引用本文： 蒋莎莎, 谭春路, 张浩, 罗峰, 李可洲. 小鼠早期胚胎与肿瘤细胞共培养下的相互作用. 华西医学, 2016, 31(9): 1525-1529. doi: 10.7507/1002-0179.201600416 复制
19世纪20年代，法国生物学家Lobstein和Recamier提出肿瘤的胚胎性起源学说，认为肿瘤的发生是由于持续存在于成体内的胚胎细胞的增殖，该理论虽具局限性，但引导人们从发育生物学的全新角度去认识肿瘤的发生。近年来，众多研究表明早期胚胎细胞与肿瘤细胞的分化状态相似，肿瘤细胞有胚胎性基因的表达[1]，且肿瘤细胞生长与胚胎发育有不少相似的细胞信号调节因子及信号转导通路[2-3]；研究还发现，胚胎发育过程中的基因甲基化与去甲基化、侵袭行为及相关基因表达、细胞凋亡、免疫逃避及新生血管生成等方面均与肿瘤细胞的生物学行为具有相通性[4-7]。然而，虽然肿瘤细胞与早期胚胎细胞之间存在众多的生物学相似性，但肿瘤的生长不受机体的调控，威胁生命，而胚胎细胞可在机体多因素调控下有序增殖分化形成新的个体。另有研究表明，肿瘤细胞也可在胚胎微环境中实现“程序重排”，逆转恶性表型，并参与正常的生理过程[8-10]。
另外，胚胎与细胞的共培养是提高胚胎体外发育成功率和质量的一种可靠手段[11]。参与共培养的细胞主要有子宫内膜细胞、输卵管上皮细胞等生殖系统来源的细胞，旨在模拟胚胎发育的体内环境，而肿瘤细胞也是一种共培养的选择，虽然肿瘤细胞多经丝裂霉素或放射线处理失活后作为胚胎发育的饲养层细胞，但仍可促进胚胎的发育[12]。
基于胚胎细胞与肿瘤细胞的相似性及胚胎体外培养的必要性，本研究采用了未经任何处理的非生殖系统来源的肿瘤细胞与小鼠早期胚胎体外共培养，旨在观测共同微环境中两者生物学行为的变化及相互作用，以此进一步认识胚胎-肿瘤的关联性，也期望为胚胎体外培养和肿瘤研究提供新的思路与方法。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
246只无特定病原体级昆明种小鼠[生产许可证号：scxk（川）2009-09；使用许可证号：syxk（川）2009-045，购于四川大学实验动物中心]，雄性46只，8 ～ 10周龄；雌性200只，6 ～ 8周龄。小鼠结肠癌细胞株C26及小鼠胚胎成纤维细胞株NIH3T3购自美国模式菌种收集中心，于本实验室传代、保种。
1.2 实验方法
1.2.1 小鼠胚胎2-细胞胚胎的获取
参照文献[13]的实验方法获取1.5 dpc （days postcoitum），小鼠2-细胞胚胎：在雌鼠腹腔注射10 U孕马血清促性腺激素，48 h后再次注射10 U人绒毛膜促性腺激素，4 h后随机将雌雄小鼠按1∶1合笼；在1.5 dpc时脊椎脱臼法处死雌鼠，无菌条件下，近输卵管端截掉子宫，转移至无菌细胞培养皿中，杜氏磷酸盐缓冲溶液（D-PBS）冲出2-细胞胚胎，于显微镜下挑选发育良好的胚胎用于共培养。
1.2.2 实验分组
A组：C26细胞与小鼠2-细胞胚胎共培养；B组：NIH3T3细胞与小鼠2-细胞胚胎共培养，作为阳性对照；C组：单纯培养小鼠2-细胞胚胎，作为阴性对照；D组：单纯培养C26细胞。
1.2.3 检测方法
噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖力：消化细胞收集于离心管中，用改良Eagle培养基（DMEM）制成单细胞悬液5 mL；96孔板中每孔加入150 μL培养基及50 μL的已制备的单细胞悬液，混匀，放入孵箱中孵育3 h；96孔板中每孔加入20 μL MTT液，37℃孵育4 h；小心吸弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，震荡30 min，于酶标仪490 nm波长处测吸光度（A）值。
① 流式细胞术检测细胞凋亡率：消化细胞并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，制备单细胞悬液于200 μL的PBS液中，上流式细胞仪检测C26细胞凋亡率。
② 碘化丙啶（PI）染色：A组共培养3 d后，囊胚已充分扩展，吸弃培养基，用生理盐水洗涤2遍后，加入1 ～ 2滴PI染料，在荧光显微镜下进行观察 细胞。
③ 细胞爬片免疫组织化学染色：A组共培养3 d后，吸弃培养基，用生理盐水洗涤2遍后，用4%多聚甲醛固定15 ～ 20 min，吸弃多聚甲醛，再用生理盐水洗涤2遍，准备行免疫组织化学染色，包括增殖细胞核抗原（PCNA）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（BCL-2）。
1.3 观察指标
1.3.1 共培养对小鼠2-细胞胚胎发育的影响
观察在体外单一环境下，以及与其他细胞共培养后小鼠2-细胞胚胎的发育状况，包括胚胎体外发育各阶段的完整性，以及4-细胞胚胎、桑葚胚、囊胚的形成率，分别于共培养24、48、72 h观察计数。
1.3.2 共培养下肿瘤细胞生物学行为的观测
与 D组比较，A组24、48、72 h后细胞增殖、凋亡情况的变化。
1.3.3 共培养微环境下扩展囊胚与肿瘤细胞的关系
共培养微环境下，随着囊胚滋养层细胞的生长扩展，会推挤开周围肿瘤细胞，形成“无瘤圈”，观察囊胚滋养层细胞与周围肿瘤细胞交界处细胞凋亡情况及抗原PCNA、BCL-2的表达情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS 10.0软件进行统计分析。胚胎形成率、凋亡率组间比较采用χ2检验；增殖A值采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 共培养对小鼠2-细胞胚胎发育的影响
2.1.1 小鼠2-细胞胚胎体外发育状况
获取的1.5 dpc小鼠胚胎已发育至2-细胞胚胎（图 1），A、B、C组胚胎在体外均继续卵裂，依次发育为4-细胞胚胎（图 2）、8-细胞胚胎（图 3）、桑葚胚、囊胚，囊胚期开始出现内细胞团和滋养外胚层的分化，形成囊胚腔（图 4）。随后，囊胚孵化脱去透明带，这是囊胚黏附的必要准备（图 5）。脱去透明带的囊胚开始变大，黏附培养皿，与铺底的细胞开始接触。贴壁后囊胚滋养层细胞开始扩展，可“侵袭”周围肿瘤细胞区域，抢占肿瘤细胞生长空间，并形成类似青霉菌抑菌圈样的无肿瘤细胞生长空白带，而被囊胚滋养层细胞推开的肿瘤细胞呈圆形或椭圆形堆积在其周围，形成隆起的细胞带，而其他部位的肿瘤细胞增殖分裂旺盛（图 6）。
图1
1.5 dpc小鼠胚胎2-细胞阶段倒置相差显微镜像（×200） 可见胚胎由2个细胞组成，在细胞外围见一圈清晰的透明带（黑箭）。胚胎透光度好，折光性好，细胞饱满，胚胎发育良好 2.1.2 共培养后4-细胞、桑葚胚及囊胚形成率
A、B、C组共收集2-细胞胚胎309枚，A组各发育阶段胚胎形成率均最高，与B、C组形成率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
表1
共培养后4-细胞胚胎、桑葚胚及囊胚的形成率
2.2 共培养微环境中肿瘤细胞生物学行为
2.2.1 共培养对肿瘤细胞增殖活力的影响
共培养后，A、D组各检测点细胞增殖A值差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
A、D组C26细胞增殖A值（2.2.2 共培养对肿瘤细胞凋亡的影响
随着共培养时间推移肿瘤细胞凋亡增加，A、D两组比较，各时间点细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 3。
表3
A、D组C26细胞凋亡率（2.3 共培养时囊胚扩张及对肿瘤细胞的影响
囊胚孵化脱带后开始变大（图 5），黏附生长，且滋养层细胞开始扩展，“侵袭”周围肿瘤细胞并使之隆起堆积，形成“无瘤区”（图 6）；PI染色显示，胚胎胞核及肿瘤胞核均显示红色荧光，其中内细胞团红色荧光亮度较强，滋养层巨细胞荧光亮度较弱，堆积的肿瘤细胞荧光较强，生长紧密（图 7a、7b）。免疫组织化学结果显示，“无瘤圈”周围肿瘤细胞PCNA（图 8a、8b）及BCL-2（图 8c、8d）的表达与其他区域比较未见差异。
图7
小鼠胚胎与肿瘤细胞共培养阶段倒置荧光显微镜像 可见与胚胎交界处肿瘤细胞密集，荧光亮度较其他区域肿瘤细胞明显增强 7a. 白箭示“无瘤圈”（PI染色×100） 7b. 白箭示“无瘤圈”周围荧光亮度增强的肿瘤细胞（PI染色×200） 3 讨论
20世纪70年代，有学者提出“肿瘤是一个发育生物学问题”的理论[14]。因此，从发育生物学角度看，肿瘤细胞是未分化或分化异常的细胞，是内外调节因素紊乱导致细胞分化信息程序发生错误编码表达的结果。有研究表明，具有恶性突变基因的肿瘤细胞在胚胎组织中却表现出正常分化程序的恢复[15-16]，提示在胚胎的微环境中可能存在调控肿瘤细胞向正常细胞分化的因素，而这种调控作用在早期的2-细胞胚胎环境中尤为显著，另外具有全能性的早期2-细胞胚胎还是小鼠胚胎发育中十分关键的阶段之一。但在体外培养条件下，氧自由基损伤、培养液成分不平衡等外界因素都可能导致合子基因无法激活启动，引起2-细胞阻滞，从而不能完成达到囊胚的后续发育。因此，小鼠2-细胞胚胎体外培养是一个难点。鉴于此，建立胚胎与肿瘤细胞的体外共培养模型将为解决胚胎体外培养难题及研究两者的相互关系提供新的思路和方法。
本研究中选择了2-细胞胚胎作为研究起点，同时采用非生殖系统来源且未经任何处理的鼠源性肿瘤细胞与小鼠胚胎共培养，在同一体系中探讨二者的相互影响。研究发现胚胎的发育未受到周围肿瘤细胞的阻碍，无发育阻滞现象，且与对照组相比胚胎的发育时程加快，4-细胞胚胎、桑葚胚、囊胚形成率均有提高（P＜0.05）。因此，共培养环境显示了早期生命现象的高适应性，即发育过程由胚胎型的转录产物控制，肿瘤环境并没有对卵裂形成干扰信号；另外，肿瘤细胞旺盛的分裂增殖消耗氧、减少活性氧对胚胎的损害及大量胚胎发育所必需的细胞因子、生长因子的分泌[17]，都可能是胚胎体外发育良好的原因。本研究还发现，共培养时肿瘤细胞生长良好，与对照组相比，各检测点细胞的增殖和凋亡均无明显变化。这可能是由共培养体系是以肿瘤性环境为主所造成的，致使数量较少的胚胎难以对肿瘤细胞产生影响。
共培养实验中，胚胎滋养层细胞可“侵袭”肿瘤细胞的生存空间，形成“无瘤圈”。其可能提示滋养层细胞的侵袭性强于肿瘤细胞，且这与以往研究中滋养层细胞存在大量表达的侵袭转移相关基因及基质金属蛋白酶的报道结果[18-20]相符，但体外共培养的“侵袭”现象是否表示胚胎滋养层细胞与肿瘤细胞之间也存在类似于母胎之间的对话？为此，我们通过PI染色来观察这一特殊现象，结果发现，“无瘤圈”周围的肿瘤细胞荧光亮度较其他区域明显增强，细胞生长紧密，堆积隆起；而为验证胚胎是否影响周围肿瘤细胞的凋亡或增殖，我们还进行了细胞增殖相关的PCNA及凋亡相关的BCL-2的免疫组织化学实验，结果发现周围肿瘤细胞PCNA及BCL-2的表达量较其他区域未见明显差异。可见“无瘤圈”的形成并非是胚胎与接触的肿瘤细胞之间发生了信息交流而诱导肿瘤细胞凋亡所引起的，也表明了“无瘤圈”周围的肿瘤细胞隆起只是简单的堆积而并非增殖所致，造成这种现象的原因可能是由于滋养层细胞的运动作用致使黏附性较低的肿瘤细胞从培养板上推起的结果，当然，这也离不开滋养层细胞分泌的基质金属蛋白酶的水解作用，其可将肿瘤细胞的黏附性伪足从培养板上消化下来，形成细胞界限。
综上所述，肿瘤细胞可能是一种很好的可提高胚胎培养成功率的体外胚胎培养介质。当然，离开正常母体内环境的调控，胚胎在体外的生物学行为是否发生变化及与肿瘤细胞相互作用的具体途径及机制还有待进一步的研究。
19世纪20年代，法国生物学家Lobstein和Recamier提出肿瘤的胚胎性起源学说，认为肿瘤的发生是由于持续存在于成体内的胚胎细胞的增殖，该理论虽具局限性，但引导人们从发育生物学的全新角度去认识肿瘤的发生。近年来，众多研究表明早期胚胎细胞与肿瘤细胞的分化状态相似，肿瘤细胞有胚胎性基因的表达[1]，且肿瘤细胞生长与胚胎发育有不少相似的细胞信号调节因子及信号转导通路[2-3]；研究还发现，胚胎发育过程中的基因甲基化与去甲基化、侵袭行为及相关基因表达、细胞凋亡、免疫逃避及新生血管生成等方面均与肿瘤细胞的生物学行为具有相通性[4-7]。然而，虽然肿瘤细胞与早期胚胎细胞之间存在众多的生物学相似性，但肿瘤的生长不受机体的调控，威胁生命，而胚胎细胞可在机体多因素调控下有序增殖分化形成新的个体。另有研究表明，肿瘤细胞也可在胚胎微环境中实现“程序重排”，逆转恶性表型，并参与正常的生理过程[8-10]。
另外，胚胎与细胞的共培养是提高胚胎体外发育成功率和质量的一种可靠手段[11]。参与共培养的细胞主要有子宫内膜细胞、输卵管上皮细胞等生殖系统来源的细胞，旨在模拟胚胎发育的体内环境，而肿瘤细胞也是一种共培养的选择，虽然肿瘤细胞多经丝裂霉素或放射线处理失活后作为胚胎发育的饲养层细胞，但仍可促进胚胎的发育[12]。
基于胚胎细胞与肿瘤细胞的相似性及胚胎体外培养的必要性，本研究采用了未经任何处理的非生殖系统来源的肿瘤细胞与小鼠早期胚胎体外共培养，旨在观测共同微环境中两者生物学行为的变化及相互作用，以此进一步认识胚胎-肿瘤的关联性，也期望为胚胎体外培养和肿瘤研究提供新的思路与方法。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
246只无特定病原体级昆明种小鼠[生产许可证号：scxk（川）2009-09；使用许可证号：syxk（川）2009-045，购于四川大学实验动物中心]，雄性46只，8 ～ 10周龄；雌性200只，6 ～ 8周龄。小鼠结肠癌细胞株C26及小鼠胚胎成纤维细胞株NIH3T3购自美国模式菌种收集中心，于本实验室传代、保种。
1.2 实验方法
1.2.1 小鼠胚胎2-细胞胚胎的获取
参照文献[13]的实验方法获取1.5 dpc （days postcoitum），小鼠2-细胞胚胎：在雌鼠腹腔注射10 U孕马血清促性腺激素，48 h后再次注射10 U人绒毛膜促性腺激素，4 h后随机将雌雄小鼠按1∶1合笼；在1.5 dpc时脊椎脱臼法处死雌鼠，无菌条件下，近输卵管端截掉子宫，转移至无菌细胞培养皿中，杜氏磷酸盐缓冲溶液（D-PBS）冲出2-细胞胚胎，于显微镜下挑选发育良好的胚胎用于共培养。
1.2.2 实验分组
A组：C26细胞与小鼠2-细胞胚胎共培养；B组：NIH3T3细胞与小鼠2-细胞胚胎共培养，作为阳性对照；C组：单纯培养小鼠2-细胞胚胎，作为阴性对照；D组：单纯培养C26细胞。
1.2.3 检测方法
噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖力：消化细胞收集于离心管中，用改良Eagle培养基（DMEM）制成单细胞悬液5 mL；96孔板中每孔加入150 μL培养基及50 μL的已制备的单细胞悬液，混匀，放入孵箱中孵育3 h；96孔板中每孔加入20 μL MTT液，37℃孵育4 h；小心吸弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，震荡30 min，于酶标仪490 nm波长处测吸光度（A）值。
① 流式细胞术检测细胞凋亡率：消化细胞并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，制备单细胞悬液于200 μL的PBS液中，上流式细胞仪检测C26细胞凋亡率。
② 碘化丙啶（PI）染色：A组共培养3 d后，囊胚已充分扩展，吸弃培养基，用生理盐水洗涤2遍后，加入1 ～ 2滴PI染料，在荧光显微镜下进行观察 细胞。
③ 细胞爬片免疫组织化学染色：A组共培养3 d后，吸弃培养基，用生理盐水洗涤2遍后，用4%多聚甲醛固定15 ～ 20 min，吸弃多聚甲醛，再用生理盐水洗涤2遍，准备行免疫组织化学染色，包括增殖细胞核抗原（PCNA）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（BCL-2）。
1.3 观察指标
1.3.1 共培养对小鼠2-细胞胚胎发育的影响
观察在体外单一环境下，以及与其他细胞共培养后小鼠2-细胞胚胎的发育状况，包括胚胎体外发育各阶段的完整性，以及4-细胞胚胎、桑葚胚、囊胚的形成率，分别于共培养24、48、72 h观察计数。
1.3.2 共培养下肿瘤细胞生物学行为的观测
与 D组比较，A组24、48、72 h后细胞增殖、凋亡情况的变化。
1.3.3 共培养微环境下扩展囊胚与肿瘤细胞的关系
共培养微环境下，随着囊胚滋养层细胞的生长扩展，会推挤开周围肿瘤细胞，形成“无瘤圈”，观察囊胚滋养层细胞与周围肿瘤细胞交界处细胞凋亡情况及抗原PCNA、BCL-2的表达情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS 10.0软件进行统计分析。胚胎形成率、凋亡率组间比较采用χ2检验；增殖A值采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 共培养对小鼠2-细胞胚胎发育的影响
2.1.1 小鼠2-细胞胚胎体外发育状况
获取的1.5 dpc小鼠胚胎已发育至2-细胞胚胎（图 1），A、B、C组胚胎在体外均继续卵裂，依次发育为4-细胞胚胎（图 2）、8-细胞胚胎（图 3）、桑葚胚、囊胚，囊胚期开始出现内细胞团和滋养外胚层的分化，形成囊胚腔（图 4）。随后，囊胚孵化脱去透明带，这是囊胚黏附的必要准备（图 5）。脱去透明带的囊胚开始变大，黏附培养皿，与铺底的细胞开始接触。贴壁后囊胚滋养层细胞开始扩展，可“侵袭”周围肿瘤细胞区域，抢占肿瘤细胞生长空间，并形成类似青霉菌抑菌圈样的无肿瘤细胞生长空白带，而被囊胚滋养层细胞推开的肿瘤细胞呈圆形或椭圆形堆积在其周围，形成隆起的细胞带，而其他部位的肿瘤细胞增殖分裂旺盛（图 6）。
图1
1.5 dpc小鼠胚胎2-细胞阶段倒置相差显微镜像（×200） 可见胚胎由2个细胞组成，在细胞外围见一圈清晰的透明带（黑箭）。胚胎透光度好，折光性好，细胞饱满，胚胎发育良好 2.1.2 共培养后4-细胞、桑葚胚及囊胚形成率
A、B、C组共收集2-细胞胚胎309枚，A组各发育阶段胚胎形成率均最高，与B、C组形成率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
表1
共培养后4-细胞胚胎、桑葚胚及囊胚的形成率
2.2 共培养微环境中肿瘤细胞生物学行为
2.2.1 共培养对肿瘤细胞增殖活力的影响
共培养后，A、D组各检测点细胞增殖A值差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
A、D组C26细胞增殖A值（2.2.2 共培养对肿瘤细胞凋亡的影响
随着共培养时间推移肿瘤细胞凋亡增加，A、D两组比较，各时间点细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 3。
表3
A、D组C26细胞凋亡率（2.3 共培养时囊胚扩张及对肿瘤细胞的影响
囊胚孵化脱带后开始变大（图 5），黏附生长，且滋养层细胞开始扩展，“侵袭”周围肿瘤细胞并使之隆起堆积，形成“无瘤区”（图 6）；PI染色显示，胚胎胞核及肿瘤胞核均显示红色荧光，其中内细胞团红色荧光亮度较强，滋养层巨细胞荧光亮度较弱，堆积的肿瘤细胞荧光较强，生长紧密（图 7a、7b）。免疫组织化学结果显示，“无瘤圈”周围肿瘤细胞PCNA（图 8a、8b）及BCL-2（图 8c、8d）的表达与其他区域比较未见差异。
图7
小鼠胚胎与肿瘤细胞共培养阶段倒置荧光显微镜像 可见与胚胎交界处肿瘤细胞密集，荧光亮度较其他区域肿瘤细胞明显增强 7a. 白箭示“无瘤圈”（PI染色×100） 7b. 白箭示“无瘤圈”周围荧光亮度增强的肿瘤细胞（PI染色×200） 3 讨论
20世纪70年代，有学者提出“肿瘤是一个发育生物学问题”的理论[14]。因此，从发育生物学角度看，肿瘤细胞是未分化或分化异常的细胞，是内外调节因素紊乱导致细胞分化信息程序发生错误编码表达的结果。有研究表明，具有恶性突变基因的肿瘤细胞在胚胎组织中却表现出正常分化程序的恢复[15-16]，提示在胚胎的微环境中可能存在调控肿瘤细胞向正常细胞分化的因素，而这种调控作用在早期的2-细胞胚胎环境中尤为显著，另外具有全能性的早期2-细胞胚胎还是小鼠胚胎发育中十分关键的阶段之一。但在体外培养条件下，氧自由基损伤、培养液成分不平衡等外界因素都可能导致合子基因无法激活启动，引起2-细胞阻滞，从而不能完成达到囊胚的后续发育。因此，小鼠2-细胞胚胎体外培养是一个难点。鉴于此，建立胚胎与肿瘤细胞的体外共培养模型将为解决胚胎体外培养难题及研究两者的相互关系提供新的思路和方法。
本研究中选择了2-细胞胚胎作为研究起点，同时采用非生殖系统来源且未经任何处理的鼠源性肿瘤细胞与小鼠胚胎共培养，在同一体系中探讨二者的相互影响。研究发现胚胎的发育未受到周围肿瘤细胞的阻碍，无发育阻滞现象，且与对照组相比胚胎的发育时程加快，4-细胞胚胎、桑葚胚、囊胚形成率均有提高（P＜0.05）。因此，共培养环境显示了早期生命现象的高适应性，即发育过程由胚胎型的转录产物控制，肿瘤环境并没有对卵裂形成干扰信号；另外，肿瘤细胞旺盛的分裂增殖消耗氧、减少活性氧对胚胎的损害及大量胚胎发育所必需的细胞因子、生长因子的分泌[17]，都可能是胚胎体外发育良好的原因。本研究还发现，共培养时肿瘤细胞生长良好，与对照组相比，各检测点细胞的增殖和凋亡均无明显变化。这可能是由共培养体系是以肿瘤性环境为主所造成的，致使数量较少的胚胎难以对肿瘤细胞产生影响。
共培养实验中，胚胎滋养层细胞可“侵袭”肿瘤细胞的生存空间，形成“无瘤圈”。其可能提示滋养层细胞的侵袭性强于肿瘤细胞，且这与以往研究中滋养层细胞存在大量表达的侵袭转移相关基因及基质金属蛋白酶的报道结果[18-20]相符，但体外共培养的“侵袭”现象是否表示胚胎滋养层细胞与肿瘤细胞之间也存在类似于母胎之间的对话？为此，我们通过PI染色来观察这一特殊现象，结果发现，“无瘤圈”周围的肿瘤细胞荧光亮度较其他区域明显增强，细胞生长紧密，堆积隆起；而为验证胚胎是否影响周围肿瘤细胞的凋亡或增殖，我们还进行了细胞增殖相关的PCNA及凋亡相关的BCL-2的免疫组织化学实验，结果发现周围肿瘤细胞PCNA及BCL-2的表达量较其他区域未见明显差异。可见“无瘤圈”的形成并非是胚胎与接触的肿瘤细胞之间发生了信息交流而诱导肿瘤细胞凋亡所引起的，也表明了“无瘤圈”周围的肿瘤细胞隆起只是简单的堆积而并非增殖所致，造成这种现象的原因可能是由于滋养层细胞的运动作用致使黏附性较低的肿瘤细胞从培养板上推起的结果，当然，这也离不开滋养层细胞分泌的基质金属蛋白酶的水解作用，其可将肿瘤细胞的黏附性伪足从培养板上消化下来，形成细胞界限。
综上所述，肿瘤细胞可能是一种很好的可提高胚胎培养成功率的体外胚胎培养介质。当然，离开正常母体内环境的调控，胚胎在体外的生物学行为是否发生变化及与肿瘤细胞相互作用的具体途径及机制还有待进一步的研究。
