引用本文： 舒玲, 邓劲, 吴思颖, 康梅. 替加环素体外抗菌活性检测方法的分析评价. 华西医学, 2016, 31(10): 1697-1700. doi: 10.7507/1002-0179.201600467 复制
近年来多重耐药菌已经逐渐成为医院感染的重要病原菌，此类细菌引起的感染常呈现出复杂性、难治性等特点，目前已经成为严重危及医疗安全和患者生命的危险因素之一[1-3]。替加环素作为新一代超广谱抗生素，于2005年6月得到美国食品和药物管理局（FDA）批准用于治疗成人复杂的腹腔内感染和皮肤及软组织感染，是第一个被批准应用于临床的甘氨酰环素类抗菌药物，于2012年在中国上市。目前，美国临床和实验室标准化协会（CLSI）还未推荐适合临床实验室常规使用的检测替加环素敏感性的方法。国内临床微生物实验室细菌耐药性分析多采用纸片扩散（KB）法及全自动药物敏感（药敏）仪。因此，我们同时采用KB法、Vitek 2法和最小抑菌浓度（MIC）检测试纸条（MTS）检测鲍曼不动杆菌及肠杆菌科菌对替加环素的敏感性，用MTS法做标准评价KB法、Vitek 2法的一致率及可靠性。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2014年1月－2015年3月从四川大学华西医院140例住院患者的不同标本中分离的140株临床常见多重耐药病原菌，其中非发酵菌鲍曼不动杆菌（亚胺培南与美罗培南均耐药）119株及肠杆菌科21株（肺炎克雷伯菌10株，阴沟肠杆菌6株，费劳地枸橼酸杆菌2株，黏质沙雷菌1株，产碱菌1株，产气肠杆菌1株）。由于铜绿假单胞菌对替加环素天然耐药，故本次试验未选择铜绿假单胞菌。其中痰标本90例，分泌物15例，尿标本8例，血液标本12例，其他部位标本15例。质量控制（质控）菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
1.2 仪器与试剂
Vitek 2 Compact全自动鉴定仪及配套GN鉴定卡、AST-GN16药敏卡（法国生物梅里埃公司）。替加环素纸片（15 µg/片，英国Oxoid公司）；替加环素MTS（0.016～256 µg/mL，意大利Liofilchem公司）。药敏试验培养基为水解酪蛋白（Mueller-Hinton琼脂，法国生物梅里埃公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 KB法
按照美国CLSI推荐的操作[4]进行。取0.5麦氏浊度单位的菌液涂布于M-H平板上，室温放置15 min，待表面干后，将纸片贴在琼脂表面。35℃培养16～18 h，测量出完整抑菌圈直径。
1.3.2 Vitek 2法
用Vitek 2 Compact全自动鉴定仪及配套GN鉴定卡、AST-GN16药敏卡进行药敏试验，具体操作参照说明书，仪器自动给出MIC值。
1.3.3 MTS法
培养基、接种物制备、接种和培养条件同KB法，将MTS试条标有刻度的一面向上贴于琼脂表面。读取结果时，在80%抑菌圈处读取MIC值，通过肉眼观察，判断明显的抑菌点，而忽略可能蔓延到终点的菌斑或细小的微菌落。
1.4 判读标准
目前美国CLSI尚无替加环素的药敏结果判读标准，替加环素的折点参照美国FDA的标准及文献[5]判读结果。对于鲍曼不动杆菌，MIC≤2 µg/mL为敏感，3～7 µg/mL为中介，≥8 µg/mL为耐药；抑菌圈直径≥16 mm为敏感，13～15 mm为中介，≤12 mm为耐药。对于肠杆菌科，MIC≤2 µg/mL为敏感，3～7 µg/mL为中介，≥8 µg/mL为耐药；抑菌圈直径≥19 mm为敏感，15～18 mm为中介，≤14 mm为耐药。以MTS法为参考标准，分析KB法和Vitek 2法与MTS法测试结果的一致率。MTS法药敏结果为耐药，而KB法为敏感，则判为极重要误差。MTS法药敏结果为敏感，而KB法为耐药，则判为重要误差。MTS法药敏结果为耐药或敏感，而KB法为中介；或者MTS法药敏结果为中介，而KB法为耐药或敏感，则为次要误差。
1.5 统计学方法
采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计数资料采用百分比表示，组间比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 3种方法检测的药敏结果比较
替加环素对鲍曼不动杆菌和肠杆菌科均有较好的抗菌活性，抑制50%受试菌所需MIC（MIC50）均在敏感范围内（0.5～2.0 µg/mL），MIC90范围为1～4 µg/mL。对于鲍曼不动杆菌，MTS法检测敏感率高于KB法和Vitek 2法，差异无统计学意义（P > 0.05）；中介率低于KB法和Vitek 2法，差异有统计学意义（P < 0.05）；耐药率MTS法和Vitek 2法均高于KB法，差异无统计学意义（P > 0.05）。对于肠杆菌科，MTS法和Vitek 2法检测敏感率均高于KB法，差异无统计学意义（P > 0.05）；3种方法检测的中介率相同；MTS法和Vitek 2法未发现耐药菌株，KB法发现1株耐药菌。见表 1。
表1
3种方法检测鲍曼不动杆菌和肠杆菌科对替加环素的药敏结果[株（%）]
2.2 KB法与Vitek 2法检测结果比较
Vitek 2法检测鲍曼不动杆菌结果的一致率低于KB法，差异无统计学意义（P > 0.05）；Vitek 2法检测肠杆菌科的一致率高于KB法，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
表2
KB法和Vitek 2法结果与MTS法结果的一致性比较[株（%）]
3 讨论
随着抗菌药物广泛及不规范使用，临床抗菌药物的耐药状况日趋严峻，尤其是碳青霉烯类耐药革兰阴性杆菌对目前临床上用于治疗革兰阴性杆菌最强效的抗菌药物——碳青霉烯类抗生素不敏感，导致临床在治疗此类细菌感染中举步艰难。多重耐药菌导致的医院内感染已成为延长患者住院时间、增加医疗费用和导致患者死亡的重要原因之一[6]。合理选择抗菌药物对于避免出现治疗失败至关重要。替加环素作为一种半合成的四环素类药物，第一个被批准应用于临床的甘氨酰环素类抗菌药物，对其他的体外检测方法及判定结果是非常重要的。准确的药敏结果是临床使用抗菌药物的重要依据。美国FDA和欧洲药敏试验委员会（EUCAST）分别制定了替加环素药敏结果的判读标准和操作指南。研究表明，FDA判定折点优于EUCAST折点[7-10]。美国CLSI尚未公布替加环素药敏方案和判读标准。根据王辉等[5]制定的替加环素体外药敏试验操作规程，替加环素体外药敏试验可采用包括琼脂扩散法、稀释法、自动化仪器法和E-test，但是不同方法及不同琼脂介质之间的药敏结果存在差别[11-15]。其中以MTS法与微量肉汤稀释法的相关性最好[16]，但是由于微量肉汤稀释法需要采用新鲜配置的MH肉汤作为药敏用培养基，且不适用于厌氧菌MIC的检测。而MTS法与E-test试验原理相同，在Tejero等[17]对38株鲍曼不动杆菌研究发现，MTS法的检测结果比E-test更接近微量肉汤稀释法。但是MTS法检测价格较贵，不适于临床常规细菌耐药分析，从而KB法成为了目前临床使用最广泛的药敏方法之一，操作简单且成本较低，但易受多种因素的影响，如接种菌量、预温育时间、抗生素含量及扩散能力、琼脂厚度等。Hope等[18]用KB法检测150株临床常见细菌对替加环素的敏感性时发现，4%的菌株对替加环素耐药；而用琼脂稀释法检测发现，耐药菌株均对替加环素敏感。因此KB法可能高估替加环素的中介率和耐药率。本研究结果表明，KB法检测鲍曼不动杆菌对替加环素的敏感率为88.2%，与MTS法的符合率为94.1%，未发现重要误差及极重要误差。而KB法检测鲍曼不动杆菌对替加环素的中介率为5.9%，明显高于MTS法，次要误差率为6.9%。因此，对于KB法检测为中介的菌株应通过定量试验再次检测其药敏结果。
同时由于替加环素理化性质活泼，容易受到外界因素的影响，导致该药物的体外药物敏感性检测存在较多的难点和操作误区，在临床实验室检测不易标准化，因此在进行替加环素体外抗菌活性检测时需注意替加环素纸片的保存，无论采用何种方法，只有当质控菌株对替加环素的药敏结果在可接受的质控范围时，待测菌株的结果才真实、有效。
由于本研究中的菌株数量及种类有限，因此对替加环素体外药敏试验方法还需进行更大样本量的评估。
近年来多重耐药菌已经逐渐成为医院感染的重要病原菌，此类细菌引起的感染常呈现出复杂性、难治性等特点，目前已经成为严重危及医疗安全和患者生命的危险因素之一[1-3]。替加环素作为新一代超广谱抗生素，于2005年6月得到美国食品和药物管理局（FDA）批准用于治疗成人复杂的腹腔内感染和皮肤及软组织感染，是第一个被批准应用于临床的甘氨酰环素类抗菌药物，于2012年在中国上市。目前，美国临床和实验室标准化协会（CLSI）还未推荐适合临床实验室常规使用的检测替加环素敏感性的方法。国内临床微生物实验室细菌耐药性分析多采用纸片扩散（KB）法及全自动药物敏感（药敏）仪。因此，我们同时采用KB法、Vitek 2法和最小抑菌浓度（MIC）检测试纸条（MTS）检测鲍曼不动杆菌及肠杆菌科菌对替加环素的敏感性，用MTS法做标准评价KB法、Vitek 2法的一致率及可靠性。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2014年1月－2015年3月从四川大学华西医院140例住院患者的不同标本中分离的140株临床常见多重耐药病原菌，其中非发酵菌鲍曼不动杆菌（亚胺培南与美罗培南均耐药）119株及肠杆菌科21株（肺炎克雷伯菌10株，阴沟肠杆菌6株，费劳地枸橼酸杆菌2株，黏质沙雷菌1株，产碱菌1株，产气肠杆菌1株）。由于铜绿假单胞菌对替加环素天然耐药，故本次试验未选择铜绿假单胞菌。其中痰标本90例，分泌物15例，尿标本8例，血液标本12例，其他部位标本15例。质量控制（质控）菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
1.2 仪器与试剂
Vitek 2 Compact全自动鉴定仪及配套GN鉴定卡、AST-GN16药敏卡（法国生物梅里埃公司）。替加环素纸片（15 µg/片，英国Oxoid公司）；替加环素MTS（0.016～256 µg/mL，意大利Liofilchem公司）。药敏试验培养基为水解酪蛋白（Mueller-Hinton琼脂，法国生物梅里埃公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 KB法
按照美国CLSI推荐的操作[4]进行。取0.5麦氏浊度单位的菌液涂布于M-H平板上，室温放置15 min，待表面干后，将纸片贴在琼脂表面。35℃培养16～18 h，测量出完整抑菌圈直径。
1.3.2 Vitek 2法
用Vitek 2 Compact全自动鉴定仪及配套GN鉴定卡、AST-GN16药敏卡进行药敏试验，具体操作参照说明书，仪器自动给出MIC值。
1.3.3 MTS法
培养基、接种物制备、接种和培养条件同KB法，将MTS试条标有刻度的一面向上贴于琼脂表面。读取结果时，在80%抑菌圈处读取MIC值，通过肉眼观察，判断明显的抑菌点，而忽略可能蔓延到终点的菌斑或细小的微菌落。
1.4 判读标准
目前美国CLSI尚无替加环素的药敏结果判读标准，替加环素的折点参照美国FDA的标准及文献[5]判读结果。对于鲍曼不动杆菌，MIC≤2 µg/mL为敏感，3～7 µg/mL为中介，≥8 µg/mL为耐药；抑菌圈直径≥16 mm为敏感，13～15 mm为中介，≤12 mm为耐药。对于肠杆菌科，MIC≤2 µg/mL为敏感，3～7 µg/mL为中介，≥8 µg/mL为耐药；抑菌圈直径≥19 mm为敏感，15～18 mm为中介，≤14 mm为耐药。以MTS法为参考标准，分析KB法和Vitek 2法与MTS法测试结果的一致率。MTS法药敏结果为耐药，而KB法为敏感，则判为极重要误差。MTS法药敏结果为敏感，而KB法为耐药，则判为重要误差。MTS法药敏结果为耐药或敏感，而KB法为中介；或者MTS法药敏结果为中介，而KB法为耐药或敏感，则为次要误差。
1.5 统计学方法
采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计数资料采用百分比表示，组间比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 3种方法检测的药敏结果比较
替加环素对鲍曼不动杆菌和肠杆菌科均有较好的抗菌活性，抑制50%受试菌所需MIC（MIC50）均在敏感范围内（0.5～2.0 µg/mL），MIC90范围为1～4 µg/mL。对于鲍曼不动杆菌，MTS法检测敏感率高于KB法和Vitek 2法，差异无统计学意义（P > 0.05）；中介率低于KB法和Vitek 2法，差异有统计学意义（P < 0.05）；耐药率MTS法和Vitek 2法均高于KB法，差异无统计学意义（P > 0.05）。对于肠杆菌科，MTS法和Vitek 2法检测敏感率均高于KB法，差异无统计学意义（P > 0.05）；3种方法检测的中介率相同；MTS法和Vitek 2法未发现耐药菌株，KB法发现1株耐药菌。见表 1。
表1
3种方法检测鲍曼不动杆菌和肠杆菌科对替加环素的药敏结果[株（%）]
2.2 KB法与Vitek 2法检测结果比较
Vitek 2法检测鲍曼不动杆菌结果的一致率低于KB法，差异无统计学意义（P > 0.05）；Vitek 2法检测肠杆菌科的一致率高于KB法，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
表2
KB法和Vitek 2法结果与MTS法结果的一致性比较[株（%）]
3 讨论
随着抗菌药物广泛及不规范使用，临床抗菌药物的耐药状况日趋严峻，尤其是碳青霉烯类耐药革兰阴性杆菌对目前临床上用于治疗革兰阴性杆菌最强效的抗菌药物——碳青霉烯类抗生素不敏感，导致临床在治疗此类细菌感染中举步艰难。多重耐药菌导致的医院内感染已成为延长患者住院时间、增加医疗费用和导致患者死亡的重要原因之一[6]。合理选择抗菌药物对于避免出现治疗失败至关重要。替加环素作为一种半合成的四环素类药物，第一个被批准应用于临床的甘氨酰环素类抗菌药物，对其他的体外检测方法及判定结果是非常重要的。准确的药敏结果是临床使用抗菌药物的重要依据。美国FDA和欧洲药敏试验委员会（EUCAST）分别制定了替加环素药敏结果的判读标准和操作指南。研究表明，FDA判定折点优于EUCAST折点[7-10]。美国CLSI尚未公布替加环素药敏方案和判读标准。根据王辉等[5]制定的替加环素体外药敏试验操作规程，替加环素体外药敏试验可采用包括琼脂扩散法、稀释法、自动化仪器法和E-test，但是不同方法及不同琼脂介质之间的药敏结果存在差别[11-15]。其中以MTS法与微量肉汤稀释法的相关性最好[16]，但是由于微量肉汤稀释法需要采用新鲜配置的MH肉汤作为药敏用培养基，且不适用于厌氧菌MIC的检测。而MTS法与E-test试验原理相同，在Tejero等[17]对38株鲍曼不动杆菌研究发现，MTS法的检测结果比E-test更接近微量肉汤稀释法。但是MTS法检测价格较贵，不适于临床常规细菌耐药分析，从而KB法成为了目前临床使用最广泛的药敏方法之一，操作简单且成本较低，但易受多种因素的影响，如接种菌量、预温育时间、抗生素含量及扩散能力、琼脂厚度等。Hope等[18]用KB法检测150株临床常见细菌对替加环素的敏感性时发现，4%的菌株对替加环素耐药；而用琼脂稀释法检测发现，耐药菌株均对替加环素敏感。因此KB法可能高估替加环素的中介率和耐药率。本研究结果表明，KB法检测鲍曼不动杆菌对替加环素的敏感率为88.2%，与MTS法的符合率为94.1%，未发现重要误差及极重要误差。而KB法检测鲍曼不动杆菌对替加环素的中介率为5.9%，明显高于MTS法，次要误差率为6.9%。因此，对于KB法检测为中介的菌株应通过定量试验再次检测其药敏结果。
同时由于替加环素理化性质活泼，容易受到外界因素的影响，导致该药物的体外药物敏感性检测存在较多的难点和操作误区，在临床实验室检测不易标准化，因此在进行替加环素体外抗菌活性检测时需注意替加环素纸片的保存，无论采用何种方法，只有当质控菌株对替加环素的药敏结果在可接受的质控范围时，待测菌株的结果才真实、有效。
由于本研究中的菌株数量及种类有限，因此对替加环素体外药敏试验方法还需进行更大样本量的评估。
