EOC患者临床病理情况，发现Ⅰ型患者中淋巴结转移1例（1/29）；而Ⅱ型患者中有7例（7/16），发生率明显高于Ⅰ型患者，二者差异有统计学意义（P < 0.05）。Ⅱ型患者中累及输卵管者有6例（6/16），组织学类型均为低分化浆液性腺癌；而Ⅰ型患者中累及输卵管仅有1例（1/29），发生率明显低于Ⅱ型患者，差异有统计学意义（P < 0.05）。Ⅰ型患者合并卵巢良性病变者有8例（8/29），而Ⅱ型患者中未发现有合并卵巢良性病变者，二者差异有统计学意义（P < 0.05）。Ⅱ型患者盆腹腔弥漫播散有8例（8/16），而Ⅰ型患者中仅发现有2例（2/29），二者差异有统计学意义（P < 0.05）。
在组织学分化差、淋巴结转移、输卵管受累、腹腔弥漫播散患者中p53突变率显著升高，差异有统计学意义（P < 0.01）。临床分期越晚、卵巢双侧受累及未合并良性病变患者中p53突变率也有升高趋势，但与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。EOC患者病理参数间p53基因突变情况分析，见表 3。
表3
p53基因突变与EOC各病理参数的关系
3 讨论
EOC患者中有9例在p53基因第5-8外显子区域发生基因突变。对比Ⅰ、Ⅱ类型患者p53基因突变情况，发现Ⅱ型EOC突变率显著高于Ⅰ型，提示p53突变在Ⅰ、Ⅱ型EOC分型中可能具有重要意义。有研究发现p53突变类型可影响p53抗体产生[13]，只有发生在基因中央部位的错义突变才可诱导抗体的产生，而后者与宿主免疫状态、恶性肿瘤发生等方面联系密切[14]。本研究对比两种类型EOC患者p53突变类型，发现只有Ⅱ型EOC在5-8外显子区域发生错义突变，而Ⅰ型患者中仅有1例同义突变。Ⅱ型EOC患者7处错义突变中有3处发生于第175密码子，而对应的3例患者均为高级别浆液性癌，推测175位密码子突变可能与Ⅱ型EOC，尤其是高级别浆液性癌发生可能关系密切。
本研究分析p53基因突变与EOC组织学分级、淋巴转移、卵巢受累、腹腔播散参数关系发现，在肿瘤恶性程度高，即组织学分化差、有淋巴结转移、弥漫腹腔播散、双侧卵巢受累的患者中p53基因突变率显著升高，而相应对照组突变率明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。同时结合Ⅰ、Ⅱ类型患者临床病理分析，Ⅱ型EOC患者临床病理与Ⅰ型明显不同，其恶性程度更高，进展更迅速。本研究结果支持将EOC“二元论”学说，并佐证了Ⅱ型EOC恶性程度更高，预后更差的观点。
关于Ⅰ、Ⅱ型EOC具体发病机制，有研究认为Ⅰ型肿瘤起源于卵巢生发上皮，有促进生长功能的激素可诱导皮质包涵囊肿上皮增生[15]，逐渐引发癌变。本研究对比了Ⅰ、Ⅱ型EOC患者合并良性病变（卵巢良性囊肿）情况，发现Ⅰ型患者中合并有良性病变率较高；而Ⅱ型患者未发现有此现象。因此，本研究结果支持Ⅰ型肿瘤由前体病变发展逐渐致癌的观点。Ⅱ型EOC的发病机制目前尚不清楚，有研究发现高级别浆液性癌来源于输卵管伞部[16-18]，p53突变可促使输卵管上皮细胞增生，促发前体病变[19]，致癌因子可促使其获得增生能力，发生输卵管上皮内癌。由于输卵管伞部在盆腔的位置特殊，在进展早期癌细胞即可脱落至卵巢表面或直接播散至盆腹腔。本研究对比了Ⅰ、Ⅱ型EOC患者切除的输卵管组织病理结果，发现6例Ⅱ型患者输卵管组织内发现有上皮癌灶，且组织学类型均为低分化浆液性腺癌，并伴有盆腹腔广泛播散。Ⅰ型肿瘤患者中仅1例累及输卵管，发生率明显低于Ⅱ型，因此本研究结果亦支持Ⅱ型肿瘤可能来源于输卵管的观点，起病隐匿，肿瘤侵犯卵巢时已为转移癌，故肿瘤迅速弥漫播散，预后极差。p53基因突变在Ⅱ型肿瘤发生中可能发挥至关重要作用[20]。
综上所述，本研究结果支持EOC分为Ⅰ、Ⅱ两型的构想，Ⅱ型EOC起病隐匿，恶性程度高，进展迅速，p53基因突变与EOC发病分型间可能有密切关系。p53基因突变在Ⅱ型EOC发生发展过程中可能发挥重要作用，其中175位密码子有可能是Ⅱ型EOC的突变热点。临床有望通过检测p53基因突变情况，对EOC高危人群进行筛查。对p53突变阳性的高危妇女，尽量完善输卵管镜检查；在妇科手术中可对患者输卵管伞部彻底详细检查，以期减少隐匿性癌的漏诊率，从而提高EOC的早期诊断率。
